王睿智，陳志文，邵 樂，史孟嬌，龔子崴，佘 顏，鄧常清

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院血管生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208；2.第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

炎癥反應(yīng)貫穿于腦缺血/再灌注神經(jīng)損傷的全過程，是腦缺血/再灌注治療的主要干預(yù)環(huán)節(jié)[1]。細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種依賴于炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡方式，包括經(jīng)典焦亡途徑和非經(jīng)典焦亡途徑。經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑依賴于半胱天冬蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteases-1，Caspase-1)的活化，主要存在于非感染性炎癥類疾病中，如腦缺血/再灌注[2-3]。氧化應(yīng)激損傷是激活經(jīng)典細(xì)胞焦亡的主要途徑，同時也是腦缺血/再灌注損傷的重要機(jī)制[4]。因此，通過調(diào)控氧化應(yīng)激途徑抑制神經(jīng)細(xì)胞焦亡，可能是防治腦缺血/再灌注后炎性損傷的重要途徑。

人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，GRb1)是五加科植物人參、三七中的主要活性成分。研究表明，人參皂苷Rb1具有多種藥理作用，包括抑制興奮性毒性、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥、維持神經(jīng)遞質(zhì)平衡、抗凋亡和線粒體穩(wěn)定等作用[5]。由于人參皂苷Rb1抗腦缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制(如抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng))與細(xì)胞焦亡相關(guān)調(diào)控因素密切相關(guān)[6]，因而推測人參皂苷Rb1也可通過調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而抑制腦缺血/再灌注后神經(jīng)細(xì)胞焦亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

本研究選用形態(tài)、生理生化功能均與正常神經(jīng)細(xì)胞較為相似的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(human neuroblastoma cells，SH-SY5Y cells)進(jìn)行研究，建立氧糖剝奪/復(fù)氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型模擬體內(nèi)腦缺血/再灌注損傷，從核因子E2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2/抗氧化反應(yīng)原件(nuclear factor-E2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE)介導(dǎo)的抗氧化信號通路探究人參皂苷Rb1抗SH-SY5Y細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，進(jìn)一步明確人參皂苷Rb1抗OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞焦亡與調(diào)控Nrf2/ARE抗氧化信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 SH-SY5Y細(xì)胞(編號SCSP-5014)購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑 人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，批號18082204)購自成都普菲德公司；GV493-NFE2L2基因RNA干擾慢病毒(批號GIEL0185890)購自上海吉凱基因公司；乳酸脫氫酶檢測試劑盒(批號C0017)、Hoechst/PI雙染試劑盒(批號C1056)購自上海碧云天公司；兔抗人caspase-1多克隆抗體(批號22915-1-AP)、兔抗人Nrf2多克隆抗體(批號16396-1-AP)、兔抗人血紅素氧合酶-1(HemeOxy-genase-1，HO-1)多克隆抗體(批號10701-1-AP)購自美國Proteintech公司；兔抗人磷酸化Nrf2單克隆抗體(批號Ab76026)購自英國Abcam公司。FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號SAO0003-2)、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG (批號SA00007-2)購自美國Proteintech公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體(批號TA-09)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號ZB-2301)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (批號ZB-2305)購自北京中杉金橋公司。

1.1.3主要儀器 三氣培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國Perkinelmer公司；熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司；ChemiDoc XRS高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 方法

1.2.1野生型SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)及處理 將野生型SH-SY5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中(5% CO2，21% O2，74% N2)。取第2-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長融合后，將細(xì)胞分為空白對照(Control)組、OGD/R組、不同濃度人參皂苷Rb1(0.01、0.1、1、10、20 mg·L-1)組。在建立OGD/R模型前12 h，Control和OGD/R組加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，各藥物組加入以DMEM完全培養(yǎng)基配制的不同濃度藥物，培養(yǎng)12 h。

