吳加慧，蔣 娜，周 艷，劉 歡，李洪梅，李蓉濤，劉 丹

(昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南 昆明 650500)

流感是由流感病毒(influenza virus)引起的急性發(fā)熱性呼吸道傳染病，具有傳染性強，傳播速度快的特點。流感病毒屬正粘病毒科，以RNA為主要遺傳物質(zhì)，流感病毒對全球的健康產(chǎn)生巨大的影響，根據(jù)世衛(wèi)組織估計每年造成20萬至50萬人死亡[1-2]。由于流感病毒亞型多樣且具有高變異性，極易通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換高度變異，逃避宿主的免疫清除，并產(chǎn)生新的跨種屬感染的病毒株，引發(fā)耐藥性并迫使相應(yīng)疫苗不斷更新[3]。而疫苗的研發(fā)一般在流感爆發(fā)半年以后才能被研制出來，在疫苗研制出之前藥物就發(fā)揮了重要的作用。因此，尋找新型抗流感藥物很有必要。流感病毒復制周期包括附著、內(nèi)吞、脫殼、復制、轉(zhuǎn)錄、包裝、出芽和釋放幾個步驟[4-5]。阻斷流感病毒的復制周期被認為是開發(fā)新型抗流感病毒藥物的一種極好的策略。根據(jù)中醫(yī)“溫邪上受，首先犯肺”的理論，流感病毒對肺部的傷害最大，這與西醫(yī)藥理學的研究結(jié)果相一致。病毒感染導致的過度免疫反應(yīng)，誘導炎性細胞因子如IL-1、IL-6等過度分泌，被認為是主要因素之一[6]。抑制流感病毒入侵和降低過度免疫反應(yīng)引起的炎性損傷是流感治療的兩個重要方面，兼具抗流感病毒和抗炎活性的藥物在流感治療中具有前景和優(yōu)勢。

蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)為敗醬科纈草屬植物，蜘蛛香的藥用歷史悠久?，F(xiàn)代藥理研究表明，蜘蛛香中的環(huán)烯醚萜類成分使其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗菌等多種生物學活性[7-8]。Isovaltrate acetoxyhydrin(IAN)是從蜘蛛香中分離獲得的環(huán)烯醚萜類化合物[9]，本研究通過流感病毒A/WSN/33/2009 H1N1 (WSN)感染狗腎細胞(MDCK)模型，發(fā)現(xiàn)其對流感病毒感染的MDCK細胞具有保護作用，闡述了環(huán)烯醚萜IAN的抗流感病毒活性和作用機制，并發(fā)現(xiàn)其顯著的抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料MDCK由昆明理工大學醫(yī)學院楊帆老師惠贈；宮頸癌細胞(HeLa)購買于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；奧司他韋(Ost)，中國賽默飛；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)，美國紐約Gibco公司；TPCK胰蛋白酶，美國Sigma-Aldrich；MTT，中國索萊寶公司；DAPI染料、神經(jīng)氨酸酶測定試劑盒、化學發(fā)光試劑盒和放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液，碧云天生物技術(shù)公司；小鼠抗核蛋白(NP)單克隆抗體，兔早期核內(nèi)體抗原(EEA1)單克隆抗體，英國Abcam公司；山羊抗小鼠、兔IgG結(jié)合FITC熒光二抗，中杉金橋生物技術(shù)公司，批號：ZF-0312、ZF-0311。

1.2 儀器多功能讀板儀Spectra Max M2，美國Molecular Devices；光學倒置顯微鏡CKX41，德國Olympus；CO2細胞培養(yǎng)箱3111，美國Thermofisher；高速冷凍離心機1-14K，德國Sigma；尼康激光共聚焦顯微鏡A1R/A1，日本Nikon。

1.3 細胞半數(shù)感染量(TCID50)的測定將MDCK細胞以2×106·L-1每孔0.2 mL的密度接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，WSN病毒液10倍濃度梯度稀釋，感染單層MDCK細胞，正常細胞作為對照組，于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞狀態(tài)，72 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應(yīng)(CPE)，記錄病變程度和孔數(shù)，采用Reed-Muench法,計算細胞半數(shù)感染量 (TCID50)[10]。

1.4 細胞毒性實驗使用MTT法測定IAN的細胞毒性。將IAN倍比稀釋成5個濃度(3.125、6.25、12.5、25和50 μmol·L-1)，分別加入到已長成單層細胞的96孔培養(yǎng)板中，設(shè)正常細胞對照組，每組設(shè)置3個復孔，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用MTT法測定細胞活度[11]，使用Spetra Max M2檢測波長為490 nm的吸光度。

