徐英杰，文雪倩，馮璐瑤，田 鑫

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450052)

RNA轉(zhuǎn)錄后修飾作為表觀遺傳領(lǐng)域研究的前沿和熱點(diǎn)，近年來受到了越來越多的關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)的170多種RNA轉(zhuǎn)錄后修飾中，2/3為甲基化修飾，包括m1A、m6A、m5C和m7G等。RNA的5-甲基胞嘧啶(m5C)甲基化修飾是指RNA胞嘧啶上第五位碳原子上發(fā)生甲基化，于上世紀(jì)70年代在rRNA中發(fā)現(xiàn)，后來相繼在轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA),信使RNA(mRNA),和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)上發(fā)現(xiàn)[1]。RNA的m5C修飾在細(xì)胞中廣泛存在，且對(duì)基因的表達(dá)、RNA的穩(wěn)定性等起著重要的調(diào)控作用。此外m5C甲基化和原癌基因的激活有密切聯(lián)系，m5C修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2等在腫瘤組織和癌旁組織中存在差異表達(dá)。本文綜述了m5C甲基化在各種類型RNA中的分布和功能，并介紹了m5C甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 m5C甲基化修飾，見Fig1。

Fig 1 The dynamic regulation of m5C in RNA and function of regulating mRNA export

RNA的m5C甲基化修飾受到甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化轉(zhuǎn)移酶的動(dòng)態(tài)調(diào)控，在甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，RNA發(fā)生m5C修飾，而后與識(shí)別蛋白相結(jié)合發(fā)揮出特定的生物學(xué)功能[1]。m5C修飾主要的甲基轉(zhuǎn)移酶包括NSUN1、NSUN2、NSUN3、NSUN4、NSUN5和NSUN7，以及DNMT2，其共有的特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)上都具有一個(gè)保守的半胱氨酸殘基，能夠在甲基化供體S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的幫助下催化各種類型的RNA發(fā)生m5C甲基化修飾[2]。

1.1 甲基化轉(zhuǎn)移酶NSUN家族蛋白是近年來研究較為廣泛的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶。人的NSUN家族蛋白共有七個(gè)成員，都具有m5C甲基轉(zhuǎn)移功能結(jié)構(gòu)域，并含有兩個(gè)催化甲基轉(zhuǎn)移功能所必須的半胱氨酸。NSUN家族催化甲基轉(zhuǎn)移的共有機(jī)制為首先在甲基化轉(zhuǎn)移酶的半胱氨酸和RNA的胞嘧啶之間發(fā)生共價(jià)結(jié)合形成共價(jià)中間體，然后富電子的胞嘧啶環(huán)對(duì)SAM上的甲基發(fā)生親核加成，最終完成甲基化。

NSUN1主要定位于細(xì)胞核中，早期研究發(fā)現(xiàn)NSUN1在酵母中主要催化25s rRNA的C2870位點(diǎn)發(fā)生m5C甲基化，并且在功能上影響60s rRNA的成熟。最近有研究表明，NSUN1可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HIV-1病毒的Tar RNA，并催化其發(fā)生m5C甲基化最終抑制病毒DNA的轉(zhuǎn)錄[3]。

NSUN家族中研究最為廣泛的是NSUN2，NSUN2主要定位在細(xì)胞核中，在胚胎發(fā)育細(xì)胞分化及腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)在已有證據(jù)表明NSUN2可以催化多種類型的RNA發(fā)生m5C甲基化，包括tRNA、mRNA和非編碼RNA。在生物學(xué)功能方面也有研究表明NSUN2在小鼠胚胎的發(fā)育和細(xì)胞的分化過程也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，例如NSUN2在小鼠胚胎中發(fā)生缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠發(fā)育遲緩和組織分化缺陷。NSUN2還可以催化HIV病毒轉(zhuǎn)錄本發(fā)生m5C甲基化，敲除NSUN2會(huì)影響HIV病毒轉(zhuǎn)錄本的可變剪切，進(jìn)而抑制HIV病毒轉(zhuǎn)錄本的翻譯，說明m5C甲基化不僅在胚胎發(fā)育中發(fā)揮著調(diào)控作用，在病毒的生命周期中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[2，4]。

NSUN3主要定位于線粒體中，特異性催化線粒體tRNA的C34位胞嘧啶發(fā)生m5C甲基化。已有研究表明NSUN3缺失導(dǎo)致tRNA上甲基化減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的翻譯過程受阻。也有證據(jù)表明小鼠胚胎干細(xì)胞中的NSUN3缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)外胚層的能力受損。在人體中有研究表明線粒體呼吸鏈復(fù)合物缺陷患者中廣泛存在NSUN3突變，這直接導(dǎo)致線粒體tRNA上的C34缺乏m5C修飾最終導(dǎo)致線粒體翻譯功能受損[5]。