1.2.2si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞系構(gòu)建及處理 將野生型SH-SY5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中(5% CO2，21% O2，74% N2)。取第2-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長融合后，將3種GV493-NFE2L2基因RNA干擾慢病毒(si-Nrf2 RNA 53-1、si-Nrf2 RNA 54-1、si-Nrf2 RNA 55-1)和空載慢病毒(si-con RNA)按照MOI(Multiplicity of infection)=20的轉(zhuǎn)染滴度分別轉(zhuǎn)染入野生型SH-SY5Y細(xì)胞中。3 d后加入含5 mg·L-1嘌呤霉素的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選，通過在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(si-RNA)的表達(dá)比率來判斷轉(zhuǎn)染效率(轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/白光細(xì)胞數(shù))。直至上述各種RNA干擾慢病毒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞效率達(dá)80%后換用含2.5 mg·L-1嘌呤霉素的DMEM完全培養(yǎng)基篩選。篩選培養(yǎng)7 d后，以Western blot方法檢測GV493-NFE2L2基因RNA干擾慢病毒和空載慢病毒轉(zhuǎn)染后SH-SY5Y細(xì)胞Nrf2蛋白的表達(dá)，以此評價GV493-NFE2L2基因RNA干擾慢病毒沉默Nrf2效果，建立穩(wěn)定的si-con-SH-SY5Y細(xì)胞和si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞。

si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞系構(gòu)建后，將細(xì)胞分為si-con-SH-SY5Y細(xì)胞(空載慢病毒)對照組、si-con-SH-SY5Y細(xì)胞模型組、si-con-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組、si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞(沉默Nrf2慢病毒)模型組、si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組。在建立OGD/R模型前12 h，si-con-SH-SY5Y細(xì)胞對照組、si-con-SH-SY5Y細(xì)胞模型組和si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞模型組加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，各藥物組加入以DMEM完全培養(yǎng)基配制的1 mg·L-1人參皂苷Rb1，培養(yǎng)12 h。

1.2.3OGD/R模型建立 將模型組和藥物組細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱中(5% CO2，1% O2，94% N2)缺糖缺氧培養(yǎng)4 h，然后換成DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)糖復(fù)氧，3 h后終止培養(yǎng)并進(jìn)行檢測。

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞處理完畢后每孔加入CCK-8檢測液(每100 μL DMEM完全培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8原液)，反應(yīng)2 h后檢測450 nm的吸光度(A)值，并計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)孔A值-背景孔A值)/(正常對照孔A值-背景孔A值)×100%。

1.2.5測定LDH漏出率 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞處理完畢后，每孔收集100 μL培養(yǎng)基，1 000 r·min-1離心10 min，取上清作為細(xì)胞培養(yǎng)上清液。再向培養(yǎng)板中加入與原培養(yǎng)基等體積的新培養(yǎng)基后置于-80 ℃冷凍約30 min，隨后37 ℃溫育15 min，將細(xì)胞凍融液1 000 r·min-1離心10 min，取上清，即為細(xì)胞凍融液。分別取SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞凍融液100 μL，加入60 μL LDH檢測工作液，混勻，室溫(24-26)℃，避光孵育，計算培養(yǎng)上清液和細(xì)胞凍融液中的LDH活性，再計算細(xì)胞LDH漏出率：LDH漏出率=[培養(yǎng)上清液LDH活性/(培養(yǎng)上清液LDH活性+細(xì)胞凍融液LDH活性)]。

1.2.6Hoechst/PI染色法檢測細(xì)胞膜損傷 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞處理完畢后，在SH-SY5Y細(xì)胞加入染色液(1 mL細(xì)胞染色緩沖液中加入5 μL Hoechst染色液和5 μL PI染色液)，4 ℃孵育30 min，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光(PI)和藍(lán)色熒光(Hoechst)表達(dá)強(qiáng)度及定位。

