喬新宇，易三軍，趙煒疆

(1.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心,廣東 汕頭 515041)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤[1]。雖然目前已有手術(shù)切除、放化療及神經(jīng)導(dǎo)航等治療手段，但因膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖迅速、多呈浸潤性生長、腫瘤組織有較高的侵襲能力，且與正常組織界限不清，膠質(zhì)瘤的治療效果仍不理想[2]。闡明神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病和調(diào)控機(jī)制，尋找潛在的可延緩膠質(zhì)瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的藥物已刻不容緩。

細(xì)胞因子在腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤中的調(diào)節(jié)作用研究比較廣泛。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin，NRG)是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的多肽類神經(jīng)生長因子，屬于類表皮生長因子(epidermal growth factor-like，EGF-like)超家族。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白主要有1-4四種亞型，即NRG1、NRG2、NRG3和NRG4，因通過不同實驗分離、純化和克隆，故有不同命名。NRG受體為ErbB酪氨酸激酶型受體，主要包括ErbB4 /ErbB4同二聚體、ErbB3 /ErbB2和ErbB4 /ErbB2異二聚體。NRG可直接與ErbB3或ErbB4結(jié)合，誘導(dǎo)ErbB3或ErbB4與ErbB2形成異二聚體，活化受體酪氨酸激酶，進(jìn)而激活多種下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控組織細(xì)胞的增殖和分化[3]。NRG1表達(dá)與神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(guān)，且在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤如膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活、遷移中發(fā)揮作用[4]，故我們推測NRG其他亞型NRG3、NRG4也可能在膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移中發(fā)揮作用，但迄今為止有關(guān)NRG3和NRG4的在膠質(zhì)瘤病理生理中的作用研究較少。本研究比較分析NRG1、NRG3和NRG4對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響，并通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析來明確可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞和試劑 U251和U-87MG細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；SHG44細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；RPMI 1640細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；0.25% 胰蛋白酶-EDTA購自北京索萊寶公司；青霉素-鏈霉素混合液購自北京索萊寶公司；人源重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β(recombinant human neuregulin 1β，rNRG1β)購自美國Thermo Scientific公司；人源重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3β(recombinant human neuregulin 3β，rNRG3β)和人源重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4β(recombinant human neuregulin 4β，rNRG4β)均購自北京義翹神州公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自北京中杉金橋公司；乙醇購自汕頭西隴化工股份有限公司。

1.1.2儀器 高壓滅菌鍋(SX-500，日本Tomy公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERA cell 240，德國Thermo-Scientific公司)；超凈工作臺(KSP Class II，德國Thermo-Scientific公司)；臺式高速離心機(jī)(Allergra X-22R，美國Beckman Coulter公司)；電子天平(BSA223S-CW，北京賽多利斯公司)；PH儀雷磁(PHS-3E，上海精科公司)；倒置相差顯微鏡(BX51，日本奧林巴斯公司)；臺式冷凍離心機(jī)(5415R，德國Eppendorf公司)；電子恒溫水浴鍋(HH-11-12，汕頭市醫(yī)用設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SHG44和U251細(xì)胞培養(yǎng)于胎牛血清 ∶培養(yǎng)基=10 ∶100 DMEM培養(yǎng)基中；U-87MG細(xì)胞培養(yǎng)于胎牛血清 ∶培養(yǎng)基=10 ∶100 RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃。