1.5 細胞病變效應(yīng)(CPE)抑制實驗將MDCK細胞以2×106·L-1每孔0.2 mL的密度接種于96孔板中過夜，梯度濃度的IAN(3.125、6.25、12.5、25和50 μmol·L-1)與WSN(MOI=0.01)共培養(yǎng)。將感染細胞在無血清DMEM中培養(yǎng)48 h，其中含有質(zhì)量分數(shù)為1%的胎牛血清(BSA)和2.5 mg·L-1的TPCK胰酶。使用MTT法測定490 nm吸光值，使用IBM SPSS Statistics 20軟件分析吸光值。

1.6 加藥時間點實驗MDCK細胞以3×106·L-1每孔0.2 mL接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h。WSN(MOI=0.01)感染細胞2 h后移除培養(yǎng)基中病毒液，并以此時為作用的零時，再分別在0-2 h、0-5 h、0-8 h和0-10 h，以及2-5 h時間段進行IAN(20 μmol·L-1)處理。收集上清裂解細胞，分析NP含量變化[12]。

1.7 免疫熒光染色HeLa細胞以2×106·L-1每孔0.2 mL的密度接種于24孔板中的玻片上，培養(yǎng)24 h。WSN(MOI=0.1)感染細胞2 h后移除培養(yǎng)基中病毒液，分別在感染后的0-2 h、0-5 h、0-8 h和0-10 h四個時間段進行IAN(20 μmol·L-1)處理。PBS洗滌，多聚甲醛固定30 min，質(zhì)量分數(shù)為5%的BSA室溫封閉1 h，抗NP抗體檢測NP在Hela細胞上的定位含量變化。

1.8 抗血凝素凝集實驗將一系列濃度(0.5、5、25、50 μmo ·L-1)的化合物IAN與WSN病毒渦旋混勻后加入到V型96孔板中，之后，加入等體積使用生理鹽水配置的體積分數(shù)為1%的紅細胞懸液，室溫靜置30 min，觀察并記錄V型96孔板中紅細胞的凝集效果。

1.9 IAN與NP分子對接從Protein Data Bank上下載NP蛋白的三維結(jié)構(gòu)(PDB編號:2IQH，分辨率:3.2A)；使用ChemDraw繪制IAN結(jié)構(gòu)，輸出3D結(jié)構(gòu)；使用Schrodinger軟件完成分子對接并分析。

1.10 NA活性抑制實驗通過神經(jīng)氨酸酶抑制篩選試劑盒檢測IAN對NA酶活性的抑制活性。將70 μL神經(jīng)氨酸酶緩沖液和10 μL NA溶液混合均勻，然后分別加入10 μL梯度稀釋的OST和IAN(25、50、100 μmol·L-1)。加入10 μL顯色底物，室溫混合1 min，37 ℃孵育30 min，用spetramax M2檢測激發(fā)波長322 nm和發(fā)射波長450 nm的熒光信號[13]。

1.11 ELISA檢測IL-1、IL-6表達量RAW264.7細胞以密度2×109·L-1接種于12孔板中，將2.5 μmol·L-1，5 μmol·L-1兩個濃度的IAN與1 mg·L-1的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)共同作用細胞18 h，收集細胞上清，使用ELISA試劑盒檢測上清溶液中IL-1 和IL-6細胞因子的含量。

2 結(jié)果

2.1 IAN(Fig1)對流感病毒感染的MDCK細胞具有明顯的保護作用通過MTT法檢測IAN對MDCK細胞的細胞毒性作用，發(fā)現(xiàn)該化合物在6.25-25 μmol·L-1濃度范圍對MDCK細胞活度幾乎沒有影響(Fig2A)，但對流感病毒感染的MDCK細胞具有明顯的保護作用(Fig2B,C)，如圖所示，流感病毒A/WSN/33/2009感染MDCK細胞48 h，細胞發(fā)生明顯病變，當用6.25-25 μmol·L-1的IAN與病毒共同作用時，細胞病變率顯著降低，表明IAN(見Fig1)對流感病毒感染的MDCK細胞具有顯著的保護作用。

Fig 1 Structure of isovaltrate acetoxyhydrin (IAN)