1.2.7免疫熒光法檢測焦亡蛋白caspase-1的表達(dá) 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞處理完畢后，將SH-SY5Y細(xì)胞置于4%多聚甲醛中固定爬片15 min，PBST清洗，再用PBST稀釋的1 %牛血清白蛋白封閉液封閉1 h。加入PBST稀釋的caspase-1一抗(1 ∶50稀釋)，4 ℃孵育過夜。每孔加入PBS稀釋的TRITC標(biāo)記的熒光二抗(1 ∶50稀釋)，室溫避光孵育1 h，DAPI染液染核，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光(caspase-1)和綠色熒光(si-RNA)的表達(dá)強(qiáng)度及定位。

1.2.8免疫熒光法檢測Nrf2蛋白活化 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞處理完畢后，將SH-SY5Y細(xì)胞置于4%多聚甲醛中固定爬片15 min，PBST清洗，再用PBST稀釋的1 %牛血清白蛋白封閉液封閉1 h,加入PBST稀釋的磷酸化Nrf2一抗(1 ∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜。每孔加入PBS稀釋的TRITC標(biāo)記熒光二抗(1 ∶50稀釋)，室溫避光孵育1 h，DAPI染液染核，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光(activated Nrf2)和綠色熒光(si-RNA)的表達(dá)強(qiáng)度及定位，檢測Nrf2蛋白活化水平。

1.2.9Western blot檢測Nrf2、HO-1、caspase-1蛋白表達(dá) 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)皿中。細(xì)胞處理完畢后，將SH-SY5Y細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1離心10 min后收集細(xì)胞，加入150 μL蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白。BCA 法測定各樣本蛋白濃度，并將各樣本蛋白濃度調(diào)整為3 g·L-1。蛋白樣品煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。加入PBS稀釋的Nrf2、HO-1、caspase-1一抗(1 ∶1 000稀釋)及β-actin一抗(1 ∶1 500稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST清洗，加入TBST稀釋的二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。TBST清洗，加入ECL顯影液顯影，凝膠成像儀照相，Image圖像分析軟件測定各目的條帶的積分光密度(IOD)，分別以Nrf2、HO-1、caspase-1的IOD與β-actin的IOD的比值對目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行相對定量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度人參皂苷Rb1對OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響野生型SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后，細(xì)胞存活率下降(P<0.01)。與模型組比較，各濃度人參皂苷Rb1組均可使細(xì)胞存活率提升(P<0.01)。人參皂苷Rb1(0.01、0.1、1 mg·L-1)組之間呈現(xiàn)量效關(guān)系，以人參皂苷Rb1(1 mg·L-1)組作用最強(qiáng)(P<0.05，P<0.01),見Fig1。

Fig 1 Comparison of cell survival rate in each group (n=8)**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs OGD/R group;△P<0.05,△△P<0.01 vs GRb1(1 mg·L-1)group.

2.2 si-Nrf2 RNA-SH-SY5Y細(xì)胞系的構(gòu)建選取3種GV493-NFE2L2慢病毒(si-Nrf2 RNA 53-1、si-Nrf2RNA 54-1、si-Nrf2RNA 55-1)干擾SH-SY5Y細(xì)胞，評價GV493-NFE2L2慢病毒下調(diào)Nrf2的效果。與si-RNA比較，si-Nrf2 RNA 53-1、54-1、55-1均可使SH-SY5Y細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)水平下降(P<0.01)，且以si-Nrf2 RNA 55-1的作用最強(qiáng)，本研究采用si-Nrf2 RNA 55-1干擾細(xì)胞構(gòu)建Nrf2低表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞(si-Nrf2-SH-SY5Y)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),見Fig2。

2.3 人參皂苷Rb1對OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響si-con-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后，細(xì)胞存活率降低(P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后細(xì)胞存活率下降(P<0.05)。

與si-con-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R組比較，si-con-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組存活率增加(P<0.05)。與si-con-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y人參皂苷Rb1組細(xì)胞存活率降低(P<0.01),見Fig3。

Fig 2 Comparison of Nrf2 protein expression in each group (n=3)**P<0.01 vs si-con group.