NSUN4和NSUN5均為rRNA特異性的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶，其中NSUN4定位于線粒體中，由NSUN4和NSUN5介導(dǎo)的rRNA上的m5C甲基化均和rRNA的組裝和成熟有關(guān)。且NSUN4還可以和Mterf4形成復(fù)合物參與線粒體中核糖體大小亞基的組裝過程，直接影響rRNA的成熟。NSUN5與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)，有研究表明NSUN5敲除的小鼠會(huì)發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，表現(xiàn)為空間認(rèn)知障礙[2]。

NSUN6為tRNA特異性甲基轉(zhuǎn)移酶，定位于細(xì)胞質(zhì)中，其功能和tRNA的剪切成熟相關(guān)。在腫瘤中，有研究報(bào)道NSUN6在睪丸癌、甲狀腺癌、肝癌和卵巢癌中表達(dá)降低，低表達(dá)NSUN6往往提示預(yù)后較差。此外，還有研究報(bào)道NSUN6可以和LLGL2以及l(fā)ncRNA MAYA形成復(fù)合物，催化Hippo信號(hào)通路中的核心蛋白MST1發(fā)生甲基化進(jìn)而破壞其激酶活性，最終導(dǎo)致原癌基因YAP被激活并積聚在核內(nèi)以促進(jìn)與腫瘤細(xì)胞增殖和骨轉(zhuǎn)移有關(guān)的靶基因表達(dá)[6]。

NSUN7在細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞核，在維持精子的正常功能中發(fā)揮重要作用，成年雄性小鼠的NSUN7發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致精子活力受損和不育。此外，NSUN7可以催化與轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α相互作用的eRNA發(fā)生m5C甲基化，敲低NSUN7會(huì)導(dǎo)致PGC-1α靶基因相關(guān)eRNA含量減少，進(jìn)而導(dǎo)致靶基因表達(dá)量減少[7]。

Dnmt2是一種tRNA和mi-RNA的甲基轉(zhuǎn)移酶，主要位于細(xì)胞核中。Dnmt2可以催化tRNA上C38位發(fā)生m5C修飾，在NSUN2和Dnmt2雙敲除小鼠中可以觀察到tRNA上缺失m5C修飾，進(jìn)而導(dǎo)致tRNA穩(wěn)定性和蛋白翻譯速率的下降。在成纖維細(xì)胞中敲低Dnmt2導(dǎo)致細(xì)胞增殖相關(guān)的miR-28-3p、miR-34a-3p上調(diào)，會(huì)使細(xì)胞更容易受到氧化應(yīng)激和DNA損傷。有研究表明Dnmt2敲除會(huì)導(dǎo)致斑馬魚視網(wǎng)膜、肝和腦分化缺陷，在小鼠中敲除Dnmt2會(huì)導(dǎo)致小鼠軟骨內(nèi)骨化、心肌肥厚和造血系統(tǒng)分化缺陷，表明Dnmt2介導(dǎo)的m5C甲基化和細(xì)胞的分化以及組織的發(fā)育過程密切相關(guān)[8]。

1.2 m5C去甲基化酶目前對(duì)于DNA的去甲基化過程和去甲基酶TET家族已經(jīng)有了比較清楚的認(rèn)識(shí)，主要機(jī)制為TET在α酮戊二酸和二價(jià)鐵離子的的協(xié)同作用下催化DNA上的5-mC甲基發(fā)生去甲基化，同時(shí)在這個(gè)過程中還會(huì)產(chǎn)生5-hmC、5-ac等中間產(chǎn)物。最近有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細(xì)胞中敲除TET2會(huì)導(dǎo)致tRNA上的hm5C水平顯著降低，而過表達(dá)TET2則會(huì)導(dǎo)致tRNA上的hm5C水平升高，m5C水平降低，同時(shí)體外研究發(fā)現(xiàn)TET2催化tRNA上的m5C修飾發(fā)生氧化還會(huì)促進(jìn)翻譯過程[9]。

還有研究表明，m1A的去甲基酶ALKBH1可以催化線粒體tRNA上C34位的m5C修飾發(fā)生羥基化轉(zhuǎn)化為hm5C，再氧化為f5C。在293T細(xì)胞中敲除ALKBH1可以導(dǎo)致線粒體tRNA上f5C修飾減少，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體翻譯功能和呼吸功能受損[10]。說明ALKBH1介導(dǎo)的m5C去甲基化作用在維持線粒體正常功能中發(fā)揮重要作用。