Fig 2 The protective effect of IAN on MDCK cells infected by influenza virusA:The effect of IAN on MDCK cell viability;B:The protective effect of IAN on MDCK cells infected by influenza virus,and Oseltamivir (OST)was used as a positive control;C:Cytopathic effect of IAN on influenza virus-infected MDCK cells observed through a microscope.△△P<0.01 vs Control;**P<0.01 vs WSN

2.2 IAN對病毒生命周期的影響為了確定IAN作用于病毒感染受體細胞的哪一個階段，我們設(shè)計了加藥時間點實驗，分別在流感病毒W(wǎng)SN感染后的0-2 h、0-5 h、0-8 h、0-10 h以及2-5 h時間段進行IAN(20 μmol·L-1)處理，藥物作用時間分別覆蓋了病毒吸附、入核、復制和子代病毒釋放過程(Fig3A)。免疫印記實驗結(jié)果(Fig3B)顯示，IAN處理0-2 h，宿主細胞結(jié)合的病毒量與對照組差異不大，說明IAN幾乎不干擾病毒早期的吸附。IAN處理0-5 h和2-5 h時，病毒NP蛋白的含量與對照組相比明顯減少，表明IAN影響吸附后的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運與入核階段。免疫熒光實驗(Fig3C)同樣驗證了這一結(jié)果，各處理組中流感病毒均能與宿主細胞有效吸附，而病毒處理5 h后，IAN處理組進入細胞核內(nèi)的NP蛋白比例明顯降低，表明IAN干擾了病毒核糖核蛋白(vRNP)的入核過程。這些結(jié)果表明IAN可能在病毒吸附后，影響了轉(zhuǎn)運及入核的過程從而影響了病毒的復制。

2.3 IAN對紅細胞凝集作用的影響流感病毒表面的血凝素(HA)蛋白，含有識別與結(jié)合宿主細胞表面受體的結(jié)構(gòu)，能使一些特定的紅細胞發(fā)生凝集現(xiàn)象。實驗結(jié)果顯示(Fig4)在無WSN病毒作用的情況下，紅細胞沉降于孔底呈點狀，而2-6的WSN病毒作用可使血細胞發(fā)生凝集沉于孔板底部呈網(wǎng)狀。當加入抗HA抗體與WSN病毒共處理時，可有效抑制病毒引起的血細胞凝集，而IAN則對血細胞的凝集沒有抑制作用。以上結(jié)果顯示IAN不能抑制病毒引起的紅細胞凝集，表明病毒表面抗原HA并不是IAV的靶點，該結(jié)果與時間點實驗IAV不影響病毒的吸附過程結(jié)果相一致。

2.4 IAN能與NP功能域結(jié)合NP蛋白除了維持核糖蛋白體復合物(vRNP)的穩(wěn)定性以外，還在流感病毒的入核、轉(zhuǎn)錄、復制等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。IAN與NP蛋白分子對接結(jié)果顯示(Fig5)，IAN能以氫鍵與NP蛋白395位天冬氨酸(N395)、396位蘇氨酸(T396)、447位亮氨酸(L447)結(jié)合，這3個位點剛好處于核定位信號(Nuclear localization signal，NLS3)320-400殘基和NP-NP結(jié)合區(qū)371-465殘基的區(qū)域之中。說明IAN可通過與NP蛋白的結(jié)合干擾NP蛋白的功能從而抑制病毒vRNP的轉(zhuǎn)運和之后的入核復制過程[14-15]。

Fig 3 Effects of IAN on replication cycle of influenza virus in cellsA:Design time-of-additional experiments;B:The expression level of influenza NP protein was detected after IAN treatment for 0-2 h,0-5 h,0-8 h,0-10 h and 2-5 h;C:NP fluorescence antibody was used to track the location of the NP in HeLa cells.

Fig 4 Effects of IAN on hemagglutination inhibition A:Anti-HA antibody was used as positive control;B:IAN had no effect on WSN-induced RBC agglutination

Fig 5 IAN docking with NP molecule

2.5 IAN對神經(jīng)氨酸酶(NA)活性具有一定的抑制效果神經(jīng)氨酸酶抑制實驗結(jié)果顯示(Fig6)，化合物IAN具有神經(jīng)氨酸酶的抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，與NA對照組相比，IAN在大于5 μmol·L-1時，就表現(xiàn)出一定的抑制NA的活性。