Fig 3 Comparison of cell survival rate in each group (n=8)**P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y control group;#P<0.05 vs si-con-SH-SY5Y OGD/R group;△△P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y GRb1 group.

2.4 人參皂苷Rb1對OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞焦亡的影響si-con-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后，LDH漏出率(Fig4A)、Hoechst/PI熒光強(qiáng)度(Fig4B)和焦亡蛋白caspase-1表達(dá)(Fig4C、4D)增加(P<0.05,P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后LDH漏出率、Hoechst/PI熒光強(qiáng)度和焦亡蛋白caspase-1的表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)。

與si-con-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R組比較，si-con-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組LDH漏出率、Hoechst/PI熒光強(qiáng)度和焦亡蛋白caspase-1的表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組LDH漏出率、Hoechst/PI熒光強(qiáng)度和焦亡蛋白caspase-1的表達(dá)均升高(P<0.01)。

2.5 人參皂苷Rb1對OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞Nrf2/ARE信號通路的影響si-con-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后，活化Nrf2蛋白(磷酸化Nrf2蛋白)熒光表達(dá)(Fig5A)、全細(xì)胞Nrf2(Fig5B)和HO-1(Fig5C)蛋白表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R組活化Nrf2蛋白熒光表達(dá)和全細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05，P<0.01)。

Fig 4 Effect of ginsenoside Rb1 on Pyroptosis of SH-SY5Y cells after OGD/R(A)Comparison of LDH release rate in each group (n=8).(B)Comparison of double-fluorescent staining with PI (red),and Hoechst (green)in each group (n=5).(C)Comparison of double-fluorescent staining with caspase-1 (red)siRNA (green)and DAPI (blue)in each group (n=5).(D)Comparison of protein levels of caspase-1 in each group (n=3).*P<0.05,**P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y control group;#P<0.05,##P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y OGD/R group;△△P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y GRb1group.

Fig 5 Effect of ginsenoside Rb1 on Nrf2 /ARE signaling pathway in SH-SY5Y cells after OGD/R(A)Comparison of double-fluorescent staining with activated Nrf2 (red),siRNA (green)and DAPI (blue)in each group (n=5).(B)Comparison of protein levels of Nrf2in each group (n=3).(C)Comparison of protein levels of HO-1 in each group(n=3).*P<0.01,**P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y control group;#P<0.05,##P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y OGD/R group;△△P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y GRb1 group.

與si-con-SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R組比較，si-con-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組的活化Nrf2蛋白熒光表達(dá)和全細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細(xì)胞人參皂苷Rb1組的活化Nrf2蛋白熒光表達(dá)、全細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。

3 討論

炎癥反應(yīng)是腦缺血/再灌注一系列損傷級聯(lián)反應(yīng)中的重要機(jī)制，阻斷炎癥反應(yīng)是改善缺血/再灌注腦損傷的理想策略。細(xì)胞焦亡是一種典型依賴于炎癥的程序性細(xì)胞死亡方式，caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑參與了腦缺血/再灌注損傷的過程[3]。細(xì)胞焦亡時，質(zhì)膜破裂形成小孔，有利于能夠穿透細(xì)胞膜的細(xì)胞染料穿過焦亡細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使其染色陽性。PI是一種可以嵌合到雙鏈DNA和RNA的堿基對中并與之結(jié)合的熒光染料，無堿基特異性，僅能通過受損的細(xì)胞膜顯示紅光。焦亡細(xì)胞的胞膜完整性消失，細(xì)胞滲透性腫脹，胞內(nèi)物質(zhì)流出，如LDH和炎性細(xì)胞因子釋放。caspase-1為經(jīng)典焦亡途徑的關(guān)鍵分子，其活化反映了焦亡發(fā)生。因此，Hoechst/PI染色、LDH漏出及caspase-1的活化廣泛用于檢測焦亡的發(fā)生[7]。

