潘 慧，鄭曉月，王 珊，陳 茗，毛擁軍

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東 青島 266000)

衰老引起的器官功能退行性改變是誘發(fā)各種年齡相關(guān)性疾病的主要危險(xiǎn)因素。盡管衰老過程本身不會(huì)導(dǎo)致腎臟疾病，但結(jié)合年齡相關(guān)危險(xiǎn)因素的累積影響，最終會(huì)引發(fā)腎臟的諸多病理改變。腎臟衰老是機(jī)體衰老的一部分，主要表現(xiàn)為功能性腎單位數(shù)量逐漸減少，腎小球萎縮、囊腔擴(kuò)張，腎小管水腫、空泡化，腎間質(zhì)纖維化[1-2]，導(dǎo)致腎臟對(duì)應(yīng)激損傷更加敏感，進(jìn)而使老年人腎功能障礙的發(fā)病率和死亡率明顯增加。因此，積極尋找抗衰老的天然化合物并探討其延緩腎臟衰老的機(jī)制有重要意義。

自噬是大多數(shù)真核細(xì)胞降解受損或變性大分子物質(zhì)的質(zhì)量控制機(jī)制[3]。衰老可引起腎臟自噬功能紊亂，腎臟組織中自噬活性降低，可導(dǎo)致腎小球硬化、足細(xì)胞缺失，而上調(diào)自噬水平可減少足細(xì)胞和腎小管細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞再生，這對(duì)維持衰老腎臟組織穩(wěn)態(tài)和緩解衰老相關(guān)損傷至關(guān)重要[4]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)控自噬的重要信號(hào)分子[5]。Liu等[6]研究表明，金絲桃苷可通過調(diào)控AMPK-ULK1信號(hào)介導(dǎo)的自噬減弱D-半乳糖(D-gal)誘導(dǎo)的腎臟老化和損傷。Yamamoto等[7]關(guān)于近端腎小管特異性自噬缺陷小鼠的研究表明，腎臟衰老損傷的發(fā)病機(jī)制與以微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)和程序性死亡受體1(Beclin1)的變化為特征的自噬功能障礙相關(guān)。因此，上調(diào)自噬水平被認(rèn)為是治療年齡相關(guān)性腎損傷的一種有益策略。

褐藻膠是從海洋褐藻中提取的天然海藻多糖，褐藻膠寡糖(AOS)是由海藻酸鹽解聚而形成的一種酸性多糖，具有水溶性、無毒、無免疫原性等多種獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。研究表明，AOS具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性，已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域[8]。本課題組前期研究顯示，AOS可以延緩D-gal誘導(dǎo)的C57BL/6j小鼠白內(nèi)障進(jìn)程[9]，緩解野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓[10]。然而，AOS在腎臟衰老過程中的作用研究甚少。基于既往研究及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題組推測(cè)AOS可能通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路上調(diào)自噬水平延緩腎臟衰老。本研究旨在探討AOS對(duì)D-gal誘導(dǎo)的小鼠腎臟衰老的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性C57BL/6j小鼠，6-8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，飼養(yǎng)在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(50±10)%、明暗周期12 h ∶12 h。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有小鼠均可自由獲得標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。本研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均獲得青島大學(xué)動(dòng)物福利和倫理管理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：QYFYWZLL25840)。

