胡春生，唐 艷，秦紅霞，楊東林，黃玖紅

[重慶文理學(xué)院藥學(xué)院(創(chuàng)新靶向藥物國際研究院)，創(chuàng)新靶向藥物國家地方聯(lián)合工程中心，重慶 402160]

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。我國約40%的肺腺癌患者發(fā)生EGFR突變，此類患者對酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitorsn，TKI)具有良好的反應(yīng)性，因此臨床上已將EGFR-TKI作為靶向藥物治療非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者EGFR陽性突變的一線治療方案。然而，大部分患者在接受第一、二、三代EGFR-TKI治療以后，約10-12個月出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，制約了EGFR-TKI在臨床上繼續(xù)使用[1]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳機制在基因轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控方面起重要作用。DNA 甲基化異常與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，目前研究認(rèn)為，CpG島甲基化在細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控、基因突變、基因印記等多方面起重要作用。DNA甲基化在腫瘤中處于異常狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等。研究表明，特定基因啟動子區(qū)的超甲基化將引起EGFR-TKI耐藥[2]。地西他濱(decitabine，DE)是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，常常用于治療骨髓增生異常綜合征[3]，但對逆轉(zhuǎn)肺腺癌EGFR-TKI耐藥研究尚少，且其作用機制仍不十分清楚。因此，本文考察了地西他濱對肺腺癌HCC827厄洛替尼(erlotinib，ER)耐藥細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲抑制及細(xì)胞周期阻滯的作用，并探討其主要作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1細(xì)胞株 人肺腺癌細(xì)胞株HCC827/ER耐藥細(xì)胞，采用厄洛替尼低濃度梯度遞增誘導(dǎo)法由重慶文理學(xué)院藥學(xué)院建立并保存，采用MTT法檢測其耐藥倍數(shù)為350倍。

1.1.2試劑 地西他濱(S1200，Selleck)、厄洛替尼(S1023，Selleck)；RPMI 1640培養(yǎng)基(SH30809.01，HyClone)；胎牛血清(NTC-HK022，Natocor)；青鏈霉素(SV30010，HyClone)；胰蛋白酶(2046781，Gibco)；甲基化陽性和陰性對照基因組(3522和3521，Takara)；PCR試劑(RR001，TaKaRa)；基因組DNA提取試劑盒(DP304，天根生化科技有限公司)。

1.1.3儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Model 3111)；熒光顯微鏡(OLYMPUS IX73)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek Cytation 5)；凝膠成像系統(tǒng)(天能Tanon-5200 Multi)；Western blot條帶激光掃描儀(LI-COR Odeyssey)。

1.2 實驗方法

1.2.1MTT法測定細(xì)胞增殖 將對數(shù)生長期的HCC827/ER細(xì)胞用胰酶消化下來，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×107個·L-1，向96孔板中加入100 μL細(xì)胞懸液，CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜使細(xì)胞貼壁；向每孔培養(yǎng)基中加入終濃度為0、0.05、0.5、1、10、25、50 μmol·L-1ER及0、5、10 μmol·L-1DE處理48 h；每孔中加入10 μL MTT試劑后繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄掉上清，加入200 μL DMSO，搖床80 r·min-1振搖30 min；通過酶標(biāo)儀測定570 nm吸光值(optical density，OD值)，細(xì)胞增殖率/%=(OD實驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.2.2BrdU熒光染色 將HCC827/ER細(xì)胞接種于12孔板中，將細(xì)胞分成ER-/DE-、ER+/DE-、ER-/DE+、ER+/DE+4組(ER-、DE-表示加入DMSO，ER+表示加入5 μmol·L-1ER,DE+表示加入10 μmol·L-1DE)，將BrdU加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，終濃度為5 mg·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌2次，用0.1%TritonX-100和10%山羊血清封閉1 h，棄掉封閉液，加入兔抗BrdU一抗4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后加入山羊抗兔二抗(Cy3標(biāo)記)，避光室溫孵育2 h，PBS洗滌后加入DAPI染細(xì)胞核，顯微鏡下觀察、拍照。每組隨機拍5個視野，計算BrdU表達(dá)陽性率。