Fig 6 Effect of IAN on NA activities **P<0.01

2.6 環(huán)烯醚萜IAN抑制LPS誘導的巨噬細胞的IL-1、IL-6的產(chǎn)生巨噬細胞作為天然免疫的重要成員在抵抗病原體入侵過程中發(fā)揮重要作用，同時也是病原體激發(fā)過度免疫，產(chǎn)生大量炎癥因子造成機體損傷的主要免疫細胞。在使用LPS誘導RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中，我們檢測了IAN對關(guān)鍵炎癥因子IL-1和IL-6的分泌的影響。實驗結(jié)果如Fig7所示，與空白對照組相比，LPS誘導的巨噬細胞中，IL-1(A)和IL-6(B)的產(chǎn)生均明顯升高，而與2.5-5 μmol·L-1的IAN共同作用時，炎癥因子IL-1和IL-6的產(chǎn)生受到了明顯抑制，說明IAN體外具有明顯的抗炎活性。

Fig 7 The inhibitory effect of IAN on IL-1 and IL-6A:The inhibitory effect of IAN on IL-1;B:The inhibitory effect of IAN on IL-6.△△P<0.01 vs control;**P<0.01 vs LPS

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，IAN對流感病毒感染的MDCK細胞具有明顯的保護作用，進一步追蹤病毒的感染過程，發(fā)現(xiàn)病毒感染細胞0-2 h階段IAN對病毒的影響不大，而感染細胞2-5 h時予以IAN處理，細胞內(nèi)NP蛋白的量明顯降低，說明IAN并不是作用于病毒吸附階段，血凝實驗也證實了這一點。IAN的抑制作用最早發(fā)生于病毒感染細胞0-5 h，與此同時免疫熒光的結(jié)果表明，與對照組相比細胞核內(nèi)的NP蛋白的量明顯減少，表明病毒入核過程受到了阻礙。因此，IAN發(fā)揮抗流感病毒活性作用首先發(fā)生在病毒入核階段。流感病毒vRNP是流感病毒最基本的復制單位，是由病毒的RNA基因和堿性聚合酶1(PB1)、堿性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)及核蛋白(NP)組成的復合體。其中NP是vRNP構(gòu)成的主要部分，具有穩(wěn)定vRNP的結(jié)構(gòu)的作用，NP上的核定位信號在vRNP入核階段起到了決定性的作用[16]。經(jīng)過分子對接發(fā)現(xiàn)IAN能以氫鍵與NP蛋白395位天冬氨酸(N395)、396位蘇氨酸(T396)、447位亮氨酸(L447)結(jié)合，這3個位點剛好在核定位信號區(qū)域中。證實NP蛋白是IAN的有效靶點。值得注意的是，在該實驗中，化合物濃度大于50 μmol·L-1時對NA的抑制效果優(yōu)于OST，根據(jù)說明書，這是因為OST抗NA的活性需要在體內(nèi)代謝物為奧司他韋酸，體外實驗中OST的抑制效果并不十分明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒本身并不是導致重癥及引起致死的關(guān)鍵，病毒導致的肺組織損傷或更加嚴重的急性呼吸窘迫綜合癥是流感病毒尤其是高致病性流感病毒的高致病力和高致死率的主要原因[17]。流感病毒感染所致的組織損傷與過度或失控的炎性免疫反應(yīng)密切相關(guān)，炎性因子迅速、大量分泌，致細胞因子風暴。因此抑制流感病毒入侵和降低過度免疫反應(yīng)引起的炎性損傷是流感治療的兩個重要方面。本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)烯醚萜IAN還對LPS誘導的巨噬細胞產(chǎn)生的炎癥因子IL-1、IL-6具有明顯的抑制作用，即IAN兼具有抗流感病毒和抗炎的活性，在抗流感治療可能具有更好的前景。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛香中的環(huán)烯醚萜IAN在體外具有抗流感病毒以及抗炎活性。系統(tǒng)性探索IAN對流感病毒的生命周期的影響，發(fā)現(xiàn)其抗流感機制是通過影響病毒吸附后的入核復制過程來實現(xiàn)的，流感病毒NP蛋白很可能是它作用的靶點。IAN能通過與NP蛋白功能區(qū)結(jié)合，干擾vRNP的轉(zhuǎn)運和核定位，同時IAN對病毒的釋放也有一定的效果。本研究為蜘蛛香在抗流感中的應(yīng)用提供了依據(jù)，對于開發(fā)環(huán)烯醚萜類抗流感病毒藥物具有重要意義。