1.1.2主要藥物及試劑 D-gal(貨號(hào)：G0750)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；AOS購(gòu)于青島博智匯力生物技術(shù)有限公司。SQSTM1/p62(貨號(hào)：23214)、Beclin1(貨號(hào)：3495)、LC3-Ⅰ/Ⅱ(貨號(hào)：12741)、AMPK(貨號(hào)：2532)及p-AMPK(貨號(hào)：2535)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；p16(貨號(hào)：ab232402)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；mTOR(貨號(hào)：66888-1-Ig)、p-mTOR(貨號(hào)：67778-1-Ig)抗體購(gòu)于武漢Proteintech公司；GAPDH(貨號(hào)：ENM0215)、山羊抗兔(貨號(hào)：E-AB-1003)和山羊抗鼠(貨號(hào)：E-AB-1001)二抗購(gòu)于武漢Elabscience公司。尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)試劑盒購(gòu)于南京建成生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京索萊寶公司。除另有說明外，所有其他試劑均購(gòu)自標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)供應(yīng)商。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組(Control)、模型組(D-gal)、AOS治療組(D-gal + AOS)，每組10只。D-gal組和D-gal + AOS組小鼠通過頸背部皮下注射D-gal(200 mg·kg-1·d-1)8周建立腎臟衰老模型，Control組小鼠同步注射等體積無菌生理鹽水；從D-gal注射的第5周開始，D-gal + AOS組小鼠予以AOS(200 mg·kg-1·d-1)灌胃4周[11]，Control和D-gal組小鼠同步予以等體積滅菌蒸餾水。

1.2.2腎功能測(cè)定 藥物處理結(jié)束后，通過眼眶靜脈收集血樣，4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min后，收集血漿于-80 ℃保存。采用試劑盒嚴(yán)格按照說明書操作，分別檢測(cè)小鼠BUN和SCr水平。

1.2.3組織學(xué)檢查 小鼠采血后麻醉并處死，迅速分離腎臟組織，大量生理鹽水沖洗后，置于4%多聚甲醛中固定24 h，制成石蠟切片用于HE染色及Masson染色，顯微鏡下觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)改變和纖維化程度。

1.2.4Western blot 取新鮮腎臟組織稱重，并加入適量含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制的RIPA裂解液，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min后收集上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白于適宜濃度的凝膠上電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，隨后用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，TBST洗膜后，分別加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜后TBST洗膜，隨后加入相應(yīng)二抗在室溫下孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光，凝膠成像系統(tǒng)成像后采用Quantity One軟件分析條帶灰度值。將GAPDH蛋白表達(dá)作為內(nèi)參照。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 取新鮮腎臟組織稱重，并加入適量TRIzol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度。采用Roche逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)說明書操作合成cDNA。Klotho引物序列：F:5′-TGGGTCACTGGGTCAATCTCTGG-3′，R:5′-GCCTTTCAGCCGCCCTAAAC-3′；GAPDH引物序列：F:5′-CCTTCCGTGTCCCCACT-3′，R:5′-GCCTGCTTCACCACCTC-3′。根據(jù)qRT-PCR說明書在95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40次循環(huán)的條件下擴(kuò)增cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，記錄PCR儀上的擴(kuò)增曲線顯示的Ct值，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用比較2-△△Ct法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 AOS對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠腎功能的影響結(jié)果如Fig1所示，D-gal組小鼠BUN和SCr水平明顯高于Control組，AOS處理4周后，其水平恢復(fù)至低于D-gal組，提示AOS可以減輕D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠的腎功能損害(P<0.05，P<0.01)。

2.2 AOS改善D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠的腎臟組織病理改變HE染色和Masson染色結(jié)果如Fig2所示，與Control組相比，注射D-gal 8周后，小鼠腎臟中功能腎小球數(shù)量明顯減少，腎小球嚢腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞水腫、變性，空泡形成；腎間質(zhì)可見明顯藍(lán)染膠原纖維，這些病理變化在AOS處理4周后明顯緩解(P<0.01)。結(jié)果表明AOS可以改善D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠腎臟病理損傷，并緩解其纖維化程度。

2.3 AOS對(duì)D-gal誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織中衰老相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，衰老相關(guān)蛋白p16在D-gal組表達(dá)明顯增加，與D-gal組相比，AOS處理促進(jìn)了p16蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)(Fig3)。

