錢江華，劉亞明，杜家如，劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,安徽 蚌埠 233000)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、修飾、折疊和組裝的場所，在缺氧、糖基化抑制、氧化應(yīng)激等因素作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集，引起ER應(yīng)激(ER stress)[1]。為增強(qiáng)對(duì)蛋白的折疊和清除能力，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的損害，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)，未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)被激活[2-3]。UPR由3種跨膜蛋白啟動(dòng)，分別是活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)、肌醇需求酶1 (inositol-requiring enzyme 1，IRE1)和蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase-1ike ER kinase，PERK)。生理狀態(tài)下3條信號(hào)通路蛋白(ATF6、IRE1、PERK)與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)結(jié)合，處于非活性狀態(tài)。在ER應(yīng)激作用下，GRP78與以上3種跨膜蛋白分離，并結(jié)合錯(cuò)誤折疊蛋白，從而激活UPR信號(hào)通路。

MAPK 通路的異常活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞喪失分化和凋亡的能力，引起細(xì)胞異常增殖、轉(zhuǎn)化，在腫瘤耐藥方面發(fā)揮重要作用[4]。研究表明，多數(shù)實(shí)體腫瘤對(duì)線粒體介導(dǎo)凋亡敏感性下降的一個(gè)重要原因是MAPK/MEK/ERK信號(hào)通路的激活，調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路是緩解臨床多藥耐藥的一個(gè)重要途徑[5]。

多柔比星(doxorubicin，adriamycin，ADM，阿霉素)為蒽環(huán)類抗生素，通過阻止RNA轉(zhuǎn)錄過程，抑制RNA合成廣泛用于惡性淋巴肉瘤、乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤的治療[6-8]。但是由于心臟毒性及耐藥性，一定程度上限制了其在臨床中應(yīng)用。

本研究以臨床治療乳腺癌常用的藥物多柔比星和抑制糖基化的物質(zhì)衣霉素(Tunicamycin，TM)作用乳腺癌細(xì)胞，觀察乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星引起ER應(yīng)激途徑的細(xì)胞凋亡反應(yīng)及抑制MEK通路引起細(xì)胞凋亡的改變，為探討減少多柔比星耐藥及提高療效提供新思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞株乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞(購自中科院細(xì)胞所)。

1.2 試劑DMEM 高糖培養(yǎng)基(批號(hào)11995500)、DMEM 低糖培養(yǎng)基(批號(hào)11885500)、胰蛋白酶(批號(hào)25200072)：Gibco公司；胎牛血清(批號(hào) 90090531)：杭州四季青公司；GRP78(批號(hào)sc-166490)、ERK1(批號(hào)sc-271270)、ERK2(批號(hào)sc-271451)、pERK1/2(批號(hào)sc-135900)及β-actin(批號(hào)sc-58673)：SantaCruz公司；山羊抗兔IgG(批號(hào)20000217)、山羊抗小鼠IgG(批號(hào)20000242)：中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TM(批號(hào)654380)、PD98059(批號(hào)167869)：Sigma公司；多柔比星，規(guī)格：每支10 mg，批號(hào)：19059911，批準(zhǔn)文號(hào)：H33021980，海正瑞輝制藥有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231加入DMEM高糖型培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)傳代。

2.2 MTT法測定細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔100 μL培養(yǎng)液含6 000個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，用不同濃度(0、1、2、4、8、12 μmol·L-1)TM和(0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5 μmol·L-1)ADM處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入濃度為5 g·L-1的MTT溶液10 μL繼續(xù)孵育4 h，棄上清；每孔加DMSO150 μL，37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀測定570 nm波長吸光度A值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.3 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)MEK抑制劑PD98059(40 μmol·L-1)預(yù)先處理MDA-MB-231細(xì)胞1 h后再給予TM(4 μmol·L-1)及ADM(0.5 μmol·L-1)處理不同時(shí)間(0、6、12、24、36 h)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理24 h后，提取總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度。SDS-PAG電泳，轉(zhuǎn)膜，無蛋白快速封閉液室溫封閉30 min，加入一抗(GRP78、ERK1/2、pERK1/2，稀釋比例均為1 ∶1 000)4 ℃過夜。TPBS洗滌3次，二抗1 ∶10 000室溫孵2 h，TPBS洗滌3次。最后使用ECL系統(tǒng)對(duì)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。

