相佳瑤，許 敏，馮 陽

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)為嗜肝DNA病毒，HBV感染會引發(fā)乙型病毒性肝炎，如果缺乏及時有效的治療，會導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)等嚴(yán)重后果，甚至危及患者生命[1]。盡管疫苗能有效預(yù)防HBV的感染，但是疫苗對已經(jīng)感染HBV的患者無效。目前仍存在大量HBV感染患者，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界約有2.57億人為慢性乙肝病毒感染者[2]。現(xiàn)在臨床上使用的抗HBV藥物主要有干擾素(interferon，IFN)與核苷(酸)類藥物兩大類，分別通過調(diào)節(jié)免疫和干擾乙肝病毒的復(fù)制過程來發(fā)揮作用，但是核苷(酸)類藥物產(chǎn)生的耐藥性問題和IFN的副作用一直是當(dāng)前治療HBV的局限所在，臨床仍缺乏能治愈HBV感染的有效藥物。因此，繼續(xù)研究和開發(fā)新穎且有效的抗HBV藥物，尋找干預(yù)HBV感染和復(fù)制的新靶點(diǎn)和新方法仍是非常有必要也非常有意義的研究工作。

天然化合物因其結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性是發(fā)現(xiàn)新藥或新的藥物先導(dǎo)分子的重要源泉[3]。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)記載了將一些中草藥用于乙型病毒性肝炎的治療[4-6]；在現(xiàn)代藥學(xué)的相關(guān)研究中，有很多研究報道了天然化合物具有抑制HBV活性，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。本文從天然化合物調(diào)控HBV自身因子和調(diào)控宿主相關(guān)因子兩方面，對近年來關(guān)于天然化合物抗HBV作用機(jī)制研究的情況進(jìn)行總結(jié)，以期為抗HBV新藥的研發(fā)提供一定的參考。

1 HBV的形態(tài)及感染過程

HBV屬于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)，是一種DNA包膜病毒，基因組為3.2 kb的部分雙鏈環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)。其感染宿主的過程大概為：HBV與細(xì)胞表面受體結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞，在核孔處核衣殼分解釋放出rcDNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核；在DNA聚合酶等的作用下[7]，rcDNA的缺口被補(bǔ)齊，形成共價閉合環(huán)狀DNA (eovalently closed circular DNA，cccDNA)。隨后，宿主細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶II以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄出4種mRNA，其中最長的轉(zhuǎn)錄物為前基因組RNA(pgRNA)，除了作為翻譯的模板外，還作為病毒反轉(zhuǎn)錄模板合成新的rcDNA。新形成的rcDNA與核心蛋白形成成熟的核心顆粒，再裹上包膜蛋白成為成熟的病毒顆粒分泌到細(xì)胞外。另外一小部分核心顆粒脫去核衣殼回到細(xì)胞核，再次轉(zhuǎn)化為cccDNA儲存在肝細(xì)胞核中[8]。

概括來說，HBV的生命周期主要包括感染、脫殼、轉(zhuǎn)錄復(fù)制、裝配和釋放(Fig1)。從理論上講，上述病毒周期的每個步驟均可作為抗肝炎藥物篩選的靶標(biāo)。然而，由于HBV的獨(dú)特性，直接作用于HBV生命周期的分子總會被耐藥性和毒性困擾。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了間接干擾HBV生命周期的靶點(diǎn)或是誘導(dǎo)宿主積極應(yīng)對的機(jī)制[9-13]。例如，鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)，HBV衣殼蛋白的裝配(核心蛋白二聚化基序及裝配結(jié)構(gòu)域的N-端149個氨基酸殘基沒有人體蛋白質(zhì)同源序列)，HBV生命周期息息相關(guān)的宿主蛋白Hsp70，與機(jī)體免疫相關(guān)的Toll-like受體等，為抗HBV提供了新的靶點(diǎn)。