2.4 AOS上調(diào)了D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠腎臟組織中Klotho的基因表達(dá)為探討AOS是否調(diào)控Klotho在腎臟中的表達(dá)，采用qRT-PCR檢測(cè)Klotho基因表達(dá)水平。結(jié)果如Fig4所示，與Control組相比，D-gal組小鼠腎臟組織中Klotho表達(dá)明顯降低，而AOS給藥4周后，Klotho表達(dá)明顯增加(P<0.01)。我們的結(jié)果表明Klotho基因可能參與了AOS改善D-gal誘導(dǎo)的腎臟衰老過程。

2.5 AOS上調(diào)了D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠腎臟的自噬水平如Fig5中結(jié)果顯示，與Control組相比，D-gal組小鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)明顯下降，p62表達(dá)增加，AOS處理明顯上調(diào)了LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表達(dá)，下調(diào)了p62的表達(dá)(P<0.01)。

2.6 AOS激活了D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠腎臟中AMPK/mTOR信號(hào)通路為了進(jìn)一步探討AOS是否通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路上調(diào)自噬水平，進(jìn)而延緩D-gal誘導(dǎo)的小鼠腎臟衰老，我們采用Western blot方法檢測(cè)各組腎臟組織中AMPK/mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與Control組相比，D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠腎臟組織中p-AMPK表達(dá)降低，p-mTOR表達(dá)增加；與D-gal組相比，AOS處理后p-AMPK表達(dá)增加，而p-mTOR表達(dá)明顯降低(P<0.01)(Fig6)。

Fig 1 Kidney function improved by AOS in D-gal-induced aging mice n=10)A：The level of BUN;B：The level of SCr.**P<0.01 vs control group;#P<0.05 ,##P<0.01 vs D-gal group.

Fig 2 Kidney histological alterations prevented by AOS in D-gal-induced aging mice n=10)A：Morphological changes were assessed by HE staining (×400);B：The degree of kidney fibrosis was investigated by Masson trichrome staining (×400);C：The corresponding quantitative data of (B).**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs D-gal group.

Fig 3 Expression of aging markers down-regulated by AOS in D-gal-induced aging mice n=10)A：The protein expression of p16 was measured by Western blot;B：The corresponding quantitative data of (A).**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs D-gal group.

Fig 4 Expression of Klotho gene up-regulated by AOS in D-gal-induced aging mice n=10)The expression of the antiaging gene Klotho was measured by RT-qPCR.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs D-gal group.

Fig 5 The autophagy level up-regulated by AOS in D-gal-induced aging mice n=10)(A,C)The protein expression of LC3-Ⅱ/Ⅰ,Beclin1 and p62 was determined by Western blot.(B,D)The corresponding quantitative data of (A ,C).**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs D-gal group.

Fig 6 AMPK/mTOR signaling pathway activated by AOS in kidney of D-gal-induced aging mice n=10)A：The protein expression of AMPK,p-AMPK,mTOR and p-mTOR was determined by Western blot;B：The corresponding quantitative data of (A).**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs D-gal group.

3 討論

隨著老齡人口的持續(xù)增長(zhǎng)，年齡相關(guān)性腎臟疾病的發(fā)病率和死亡率不斷增加[12]，因此，明確腎臟衰老相關(guān)機(jī)制以及探索有效抗衰老藥物對(duì)延緩腎臟衰老、治療衰老相關(guān)腎損傷具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以D-gal誘導(dǎo)C57BL/6j小鼠的腎臟衰老模型為研究對(duì)象，探討AOS可能的抗衰老作用及其機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，D-gal處理后小鼠腎功能下降、衰老標(biāo)志物表達(dá)增加、衰老抑制基因及自噬水平降低，AOS干預(yù)后明顯改善了腎功能，上調(diào)其自噬水平和衰老抑制基因表達(dá)，表明AOS對(duì)D-gal誘導(dǎo)的小鼠腎臟衰老有潛在的保護(hù)作用。