2.4 PI染色檢測細(xì)胞凋亡將MDA-MB-231制成單細(xì)胞懸液，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入PD98059(40 μmol·L-1)、ADM(0.5 μmol·L-1)及PD98059聯(lián)合ADM處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液至流式管中，1 200 r·min-1離心10 min，棄上清；培養(yǎng)板中加入PI 緩沖液750 μL/孔，37 ℃孵育10 min，收集細(xì)胞于對(duì)應(yīng)流式管中，混勻，4 ℃避光保存，過夜，流式細(xì)胞儀檢測。以亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例代表凋亡細(xì)胞數(shù)。

2.5 RT-PCR檢測GRP78轉(zhuǎn)錄水平根據(jù)GRP78基因的全長序列設(shè)計(jì)引物：GRP78上游：5′-GTTTGCTGAGGAAGACAAAAAGCTC-3′，下游：5′-CACTTCCATAGAGTTTGCTGATAATTG-3′，擴(kuò)增長度為240 bp。取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×上樣緩沖液混合，上樣于2.0%瓊脂糖凝膠，以1×TBE緩沖液電泳，電壓100 V，電泳30 min。電泳圖譜進(jìn)行灰度分析，求得樣品電泳條帶灰度與內(nèi)參照GAPDH條帶灰度之比，進(jìn)行半定量。

3 結(jié)果

3.1 TM和ADM對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制作用MTT結(jié)果表明，隨著TM和ADM濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞的存活率下降。如Fig1示，4 μmol·L-1的TM作用于MDA-MB-231 細(xì)胞后24、48、72 h，細(xì)胞存活率分別是(92.72±3.98)%、(90.13±3.65)%和(82.69±4.47)%。0.5 μmol·L-1的ADM作用于 MDA-MB-231 細(xì)胞后24、48、72 h，細(xì)胞存活率分別是(90.35±3.37)%、(60.77±4.31)% 和(54.27±4.97)%。

Fig 1 Changes of viability of MDA-MB-231 cells after treatment with TM and ADM for 24,48 and 72 h

3.2 GRP78在乳腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

3.2.1GRP78在乳腺癌組織中呈陽性表達(dá) 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GRP78在乳腺癌組織中表達(dá)與乳腺正常組織中表達(dá)有差異(P<0.05)，GRP78在乳腺癌組織中強(qiáng)陽性表達(dá)，而在乳腺正常組織中呈弱陽性表達(dá)，見Fig2。

Fig 2 Expression of GRP78 in breast tissues(×400)A:GRP78 is strong positive in breast cancer；B:GRP78 is weak positive in normal breast

3.2.2TM、ADM上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中GRP78的表達(dá) Fig3 Western blot檢測結(jié)果可以看出，GRP78在MDA-MB-231細(xì)胞中(0 h)呈陽性表達(dá)，并且TM、ADM均可上調(diào)GRP78的表達(dá)。TM作用24 h時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，差異有顯著性(P<0.01)，至36 h時(shí)表達(dá)減弱。ADM作用36 h時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，差異有顯著性(P<0.01)。

Fig 3 TM and ADM induced activation of GRP78 in MDA-MB-231 cells

3.3 PD98059增強(qiáng)ADM誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡Fig4A Western blot檢測顯示，對(duì)照組中pERK1/2正常表達(dá)，因MEK/ERK通路被阻斷，其下游的pERK1/2表達(dá)(PD98059組及ADM+PD98059組)顯著降低。Fig4B凋亡檢測結(jié)果顯示，PD98059單獨(dú)作用時(shí)細(xì)胞凋亡率為17%，ADM單獨(dú)作用時(shí)細(xì)胞凋亡率為20%，但二者合用時(shí)凋亡率高達(dá)45%，與單獨(dú)作用時(shí)比較，差異有顯著性(P<0.05)。