Fig 1 The hepatitis B virus life cycle and therapeutic interventions

2 天然化合物抗HBV作用機(jī)制研究進(jìn)展

自然界中天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)豐富，生物多樣性豐富。迄今為止，發(fā)現(xiàn)了許多的抗HBV活性的天然分子，骨架類型涉及萜類、木脂素類、生物堿類、酚酸類和黃酮類等[14]。但是，開展了系統(tǒng)作用機(jī)制研究的天然分子不多，也未見綜述系統(tǒng)討論天然分子抗HBV作用機(jī)制的研究進(jìn)展。因此，本文將從靶向HBV自身生命周期和宿主細(xì)胞相關(guān)蛋白兩方面，總結(jié)天然產(chǎn)物抗HBV的活性和作用機(jī)制。

2.1 通過調(diào)節(jié)HBV自身的生命周期而發(fā)揮抗HBV活性Huang等[15]從天胡荽(Hydrocotylesibthorpioides)中發(fā)現(xiàn)積雪草苷(asiaticoside)能顯著抑制HBsAg、HBeAg、HBV DNA和cccDNA的形成，且呈劑量依賴性。通過對其作用機(jī)制的初步探索發(fā)現(xiàn)，積雪草苷可能通過抑制C、S和X基因啟動子的活性來影響相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和病毒的復(fù)制。此外，當(dāng)使用感染乙肝病毒的鴨來評估積雪草苷的抗HBV活性時，發(fā)現(xiàn)積雪草苷可以有效抑制DHBV在鴨體內(nèi)的復(fù)制。有趣的是，終止藥物治療3 d后的結(jié)果表明，積雪草苷在鴨體內(nèi)的抗HBV作用在抑制HBV DNA、HBsAg和HBeAg反彈方面比拉米夫定更有效。這一發(fā)現(xiàn)表明積雪草苷的長時間活性可能具有重要的臨床意義。

Wang等[16]發(fā)現(xiàn)從白首烏(Cynanchumauriculatum)中分離出來的告達(dá)亭苷元(caudatin)有抑制HBsAg分泌和HBV DNA復(fù)制的活性，在告達(dá)亭苷元基礎(chǔ)上做了化學(xué)修飾合成了一系列新的化合物，發(fā)現(xiàn)化合物3-O-(3,4,5-三甲基)肉桂酰基告達(dá)亭苷元(3-O-(3,4,5-trimethoxy)cinnamoyl caudatin)對HBsAg、HBeAg的分泌和HBV DNA復(fù)制具有顯著抑制活性，IC50分別為5.52、5.52、2.44 μmol·L-1。初步的機(jī)制探索發(fā)現(xiàn)，3-O-(3,4,5-三甲基)肉桂?；孢_(dá)亭苷元可能是通過干擾HBV X啟動子和增強(qiáng)子I來影響X基因的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮抗病毒作用。考慮到最小X啟動子序列與增強(qiáng)子I的3'端有大約20個核苷酸重疊，推測3-O-(3,4,5-三甲基)肉桂?；孢_(dá)亭苷元同時影響了重疊區(qū)域的X啟動子和增強(qiáng)子I。

從臺灣杉中(Taiwaniacryptomerioides)分離出的HE-145(helioxanthin)及其類似物曾被報道能降低HBV DNA和RNA的水平，并且減少了核心蛋白的表達(dá)[17-18]。進(jìn)一步探索HE-145抗HBV的作用機(jī)制，利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)研究HE-145對4種病毒啟動子活性的影響。結(jié)果表明，HE-145選擇性抑制了S基因啟動子II (SPII)和C基因啟動子(CP)，但對S基因啟動子I (SPI)和X基因啟動子(Xp)無影響。在非肝細(xì)胞如293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中未觀察到HE-145對SPII或CP啟動子的抑制，這表明HE-145對SPII和CP的抑制作用可能是肝特異性的。HBV preC/C啟動子/Enh II區(qū)域包含許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中許多順式元件已被證明在病毒基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。電泳遷移率試驗(yàn)(EMSA)表明，HE-145降低了HepA2 細(xì)胞核提取物與CP上幾個順式作用元件的DNA結(jié)合活性，包括α-甲胎蛋白轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)；過表達(dá)PPAR和肝細(xì)胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF4α)可緩解HE-145對CP的抑制。這些結(jié)果表明，HE-145具有獨(dú)特的抗HBV機(jī)制，可能成為一類新型的潛在抗HBV藥物。