1.2.3克隆形成 將HCC827/ER細(xì)胞按1 000個/孔接種于6孔板中，將細(xì)胞分成ER-/DE-、ER+/DE-、ER-/DE+、ER+/DE+4組，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，PSB洗滌，然后加入1 mL結(jié)晶紫溶液室溫染色2 min，吸棄染液并用ddH2O洗滌5次。置于掃描儀中拍攝圖片，并進行克隆數(shù)分析。

1.2.4細(xì)胞劃痕和侵襲 細(xì)胞劃痕：使用對數(shù)生長期HCC827/ER細(xì)胞，接種于12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞板時，用細(xì)胞劃痕工具沿孔中線劃線，于劃線后0、12、24 h顯微鏡下觀察拍照。細(xì)胞侵襲：將200 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的對數(shù)期細(xì)胞加入附有Matrigel的Transwell小室，下室加入800 μL完全培養(yǎng)基，并按ER-/DE-、ER+/DE-、ER-/DE+、ER+/DE+分組加入相應(yīng)藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)基，并用無菌棉簽擦拭掉上室底細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定，結(jié)晶紫染色后，置于顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.2.5DNA的硫化修飾及甲基化特異性PCR 收集HCC827/ER細(xì)胞，利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA并定量。取1 μg基因組DNA，加入去離子水補足20 μL，采用甲基化DNA檢測試劑盒對DNA進行處理，簡要步驟如下，向上述DNA樣品中加入2.2 μL的M-Dilution buffer，42 ℃水浴30 min，繼續(xù)加入220 μL CT conversion reagent混勻，80 ℃避光孵育60 min，再加入480 μL M-buffer PA，然后通過DNA吸附柱純化修飾后的DNA，最后溶于20 μL去離子水中。以修飾后的DNA為模板，LMNA甲基化引物(M)：UP 5′-TTTACGTTTGTTAGGAGTA AGTCGA-3′，Down 5′-ATAACCGACAAATTAACAAC GCT-3′。LMNA非甲基化引物(U)：UP 5′-TTTATG TTTGTTAGGAGTAAGTTGA-3′，Down 5′-CCATAACC AACAAATTAACAACACT-3′，進行甲基化特異性PCR。PCR條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；1%瓊脂糖凝膠電泳，80 V，30 min。凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.2.6Western blot分析蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)分別提取ER-/DE-、ER+/DE-、ER-/DE+、ER+/DE+4組HCC827/ER細(xì)胞的總蛋白，并用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量。上樣20 μg總蛋白進行10% SDS-PAGE膠電泳；采用濕轉(zhuǎn)方法(100 V，120 min)將PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗滌5次，每次2 min；laminA/C、CyclinB1、CyclinA2、CyclinD1、CDC2、CDK4、CDK6一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次，每次2 min；對應(yīng)IRDye標(biāo)記二抗稀釋比例為1 ∶10 000，室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，每次2 min；采用LI-COR Odeyssey激光掃描儀檢測目的條帶并分析檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 地西他濱增強HCC827/ER細(xì)胞對厄洛替尼的敏感性MTT法檢測結(jié)果顯示，1、2.5、5、10、20、30、50、100 μmol·L-1的地西他濱處理HCC827/ER細(xì)胞48 h的抑制率都在20%左右，且無劑量依賴效應(yīng)(Fig1A)，因此選擇5、10 μmol·L-1地西他濱用于聯(lián)合用藥實驗。當(dāng)?shù)匚魉麨I聯(lián)合不同濃度厄洛替尼(0.05、0.1、0.5、1、5、10、25、50 μmol·L-1)處理耐藥細(xì)胞，其細(xì)胞抑制率都在50%左右，增加HCC827/ER細(xì)胞對厄洛替尼的敏感性，且無劑量依賴效應(yīng)(Fig1B)。利用Compusyn軟件計算聯(lián)合用藥的聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI值)，結(jié)果顯示CI<1(協(xié)同)，結(jié)果表明地西他濱增強厄洛替尼抑制HCC827/ER耐藥細(xì)胞增殖的作用。