1.2.2細(xì)胞劃痕實驗 培養(yǎng)人U-87MG、U251和SHG44細(xì)胞至其密度接近90%后，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液消化處理，待顯微鏡下細(xì)胞明顯皺縮時加入含血清培養(yǎng)液終止消化并吹打細(xì)胞使之形成均勻懸液，以900 r·min-1離心3 min。棄去上層液體后加新鮮無血清培養(yǎng)基重懸制備成細(xì)胞懸浮液，并用血球計數(shù)板計數(shù)。細(xì)胞懸浮液以無血清培養(yǎng)基稀釋。于96孔板中每孔加液100 μL，過夜培養(yǎng)。用無RNA 酶槍頭尖沿直尺在培養(yǎng)板細(xì)胞中央進(jìn)行細(xì)胞劃痕。使用無血清培養(yǎng)基清洗后，分別加入含有0、2、5和10 nmol·L-1重組NRG蛋白(rNRG1β、-3β和-4β)的無血清培養(yǎng)基100 μL，每個處理組設(shè)置3次重復(fù)孔。處理完成后在倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照觀察保存，此時記為0 h。根據(jù)不同細(xì)胞系的生長速度不同，在0-48 h選擇相應(yīng)時間點(diǎn)進(jìn)行觀察。U-87MG細(xì)胞的觀察時間點(diǎn)為0、6、12和24 h；U251細(xì)胞的觀察時間點(diǎn)為0、12、24和48 h；SHG44細(xì)胞的觀察時間點(diǎn)為0、24和48 h。

1.2.3愈合率計算 愈合率/%=(初始劃痕面積-最終劃痕面積)/初始劃痕面積 × 100%。

1.2.4GEPIA數(shù)據(jù)庫分析 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析低級別膠質(zhì)瘤(low-grade glioma，LGG)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)樣本中NRG1、NRG3和NRG4及其受體ErbB2、ErbB3、ErbB4表達(dá)水平，結(jié)果繪制箱型圖。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)分析 使用ImageJ軟件分析劃痕愈合率，使用GraphPad prism 9.0軟件處理與統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，并進(jìn)行繪圖。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組比較用Tukey檢驗。

2 結(jié)果

2.1 rNRG1β對不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響rNRG1β對U-87MG、U251細(xì)胞和SHG44細(xì)胞的遷移率的影響在各時間點(diǎn)均呈現(xiàn)劑量依賴性(Fig1)。

Fig 1 Effect of rNRG1β on migration of different glioma cells Optical microscope image of wound closure after cell scratch in response to rNRG1β treatment in U-87 MG (A),U251 (B),and SHG44 (C)cells (magnification ×100).*P<0.05,**P<0.01 vs control group

U-87MG劃傷后給予rNRG1β處理6 h，與溶劑對照組相比，僅有10 nmol·L-1組的劃痕間距明顯減小(P<0.01)，劃痕愈合速度約為20%；處理12 h時間點(diǎn)，與溶劑對照組相比，各組遷移率均明顯增加，呈劑量依賴性，以10 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著(P<0.01)。24 h時間點(diǎn)，各組均可見細(xì)胞劃痕消失，愈合完成，表明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤來源的U-87MG細(xì)胞有較強(qiáng)遷移能力。

U251劃傷后給予rNRG1β處理12 h，與溶劑對照組相比，實驗組的劃痕間距均顯著性減小(各劑量組P<0.01)，遷移速度呈劑量依賴性；處理24 h時間點(diǎn)，與溶劑對照組相比，各組遷移率均顯著增加，呈劑量依賴性，以10 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著，且2 nmol·L-1組和5 nmol·L-1組的遷移率相近(各劑量組P<0.01)。處理48 h時間點(diǎn)，趨勢與處理24 h的趨勢相似，10 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著(各劑量組P<0.01)。

SHG44劃傷后給予rNRG1β處理24 h，與溶劑對照組相比，5 nmol·L-1和10 nmol·L-1組的劃痕間距均顯著性減小(P<0.05)，可見遷移速度呈劑量依賴性；處理48 h時間點(diǎn)，與溶劑對照組相比，各組遷移率呈劑量依賴性，以10 nmol·L-1組遷移率最高(各劑量組P<0.01)。

2.2 rNRG3β對不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響rNRG3β對U-87MG細(xì)胞遷移率未見影響(Fig2A)，對SHG44細(xì)胞、U251細(xì)胞遷移率的影響在各時間點(diǎn)均呈現(xiàn)劑量依賴性(Fig2B，C)。

U-87MG劃傷后給予rNRG3β處理6 h和12 h，未見實驗組與對照組間呈顯著性差異；處理24 h時間點(diǎn)，各組均可見細(xì)胞劃痕消失，愈合完成，表明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤來源的U-87MG細(xì)胞遷移能力較強(qiáng)。