2.2 通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞相關(guān)因子而發(fā)揮抗HBV活性Pang等[19]發(fā)現(xiàn)綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)能顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg，并且呈劑量和時間依賴性；同時EGCG還顯著降低了細(xì)胞外HBV DNA的表達(dá)水平。此外Huang等[20]研究發(fā)現(xiàn)EGCG(50 μmol·L-1)能抑制80%以上的HBV進(jìn)入永生化人原代肝細(xì)胞，并能顯著抑制HBV對表達(dá)HA-NTCP的Huh7細(xì)胞和HuS-E/2細(xì)胞的感染。用EGCG處理表達(dá)HA-NTCP的Huh7細(xì)胞，導(dǎo)致其中HA-NTCP蛋白的表達(dá)降低，進(jìn)一步對細(xì)胞膜上的HA-NTCP表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，EGCG處理顯著誘導(dǎo)了NTCP從細(xì)胞這膜向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，表明EGCG可能誘發(fā)了NTCP的內(nèi)吞和降解。

Yao等[21]研究發(fā)現(xiàn)從白頭翁(Pulsatillachinensis)中提取的樺木酸(betulinicacid，BetA)有抑制HBV DNA復(fù)制的作用。在來自HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞中，樺木酸通過下調(diào)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2，SOD2)的表達(dá)來顯著抑制HBV的復(fù)制，并導(dǎo)致活性氧自由基生成和線粒體功能障礙。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，BetA是通過使cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)的Ser133去磷酸化來抑制SOD2的表達(dá)，因?yàn)镃REB的Ser133處于磷酸化狀態(tài)時才能激活SOD2轉(zhuǎn)錄。過表達(dá)SOD2消除了BetA對HBV復(fù)制的抑制作用，而抑制SOD2表達(dá)則消除了這種作用，這些結(jié)果表明樺木酸介導(dǎo)的HBV清除是由于對線粒體氧化還原平衡的調(diào)節(jié)。在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，BetA和白頭翁粗提物均顯著抑制了SOD2的表達(dá)、增強(qiáng)了肝組織中活性氧的產(chǎn)生，隨后大量清除了HBV，這為上述關(guān)于BetA調(diào)節(jié)線粒體氧化還原平衡的推論提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

Huang等[22]在HepG2.2.15細(xì)胞和HBV感染的Huh7細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，從闊葉山麥冬(Liriopeplatyphylla)根部提取出的化合物3-(4'-羥基芐基)-5,7-二羥基-6-甲基苯并吡喃-4-酮(LPRP-Et-97543)具有潛在的抗HBV活性，對pgRNA和preS/S RNA的表達(dá)水平有明顯的抑制，并能顯著降低C、S、preS等基因啟動子活性，但對X基因啟動子無影響。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析發(fā)現(xiàn)，LPRP-Et-97543特異性抑制了NF-κB的啟動子活性，降低了p65/p50的蛋白表達(dá)水平，同時增加了NF-κB抑制物IκBα的蛋白水平。NF-κB活性被抑制從而影響了其對HBV相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的激活作用?？偟膩碚f，該研究發(fā)現(xiàn)LPRP-Et-97543可能通過干擾宿主細(xì)胞NF-κB信號通路進(jìn)而抑制HBV基因表達(dá)來發(fā)揮抗HBV的作用。