2.2 地西他濱聯(lián)合厄洛替尼抑制HCC827/ER細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示(Fig2A、2B、2C)，劃痕12 h后，細(xì)胞傷痕愈合率在ER-/DE-、ER+/DE-、ER-/DE+、ER+/DE+組分別為(57.3±4.2)%、(49.0±6.6)%、(34.7±2.1)%、(17±2.5)%；劃痕24 h后，各組細(xì)胞傷痕愈合率分別為(96.7±5.8)%、(76.3±1.5)%、(57.3±2.1)%、(45.7±1.5)%。以上結(jié)果表明，地西他濱具有抑制HCC827/ER細(xì)胞遷移的作用。當(dāng)?shù)匚魉麨I與厄洛替尼聯(lián)合使用時可顯著抑制HCC827/ER遷移，與單獨使用地西他濱相比差異具有顯著性。另外，通過細(xì)胞侵襲實驗(Fig2D、2E)，在ER-/DE-、ER+/DE-、ER-/DE+、ER+/DE+組HCC827/ER細(xì)胞穿過Transwell膜的數(shù)量分別為501±9、339±12、253±20、63±15。與DMSO組相比，單獨使用地西他濱對HCC827/ER細(xì)胞侵襲能力具有一定的抑制作用，與厄洛替尼聯(lián)合使用后顯著抑制HCC827/ER細(xì)胞侵襲(P<0.01)。

Fig 1 Decitabine enhanced anti-cancer effect of erlotinib to lung adenocarcinoma HCC827/ER n=6)A：The effect of decitabine on HCC827 and HCC827/ER cell viability.**P<0.01 vs DMSO group；B：The effect of decitabine in combination with erlotinib on cell viablility in HCC827/ER cells.**P<0.01 vs ER group；##P<0.01 vs only 5 μmol·L-1 or 10 μmol·L-1 DE group.

Fig 2 Effect of decitabine in combination with erlotinib on cell migration and invasion in HCC827/ER cells n=3)A：Decitabine,erlotinib alone or both together on the migration in HCC827/ER cell was detected by wound healing assay (×10);B，C：The percentage of wound healing area was analyzed at 12 h and 24 h after scratch；D：Decitabine,erlotinib alone or both together on the invasion in HCC827/ER cell was detected by Transwell(×20)；E：The number of invasion cells was analyzed.*P<0.05,**P<0.01 vs ER-/DE-group.

Fig 3 Effect of decitabine in combination with erlotinib on cell proliferation ability and clonogenicity in vitro n=3)A，B：The cell proliferation ability was detected by BrdU assay(×20);C，D：Colony formation was performed with HCC827/ER cell for two weeks.**P<0.01 vs ER-/DE- group;##P<0.01 vs ER+/DE- or ER-/DE+ group.

2.3 地西他濱聯(lián)合厄洛替尼抑制HCC827/ER細(xì)胞增殖及克隆形成通過BrdU參入實驗(Fig3A、3B)，BrdU/DAPI的比率在ER-/DE-、ER+/DE-、ER-/DE+、ER+/DE+組分別為0.64±0.08、0.39±0.01、0.53±0.19、0.20±0.04。以上結(jié)果表明，單獨應(yīng)用5 μmol·L-1厄洛替尼可抑制HCC827/ER細(xì)胞增殖，聯(lián)合地西他濱后可顯著抑制HCC827/ER細(xì)胞增殖(P<0.01)，然而單用地西他濱(10 μmol·L-1)對耐藥細(xì)胞增殖抑制不明顯。進一步通過克隆形成實驗結(jié)果顯示(Fig3C、3D)，在ER-/DE-、ER+/DE-、ER-/DE+、ER+/DE+組中克隆數(shù)分別為216±15、101±9、129±11、52±8。與厄洛替尼(5 μmol·L-1)和地西他濱(10 μmol·L-1)單藥組相比，聯(lián)合用藥組細(xì)胞細(xì)胞集落數(shù)量和大小形態(tài)均小于單藥處理組。地西他濱聯(lián)合厄洛替尼對HCC827/ER細(xì)胞克隆形成率明顯下降，表明兩藥聯(lián)合對HCC827/ER細(xì)胞的增殖和成瘤能力具有明顯抑制作用。