U-251劃傷后給予rNRG3β處理12 h，未見實驗組與對照組間呈顯著性差異。處理24 h和48時間點(diǎn)，與溶劑對照組相比，各組遷移率均顯著增加(各劑量組P<0.01)，呈劑量依賴性，以5 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著，10 nmol·L-1組遷移率較5 nmol·L-1組減小(各時間點(diǎn)P<0.01)。

SHG44劃傷后給予rNRG3β處理24 h，未見實驗組與對照組間呈顯著性差異；處理48 h時間點(diǎn)，與溶劑對照組相比，各組遷移率呈劑量依賴性，以10 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著(P<0.01)。

2.3 rNRG4β對不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響rNRG4β對U-87MG、U251細(xì)胞和SHG44細(xì)胞的遷移率的影響在各時間點(diǎn)均呈現(xiàn)劑量依賴性(Fig3)。

Fig 2 Effect of rNRG3β on migration of different glioma cellsOptical microscope image of wound closure after cell scratch in response to rNRG3β treatment in U-87 MG (A),U251 (B),and SHG44 (C)cells (magnification ×100).*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 3 Effect of rNRG4β on migration of different glioma cells Optical microscope image of wound closure after cell scratch in response to rNRG4β treatment in U-87 MG (A),U251 (B),and SHG44 (C)cells (magnification × 100).*P<0.05,**P<0.01 vs control group

U-87MG劃傷后給予rNRG4β處理6 h，未見實驗組與對照組間呈顯著性差異；處理12 h時間點(diǎn)，5 nmol·L-1組具有顯著的促進(jìn)遷移率增加作用，而10 nmol·L-1則起抑制作用(與對照組相比，兩組均為P<0.01)。處理24 h時間點(diǎn)，各組均可見細(xì)胞劃痕消失，愈合完成，表明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤來源的U-87MG細(xì)胞遷移能力較強(qiáng)。

U-251劃傷后給予rNRG4β處理12 h，僅見10 nmol·L-1組與對照組間呈顯著性差異(P<0.01)。處理24 h時間點(diǎn)，僅見5 nmol·L-1組和10 nmol·L-1組與對照組間呈差異顯著性(兩組P<0.01)，處理48 h時間點(diǎn)，與溶劑對照組相比，各組遷移率均明顯增加，呈劑量依賴性，以5 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著(P<0.01)，10 nmol·L-1組遷移率較5 nmol·L-1組減小。

SHG44劃傷后給予rNRG4β處理24 h，未見實驗組與對照組間呈差異顯著性；處理48 h時間點(diǎn)，與溶劑對照組相比，各組遷移率呈劑量依賴性，5 nmol·L-1組和10 nmol·L-1組遷移率增加明顯(兩組P<0.01)。

2.4 低級別膠質(zhì)瘤(low-grade glioma，LGG)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)樣本的NRG1、NRG3和NRG4及其受體ErbB2、ErbB3、ErbB4表達(dá)情況GEPIA數(shù)據(jù)庫分析表明，在LGG樣本中，NRG1、NRG3和NRG4表達(dá)水平均低于正常對照組，僅NRG1和NRG4表達(dá)差異較為明顯(P<0.05)；ErbB2、ErbB3、ErbB4表達(dá)水平均高于正常對照組。在GBM樣本中，NRG1、NRG4以及受體ErbB3、ErbB4表達(dá)水平均低于正常對照組，NRG1、NRG3和NRG4表達(dá)差異較為明顯(P<0.05)，但ErbB2表達(dá)水平高于正常對照組,差異有明顯性(P<0.05)(Fig4)。