1.3 m5C識(shí)別蛋白已經(jīng)報(bào)道的m5C甲基化識(shí)別蛋白主要包括調(diào)控出核的ALYREF、參與DNA損傷修復(fù)的RAD52以及調(diào)控RNA穩(wěn)定性的YBX1[11]。ALYREF作為m5C甲基化的識(shí)別蛋白，可以在細(xì)胞核內(nèi)與具有m5C修飾的mRNA特異性結(jié)合形成mRNPs復(fù)合體促進(jìn)mRNA的出核，在ALYREF敲減的細(xì)胞系中，具有m5C修飾的mRNA在細(xì)胞核內(nèi)聚集，而這種聚集只能被回補(bǔ)野生型的ALYREF所取消，回補(bǔ)突變型的ALYREF則不發(fā)生改變，進(jìn)一步驗(yàn)證了ALYREF通過識(shí)別和結(jié)合具有m5C修飾的mRNA發(fā)揮其促進(jìn)mRNA出核的功能[11]。另有研究報(bào)道YBX1作為另一種m5C甲基化修飾的識(shí)別蛋白，可以在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的母源-合子轉(zhuǎn)換期特異的結(jié)合具有m5C修飾的mRNA并維持其穩(wěn)定性[12]。

此外有研究表明m5C甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT2可以特異性催化位于DNA損傷位點(diǎn)處的RNA發(fā)生m5C修飾。而RAD52作為m5C修飾的識(shí)別蛋白和DNA損傷位點(diǎn)的m5C修飾特異性的結(jié)合，從而參與后續(xù)的同源重組修復(fù)過程。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，m5C在同源重組修復(fù)中的作用和腫瘤細(xì)胞對(duì)放射療法和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑(PARPi)療法的敏感性有關(guān)，伴隨DNMT2丟失的同源重組缺陷型腫瘤對(duì)PARP抑制劑較為敏感[13]。上述研究表明m5C修飾在RNA出核、早期胚胎發(fā)育、DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。

2 m5C甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

近年來越來越多的研究表明，m5C甲基化及其修飾酶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。由于技術(shù)的限制，早期的大多數(shù)的研究集中在和m5C甲基化相關(guān)的修飾蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用。例如m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2在乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且和預(yù)后有密切聯(lián)系。而近年來的研究則更多的集中在特定位點(diǎn)的m5C修飾在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮的作用。

2.1 m5C甲基化在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用在膀胱癌中，相較于癌旁組織，癌組織中m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2和m5C識(shí)別蛋白YBX1高表達(dá)，使得癌基因HDGF上m5C甲基化修飾水平升高，而YBX1可以特異性識(shí)別HDGF mRNA上具有m5C修飾的位點(diǎn)并招募ELAVL1發(fā)揮其維持mRNA穩(wěn)定性的功能，最終使得原癌基因HDGF穩(wěn)定高表達(dá)。臨床數(shù)據(jù)也證明了NSUN2、YBX1和HDGF高表達(dá)的患者具有較差的預(yù)后，說明了由NSUN2介導(dǎo)的m5C甲基化在膀胱癌中起到了促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的作用[4]。

2.2 m5C甲基化在皮膚鱗狀細(xì)胞癌起始細(xì)胞中的作用

在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，NSUN2被發(fā)現(xiàn)在腫瘤起始細(xì)胞(tumour-initiating cells)中相較于高分化腫瘤細(xì)胞低表達(dá)，此外還發(fā)現(xiàn)在腫瘤起始細(xì)胞中，蛋白合成速率較低，這與之前關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的報(bào)道是一致的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蛋白合成速率的降低可能是由NSUN2低表達(dá)導(dǎo)致tRNA上的m5C甲基化發(fā)生缺失，最終使腫瘤起始細(xì)胞具有一定的干細(xì)胞特性，說明m5C甲基化對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性發(fā)揮著重要作用[14-15]。

2.3 m5C甲基化在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用有研究表明NSUN1、NSUN4、NSUN5，NSUN6和NSUN7在正常腦組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在差異表達(dá)，結(jié)合病理分級(jí)信息后發(fā)現(xiàn)NSUN1和NSUN4在較高級(jí)別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著高于低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤，且m5C甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)譜和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床病理特征以及預(yù)后密切相關(guān)，表明m5C甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)可以作為判斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的標(biāo)志[16]。另有研究報(bào)道神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在由于NSUN5基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島區(qū)域高甲基化而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄沉默，且這種轉(zhuǎn)錄沉默和膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后呈現(xiàn)一定相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NSUN5作為28s rRNA上C3782位點(diǎn)的的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶，其轉(zhuǎn)錄沉默會(huì)導(dǎo)致該位點(diǎn)的m5C甲基化發(fā)生缺失，進(jìn)而導(dǎo)致rRNA的構(gòu)象發(fā)生改變，最終使得整體蛋白翻譯水平的下調(diào)，氧化應(yīng)激相關(guān)的醌氧化還原酶1(Nqo1)翻譯水平上調(diào)，說明m5C甲基化和腫瘤細(xì)胞在壓力應(yīng)激條件下的生存密切相關(guān)[17]。