2.4 地西他濱促進核纖層蛋白laminA/C表達(dá)甲基化特異性PCR檢測了laminA/C基因啟動子區(qū)甲基化情況(Fig4)，在HCC827/ER細(xì)胞中l(wèi)aminA/C基因啟動子區(qū)甲基化水平明顯高于HCC827親本細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示在蛋白水平上，HCC827/ER細(xì)胞中l(wèi)aminA/C蛋白表達(dá)低于HCC827細(xì)胞，這表明啟動子區(qū)高甲基化抑制了laminA/C的蛋白表達(dá)。向HCC827/ER細(xì)胞中加入地西他濱后，抑制了laminA/C啟動子區(qū)甲基化，促進laminA/C蛋白表達(dá)，從而增強了耐藥細(xì)胞對厄洛替尼的敏感性。

Fig 4 Effect of decitabine in combination with erlotinib on methylation of laminA/C promoter and protein expressionA：Expression of laminA/C protein significantly decreased in HCC827/ER cells compared to HCC827 cells；B：Methylation analysis was detected by MSP.“+”:Hypermethylation of the genome,“-”:Low methylation of genome,“M”:Methylation,“U”:Unmethylation;C：LaminA/C protein was detected in HCC827/ER cells treated with decitabine or erlotinib.

Fig 5 Effect of decitabine in combination with erlotinib on cell cyclin related protein expression

2.5 地西他濱聯(lián)合厄洛替尼對細(xì)胞周期蛋白的抑制作用如Fig5所示，在聯(lián)合地西他濱和厄洛替尼的HCC827/ER細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白CyclinA2、CyclinB1、CyclinD1表達(dá)下調(diào)，同時協(xié)同蛋白CDC2、CDK4、CDK6表達(dá)也下調(diào)；周期抑制P21蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)果表明聯(lián)合地西他濱與厄洛替尼可通過細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖，促進HCC827/ER耐藥細(xì)胞死亡。

3 討論

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，核纖層蛋白laminA/C在肺腺癌HCC827/ER厄洛替尼耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)顯著低于親本細(xì)胞HCC827。在此基礎(chǔ)上，通過甲基化特異性PCR發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞中l(wèi)aminA/C啟動子區(qū)甲基化修飾高于親本細(xì)胞，且地西他濱能夠抑制laminA/C啟動子區(qū)甲基化修飾，促進laminA/C蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)HCC827/ER細(xì)胞對厄洛替尼的耐藥。以上結(jié)果表明超甲基化修飾抑制laminA/C蛋白表達(dá)，從而促進細(xì)胞厄洛替尼耐藥。本研究通過深入研究去甲基化酶抑制劑地西他濱逆轉(zhuǎn)肺腺癌厄洛替尼的耐藥及機制，以期為肺腺癌患者EGFR-TKI耐藥后精準(zhǔn)治療提供理論基礎(chǔ)。

非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI獲得性耐藥機制涉及多基因、多途徑的復(fù)雜調(diào)控過程，部分耐藥機制尚不明確。已有大量文獻(xiàn)報道EGFR-TKI耐藥機制主要集中在以下幾個方面[4-8]：(1)EGFR基因的二次突變(T790M突變、C797S突變等)，其中第一、二代EGFR-TKI發(fā)生T790M突變。針對T790M突變的第三代EGFR-TKI藥物在使用10個月左右患者發(fā)生C797S突變，病情再次出現(xiàn)進展；(2)c-MET及HER2原癌基因擴增，該類基因擴增可導(dǎo)致下游PI3K/AKT信號通路異?；罨鹉[瘤對EGFR-TKI耐藥；(3)K-Ras基因突變，其基因的活化突變會導(dǎo)致患者對EGFR-TKI耐藥；(4)PTEN功能缺陷，其抑癌作用喪失，導(dǎo)致EGFR-TKI無法下調(diào)凋亡基因，從而引起腫瘤耐藥；(5)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在耐藥發(fā)生過程中，伴隨著上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)改變，同時伴有上皮標(biāo)志物減少和間質(zhì)標(biāo)志物增多。本課題組前期研究和相關(guān)文獻(xiàn)報道顯示，肺腺癌HCC827細(xì)胞EGFR-TKI耐藥后發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，主要表現(xiàn)E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)[9]。同時，本研究結(jié)果顯示，HCC827/ER耐藥細(xì)胞中核纖層蛋白laminA/C表達(dá)顯著低于親本細(xì)胞株，該發(fā)現(xiàn)提示laminA/C可能參與EMT過程介導(dǎo)EGFR-TKI耐藥。