自噬-溶酶體體系是真核細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的主要降解途徑，在自然衰老過程中，自噬活性逐漸降低。Beclin1是自噬過程啟動(dòng)的關(guān)鍵因子，自噬過程啟動(dòng)后，LC3蛋白合成并立即被Atg4剪切后在細(xì)胞質(zhì)中形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ隨后被泛素化修飾和加工后形成LC3-Ⅱ，并定位到自噬小體中，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可評(píng)估自噬水平的高低[13-14]。p62是一類銜接蛋白，在自噬溶酶體降解過程中起關(guān)鍵作用。因此，LC3-Ⅱ、Beclin1和p62均可作為自噬水平檢測(cè)的主要標(biāo)志物。吳飛翔等[15]關(guān)于多胺及與自噬的研究支持了自噬在抗衰老過程中的關(guān)鍵作用。一項(xiàng)體外研究顯示，腎臟足細(xì)胞和近端腎小管細(xì)胞Atg5基因的特異性缺失導(dǎo)致足細(xì)胞中受損線粒體和泛素化蛋白的積累，從而導(dǎo)致年齡依賴性蛋白尿和腎小球硬化，該研究結(jié)果表明，足細(xì)胞和近端腎小管細(xì)胞中基礎(chǔ)自噬的缺乏與腎臟老化的發(fā)展相關(guān)[16]。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了AOS可以延緩D-gal誘導(dǎo)的腎臟衰老，為了探索其可能機(jī)制，我們進(jìn)一步探討了AOS處理前后自噬水平的變化。劉春燕等[17]研究表明，db/db糖尿病模型小鼠足細(xì)胞自噬水平下降，表現(xiàn)為自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ和Beclin1表達(dá)減少，p62表達(dá)增加，AMPK磷酸化被抑制，mTOR磷酸化增加。本研究結(jié)果與前人一致，D-gal組小鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)均減少，p62蛋白表達(dá)增加，予以AOS干預(yù)4周后，LC3-Ⅱ和Beclin1表達(dá)顯著增加，p62蛋白表達(dá)明顯減少，這表明AOS可能通過上調(diào)自噬水平延緩D-gal誘導(dǎo)的小鼠腎臟衰老。

研究表明，AMPK的缺失會(huì)加速衰老相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。mTOR是誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵分子，磷酸化mTOR可抑制自噬，而mTOR的負(fù)性調(diào)節(jié)可促進(jìn)自噬。AMPK/mTOR信號(hào)通路作為自噬調(diào)控的關(guān)鍵通路之一，在自噬調(diào)節(jié)中具有重要作用，AMPK在低能量條件下磷酸化，進(jìn)而通過抑制mTOR的磷酸化激活自噬[18]。因此，我們檢測(cè)了AMPK/mTOR通路的相關(guān)指標(biāo)，并探討了AOS是否通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路上調(diào)D-gal誘導(dǎo)小鼠衰老腎臟的自噬水平。研究發(fā)現(xiàn)，D-gal抑制了小鼠腎臟組織中AMPK的磷酸化，促進(jìn)mTOR磷酸化，進(jìn)而抑制自噬；AOS處理促進(jìn)了衰老腎臟中AMPK的磷酸化，從而抑制了mTOR的磷酸化，進(jìn)而增強(qiáng)自噬。基于本研究結(jié)果，我們推斷AOS通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路上調(diào)了D-gal誘導(dǎo)的小鼠衰老腎臟的自噬水平，從而延緩腎臟衰老。

綜上所述，本研究證實(shí)了在D-gal誘導(dǎo)的C57BL/6j小鼠的衰老腎臟中自噬水平下降。我們的研究表明，AOS可以延緩D-gal誘導(dǎo)的小鼠腎臟衰老，其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路上調(diào)自噬水平有關(guān)。然而，本研究只在動(dòng)物水平探討了AOS通過調(diào)控自噬水平延緩D-gal誘導(dǎo)的小鼠腎臟衰老，AOS延緩腎臟衰老的其他機(jī)制需要進(jìn)一步研究。