2.4 m5C甲基化在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用在肝癌中發(fā)現(xiàn)包括mRNA、microRNA、lncRNA等多種類型RNA上的m5C修飾在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN4，識(shí)別蛋白ALYREF等和肝癌的預(yù)后密切相關(guān)[18]。研究發(fā)現(xiàn)相較于癌旁組織，癌組織中H19 lncRNA的表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這是由于NSUN2介導(dǎo)的H19 lncRNA上的m5C修飾可以使H19 lncRNA的穩(wěn)定性升高。具有m5C修飾的H19 lncRNA可以特異性結(jié)合G3BP1蛋白，進(jìn)一步導(dǎo)致癌蛋白Myc的積累，促進(jìn)肝癌的發(fā)生及發(fā)展[19]。

2.5 m5C甲基化在肺癌中的作用在肺腺癌中，有研究報(bào)道NSUN1存在高表達(dá)，且可以用作判斷預(yù)后的標(biāo)志物[20]。還有研究報(bào)道，m5C識(shí)別蛋白YBX1的表達(dá)量和肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性有關(guān)，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中敲減YBX1可以通過抑制自噬進(jìn)而增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[21]。

2.6 m5C甲基化在胃癌、大腸癌和結(jié)直腸癌中的作用有多項(xiàng)研究表明，在胃癌和結(jié)直腸癌中，NSUN2存在異常高表達(dá)，且和患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[22]。NSUN2的過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，而敲減NSUN2則可以抑制這些過程[23]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因p57作為NSUN2的下游靶點(diǎn)影響了腫瘤細(xì)胞的增殖能力。在細(xì)胞中，p57的表達(dá)和NSUN2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，高表達(dá)的NSUN2通過催化p57 mRNA的3 ′UTR區(qū)域發(fā)生 m5C甲基化降低了mRNA的穩(wěn)定性，抑制了p57的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[24]。另有研究表明在HeLa細(xì)胞系中敲除NSUN2會(huì)影響細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性，說明NSUN2可能與腫瘤對(duì)藥物的敏感性以及耐藥有關(guān)。此外，NSUN5在大腸癌中明顯高表達(dá)，研究表明在大腸癌細(xì)胞系中敲除NSUN5后會(huì)通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)信號(hào)傳導(dǎo)造成細(xì)胞周期阻滯，顯著抑制細(xì)胞增殖[25]。

2.7 m5C甲基化在血液腫瘤中的作用m5C去甲基化酶TET是血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的高頻突變基因之一，TET2突變會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞的發(fā)育以及正常的造血功能受損[26]。已有多項(xiàng)研究表明，TET2作為抑癌基因起到腫瘤抑制的作用，TET2敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)慢性粒單核細(xì)胞白血病和骨髓增生性腫瘤，表明TET2抑制腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。另有研究報(bào)道，在白血病中m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN1通過和BRD4相互作用改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)從而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物5-氮雜胞苷的敏感性[28]。

2.8 小結(jié)綜上所述，m5C甲基化及其相關(guān)的修飾酶和識(shí)別蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的多個(gè)環(huán)節(jié)均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，且一種甲基化轉(zhuǎn)移酶在不同的腫瘤類型可能發(fā)揮著不同的作用。例如，雖然大多數(shù)m5C甲基轉(zhuǎn)移酶在腫瘤中高表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[4,20]。但也有m5C修飾酶在腫瘤中低表達(dá)，同時(shí)伴隨著較差的預(yù)后[29]。因此特定位點(diǎn)m5C修飾以及不同的m5C修飾酶在腫瘤中發(fā)揮的具體作用仍有待深入研究。

3 展望

目前，對(duì)于m5C甲基化在各種RNA中的分布特征以及m5C修飾的生物學(xué)功能已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí)。因此未來的研究任務(wù)主要集中在特定m5C甲基化位點(diǎn)的功能和發(fā)現(xiàn)新的識(shí)別蛋白，以及m5C修飾在腫瘤等疾病中發(fā)揮的具體作用。目前對(duì)一些m5C甲基化修飾酶和識(shí)別蛋白的蛋白晶體結(jié)構(gòu)以及其與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域已經(jīng)有了較為清晰的研究[4]，以m5C甲基化相關(guān)修飾酶作為靶點(diǎn)的抑制劑研究已成為關(guān)注熱點(diǎn)。此外，已有多項(xiàng)研究表明，m5C相關(guān)修飾酶可以作為腫瘤的診斷標(biāo)志物[18,20,22]，而特定位點(diǎn)的m5C修飾作為腫瘤標(biāo)志物尚需進(jìn)一步探索?？傊琺5C甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用逐漸被揭示，將為腫瘤的診斷和個(gè)體化治療提供新的思路。