本研究發(fā)現(xiàn)，利用地西他濱處理HCC827/ER耐藥細(xì)胞以后，提高核纖層蛋白laminA/C表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)HCC827/ER對厄洛替尼的耐藥性，降低耐藥細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力。laminA/C的研究主要集中在早老癥上，但近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中的laminA/C表達(dá)量明顯低于癌旁組織或正常組織，在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用[10-13]。Nardella和Cicchillitti課題組都發(fā)現(xiàn)laminA/C的低表達(dá)增加腫瘤細(xì)胞的惡性程度[11,14]。Zhang等[15]通過上調(diào)乳腺癌細(xì)胞laminA/C表達(dá)引起細(xì)胞骨架排列改變促進懸浮乳腺癌細(xì)胞快速貼壁，表明laminA/C對腫瘤轉(zhuǎn)移具有抑制作用。既往的研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌患者的基因組中存在高甲基化修飾。因此，非小細(xì)胞肺癌PC9/GR耐藥細(xì)胞株用去甲基化藥物5-Aza-cdR處理以后，可恢復(fù)對吉非替尼的敏感性，這可能抑制EGFR啟動子區(qū)甲基化水平有關(guān)[16]。另外，聯(lián)合使用去甲基化藥物5-Aza-cdR可以增強肺腺癌原發(fā)耐藥細(xì)胞株H1650、H1299對吉非替尼的敏感性[17]。laminA/C在肺腺癌中呈現(xiàn)表達(dá)降低的趨勢，這與其基因啟動子區(qū)高甲基化相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在耐藥細(xì)胞中l(wèi)aminA/C啟動子區(qū)甲基化水平高于親本細(xì)胞，抑制laminA/C蛋白表達(dá)導(dǎo)致HCC827細(xì)胞對厄洛替尼產(chǎn)生耐藥。利用地西他濱處理耐藥細(xì)胞后可抑制laminA/C啟動子區(qū)甲基化水平，增加laminA/C蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)HCC827/ER細(xì)胞對厄洛替尼的耐藥性，但laminA/C在調(diào)控肺腺癌EGFR-TKI耐藥中的機制還需深入研究。

EGFR受體被配體激活后，引起下游信號通路PI3K/AKT、Ras/MEK/MAPK等調(diào)控細(xì)胞增殖與分化、遷移與侵襲等[18]。HCC827/ER耐藥細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白相關(guān)蛋白CyclinA2、CyclinB1、CyclinD1、CDK4、CDK6表達(dá)上調(diào)，促進耐藥細(xì)胞增殖；單獨使用厄洛替尼或地西他濱處理HCC827/ER耐藥細(xì)胞，其相關(guān)周期蛋白表達(dá)與DMSO對照組相比無明顯差異，但地西他濱聯(lián)合厄洛替尼可顯著抑制周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進周期抑制P21蛋白表達(dá)，使耐藥細(xì)胞周期受到阻滯，引起細(xì)胞死亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)地西他濱可逆轉(zhuǎn)肺腺癌HCC827/ER細(xì)胞對厄洛替尼的耐藥性，主要通過抑制laminA/C啟動子區(qū)DNA甲基化水平，促進laminA/C蛋白表達(dá)，對細(xì)胞周期進行調(diào)控，抑制耐藥細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，為非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI耐藥后用藥提供理論依據(jù)。