3 討論

膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞多具有較強(qiáng)侵襲性和遷移性，是手術(shù)難以徹底根除的主要原因[5]。以往研究表明，NRG1可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動性和遷移性[6]。本實驗進(jìn)一步證實rNRG1β可增強(qiáng)不同惡性程度膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移率，且其促進(jìn)作用在濃度0至10 nmol·L-1之間呈劑量依賴性。我們在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測了NRG家族其他兩個重要亞型NRG3和NRG4對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明rNRG3β和rNRG4β對U-87MG細(xì)胞遷移無明顯影響，僅在高劑量時對U251細(xì)胞和SHG44細(xì)胞的遷移有一定促進(jìn)作用。以上結(jié)果結(jié)合GEPIA數(shù)據(jù)分析結(jié)果，提示不同惡性程度的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在NRG亞型及其受體的表達(dá)水平和分布上存在一定程度差異。

NRG1所結(jié)合的受體類型具有多樣性，已有文獻(xiàn)報道U-87MG可表達(dá)少量的ErbB2受體，U251細(xì)胞可表達(dá)ErbB2和ErbB3受體[7]。游離型NRG1首先與ErbB3和ErbB4受體結(jié)合，從而進(jìn)一步激活其與ErbB2受體形成的異二聚體ErbB3/ErbB2、ErbB4/ErbB2，或同二聚體ErbB4/ErbB4[8]。與NRG1相比，NRG3僅結(jié)合并激活ErbB4受體[9]，NRG4僅對ErbB4受體有低親和力，不與ErbB2和ErbB3受體結(jié)合[10]。由GEPIA結(jié)果可知，LGG和GBM中ErbB2表達(dá)均高于正常對照組，故rNRG1β的促遷移效果相對明顯。ErbB2水平增高可增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對NRG1敏感性，尤其是癌旁神經(jīng)組織表達(dá)有更高水平NRG1，可進(jìn)一步促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞向正常組織遷移[11]。LGG中ErbB4表達(dá)水平有升高趨勢，GBM中表達(dá)則呈下降趨勢，可部分解釋rNRG3β和rNRG4β對U251細(xì)胞和SHG44細(xì)胞遷移有促進(jìn)作用，而對U-87 MG細(xì)胞遷移影響不明顯。因此，可進(jìn)一步探究三種不同惡性程度的膠質(zhì)瘤細(xì)胞NRG各亞型和受體以及NRG/ErbB信號通路下游信號分子的表達(dá)差異，從而進(jìn)一步明確其對不同惡性程度膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的差異化影響。

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析表明，正常腦組織中NRG1,NRG3和NRG4表達(dá)水平均高于膠質(zhì)瘤組織，提示癌旁腦組織神經(jīng)元可釋放多種NRG亞型，以彌散或血流運(yùn)輸方式進(jìn)入腫瘤實質(zhì)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活和遷移，進(jìn)而侵襲周圍健康腦組織[12]。已報道NRG可與ErbB4 /ErbB4、ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4受體結(jié)合，激活MAPK以及PI3K/Akt途徑，參與細(xì)胞增殖和遷移調(diào)控[13]。ErbB受體抑制劑可以拮抗該作用，抑制腫瘤細(xì)胞遷移。已有臨床研究證實，ErbB3單克隆抗體GSK2849330可通過抑制ErbB3/ErbB2信號通路治療肺部浸潤性黏液腺癌，具有一定的實用價值[14]。新近研究發(fā)現(xiàn)，ErbB2受體拮抗劑阿法替尼可通過抑制NRG3/ErbB4信號通路，抑制犬膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[15]。因此，NRG作為細(xì)胞外基質(zhì)的成分影響腫瘤細(xì)胞的遷移[16]，其受體ErbB2、ErbB3和ErbB4有望成為膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)(Fig5)。

Fig 4 GEPIA-based analysis of gene expression level of NRG1,NRG3,and NRG4,and ErbB2,ErbB3 and ErbB4 in low-grade glioma (LGG)and glioblastoma multiforme (GBM)tissue samples in comparison to those in normal control*P<0.05 vs control group

Fig 5 Neuron-derived NRGs on glioma cell migration and mechanisms underlying therapeutic effects of ErbB receptor antagonists

此外，我們以往研究表明NRG1可誘導(dǎo)多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中細(xì)胞黏附分子CHL1蛋白表達(dá)水平增加[17]，而CHL1在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和遷移[18]，而NRG3、4是否具有相似作用尚需進(jìn)一步探究。