3.4 PD98059抑制ADM對(duì)GRP78的表達(dá)Fig5A Western blot檢測顯示，PD98059作用于MDA-MB-231細(xì)胞不同時(shí)間，與對(duì)照組(0 h)比較，PD98059下調(diào)乳腺癌細(xì)胞GRP78的表達(dá)。ADM與PD98059聯(lián)合處理細(xì)胞，F(xiàn)ig5B結(jié)果顯示PD98059可抑制ADM對(duì)GRP78的上調(diào)作用，不同的時(shí)間組GRP78表達(dá)與對(duì)照組(0 h)比較無明顯差異(P>0.05)。

Fig 4 Effects of PD98059 on expression of pERK1/2 and apoptosisA：PD98059 blocked activation of pERK1/2；B：PD98059 sensitized MDA-MB-231 cells to ADM-induced apoptosis.*P<0.05 vs ADM and PD98059 group

Fig 5 Effect of PD98059 on GRP78 expressionA:PD98059 down-regulated GRP78 expression;B:PD98059 blocked ADM-induced up-regulation of GRP78 expression

3.5 抑制MEK/ERK通路對(duì)GRP78轉(zhuǎn)錄水平的影響如Fig6所示，ADM組GRP78 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，PD98059組GRP78 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.01)，ADM聯(lián)合PD98059組GRP78 mRNA表達(dá)水平低于ADM組和對(duì)照組(P<0.01)。

Fig 6 Effect of PD98059 on mGRP78 expressionA:PD98059 decreased GRP78 mRNA expression level;B:Variation of GRP78 mRNA expression level.*P<0.05 vs control group；##P<0.01 vs control and ADM group

4 討論

乳腺癌依舊是全球女性高發(fā)惡性腫瘤之一，常規(guī)化療或內(nèi)分泌治療等不僅促進(jìn)癌細(xì)胞演化，獲得新的基因組變異[9]，也可通過改變細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，使癌細(xì)胞適應(yīng)不斷變化的腫瘤微環(huán)境，導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物敏感性下降，發(fā)生耐藥[10-12]。

MEK/ERK信號(hào)通路是細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，也是多種藥物抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有利于腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的生存能力[14]。作為UPR的中心調(diào)節(jié)蛋白 GRP78具有的抗凋亡作用可使腫瘤細(xì)胞逃避抗癌藥物的殺傷，導(dǎo)致療效下降。靶向 GRP78誘導(dǎo)凋亡的合成肽 BMTP-78，能選擇性的殺死乳腺癌細(xì)胞，抑制原發(fā)性腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移[15]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，常用的抗腫瘤藥物ADM能引起乳腺癌發(fā)生ERS，上調(diào)乳腺癌細(xì)胞GRP78的表達(dá)，提示ADM激活UPR引起GRP78高表達(dá)是乳腺癌細(xì)胞對(duì)ADM誘導(dǎo)凋亡不敏感的原因之一。

與單用ADM和PD98059相比，二者合用的凋亡率大大增加，說明抑制MEK通路可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)ADM引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑凋亡的敏感性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PD98059抑制ADM對(duì)乳腺癌細(xì)胞GRP78 的上調(diào)表達(dá)，說明抑制ADM對(duì)乳腺癌細(xì)胞UPR的誘導(dǎo)是PD98059增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性原因之一。

可見，UPR信號(hào)通路和MEK/ERK通路的激活是腫瘤耐藥性產(chǎn)生的2個(gè)重要環(huán)節(jié)。有研究結(jié)果指出UPR信號(hào)通路和MEK/ERK通路可能是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和治療腫瘤的重要靶點(diǎn)[16-17]，但UPR在腫瘤耐藥、轉(zhuǎn)移方面的機(jī)制仍需更為深入的研究。本研究提示阻斷MEK/ERK通路的激活可增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)ADM誘導(dǎo)凋亡的敏感性，這一作用與抑制ADM對(duì)乳腺癌細(xì)胞UPR的誘導(dǎo)有關(guān)，為ADM在腫瘤增殖、細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制研究提供新的思路。