Nrf2/ARE抗氧化信號通路是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化機(jī)制，在生理狀態(tài)下，Nrf2與胞質(zhì)伴侶蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH2 associated protein-1，Keap-1)結(jié)合，且被泛素蛋白酶迅速降解，處于相對抑制狀態(tài)并被錨定在胞質(zhì)中。當(dāng)機(jī)體受到氧自由基和內(nèi)源性毒素等攻擊時，Nrf2與Keap-l解偶聯(lián)，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE相結(jié)合，從而啟動下游抗氧化基因和一系列II相解毒酶如血紅素氧合酶-1(hemeOxy-genase-1，HO-1)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)和醌氧化還原酶1(NADPH quinine oxidoreductase，NQO1)等的表達(dá)。研究表明Nrf2是Nrf2/ARE抗氧化信號通路的關(guān)鍵因子，對細(xì)胞焦亡發(fā)揮著重要的負(fù)調(diào)控作用[8-9]。

本研究結(jié)果表明在氧糖剝奪/復(fù)氧后細(xì)胞存活率下降，LDH漏出率、Hoechst/PI熒光表達(dá)、焦亡蛋白caspase-1的表達(dá)均增高，這提示細(xì)胞焦亡參與了氧糖剝奪/復(fù)氧后細(xì)胞的損傷。進(jìn)一步應(yīng)用siRNA 干擾技術(shù)成功構(gòu)建siRNA Nrf2的SH-SY5Y細(xì)胞模型。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪/復(fù)氧后，Nrf2/ARE抗氧化信號通路關(guān)鍵分子Nrf2和HO-1的表達(dá)明顯增加，表明氧糖剝奪/復(fù)氧的刺激激活了細(xì)胞內(nèi)Nrf2/ARE信號通路。當(dāng)Nrf2基因沉默后，細(xì)胞焦亡以及細(xì)胞損傷顯著加重，表明沉黙Nrf2基因后增強(qiáng)細(xì)胞焦亡，促進(jìn)細(xì)胞損傷。這提示Nrf2作為Nrf2/ARE抗氧化信號通路的關(guān)鍵因子，可通過負(fù)調(diào)控氧糖剝奪/復(fù)氧后細(xì)胞焦亡，從而抑制細(xì)胞的損傷。

人參皂苷Rb1是人參二醇系皂苷，屬于達(dá)瑪烷型三萜皂苷類化合物，其主要分布在五加科人參屬植物中，如三七、人參等。目前研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有著較強(qiáng)的藥理活性，能夠通過多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)的作用方式抗腦缺血/再灌注損傷。其中，抗炎癥反應(yīng)與抗氧化應(yīng)激是人參皂苷Rb1發(fā)揮對腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)功能保護(hù)作用的重要機(jī)制[10-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1能夠提高氧糖剝奪/復(fù)氧后細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞LDH漏出率、Hoechst/PI熒光表達(dá)、焦亡蛋白caspase-1的表達(dá)，表明人參皂苷Rb1具有抗細(xì)胞焦亡的效應(yīng)。人參皂苷Rb1能上調(diào)全細(xì)胞Nrf2蛋白和活化Nrf2蛋白表達(dá)，維持HO-1的高表達(dá)水平，表明人參皂苷Rb1可激活細(xì)胞Nrf2/ARE信號通路。當(dāng)Nrf2基因沉默后，人參皂苷Rb1對Nrf2/HO-1信號通路的激活作用減弱，且人參皂苷Rb1抗細(xì)胞損傷和細(xì)胞焦亡的效應(yīng)減弱。這一結(jié)果提示人參皂苷Rb1可能是通過調(diào)控Nrf2/ARE抗氧化信號通路，而發(fā)揮抗細(xì)胞焦亡的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明細(xì)胞焦亡參與了氧糖剝奪/復(fù)氧后細(xì)胞損傷，人參皂苷Rb1可通過抑制OGD/R后細(xì)胞焦亡，從而發(fā)揮對細(xì)胞保護(hù)作用。其作用機(jī)制與調(diào)控Nrf2/ARE抗氧化信號通路密切相關(guān)。