Wu等[23]從六棱菊[Laggeraalata(D.Don)Sch.-BipexOlivier]中分離出的化合物3,4-O-二咖啡?？崴?3,4-O-dicaffeoylquinic acid)和化合物3,5-O-二咖啡?？崴?3,5-O-dicaffeoylquinic acid)[24]能顯著抑制HBV HBsAg和HBeAg的生成。在HepG2.2.15細(xì)胞和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中，3,4-O-二咖啡?？崴岷?,5-O-二咖啡酰奎尼酸能顯著降低HBV cccDNA的含量，并顯著誘導(dǎo)血紅素氧合酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)的表達(dá)。在肝細(xì)胞中，過表達(dá)HO-1能顯著降低HBV核心蛋白的穩(wěn)定性，并在轉(zhuǎn)錄后階段有效抑制HBV的復(fù)制，阻斷細(xì)胞核中HBV cccDNA的重新填充，從而導(dǎo)致cccDNA含量減少；運(yùn)用RNAi技術(shù)降低細(xì)胞中HO-1基因表達(dá)后這種效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)，這些研究結(jié)果表明HO-1確實(shí)介導(dǎo)了3,4-O-二咖啡?？崴岷?,5-O-二咖啡酰奎尼酸的抗HBV作用[25]。

天然酚類化合物姜黃素(curcumin)被發(fā)現(xiàn)可以抑制HBV基因的表達(dá)和復(fù)制。Rechtman等[26]研究發(fā)現(xiàn)這種抑制作用是通過下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α)來介導(dǎo)的。PGC-1α是一種饑餓誘導(dǎo)蛋白，可以啟動糖異生級聯(lián)反應(yīng)，并被證明可以有效地協(xié)同激活HBV轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)表明姜黃素在蛋白水平影響了PGC-1α，通過促進(jìn)PGC-1α蛋白的降解來抑制HBV。此外研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素可以與抗HBV核苷酸/核苷類似物協(xié)同工作，增強(qiáng)對HBV基因表達(dá)的抑制。姜黃素作為宿主靶向治療HBV感染，可以補(bǔ)充目前的病毒特異性治療。

來自于苦參植物(Sophorajaponica)的氧化苦參堿(oxymatrine，OMTR))在中國用于治療乙型肝炎患者已有數(shù)十年，其安全性已得到證實(shí)。熱激同源蛋白70(Hsc70)是HBV復(fù)制所必須的一種宿主蛋白。研究發(fā)現(xiàn)OMTR可通過破壞Hsc70 mRNA的穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)錄后水平顯著下調(diào)宿主Hsc70 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而在逆轉(zhuǎn)錄階段抑制HBV從pgRNA到DNA的從頭合成，從而表現(xiàn)出抗HBV的效果。由于這個靶點(diǎn)不是病毒蛋白，OMTR對野生型HBV或耐逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)抑制劑的菌株都有活性。此外，敲除Hsc70基因的小鼠未顯示異常，該表明抑制Hsc70后安全性良好[27-28]，這也為OMTR進(jìn)一步作為抗HBV藥物開發(fā)提供了一個很好的依據(jù)。

鹽酸千金藤堿(Cepharanthine hydrochloride，CH)是一種天然生物堿衍生物。Zhou等[29]研究發(fā)現(xiàn)該化合物能以劑量依賴的方式抑制野生型或拉米夫定耐藥型HBV臨床分離株的DNA復(fù)制和HBeAg的分泌，這表明該化合物可能是治療拉米夫定耐藥的慢性乙型肝炎患者的一種新的替代藥物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CH抑制宿主Hsc70 mRNA表達(dá)與抑制細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的作用是平行的，說明CH可能是通過下調(diào)宿主Hsc70表達(dá)來抑制HBV的復(fù)制。

Huang等[30]發(fā)現(xiàn)從青蒿(Artemisiamorrisonensis)中分離得到的化合物對羥基苯乙酮(p-hydroxyacetophenone，PHAP)能顯著抑制HBsAg的分泌和HBV DNA的表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)染了HBV的Huh7細(xì)胞中，PHAP處理后病毒表面基因的2.4kb preS RNA相對于2.1kb S RNA明顯增加。啟動子活性分析結(jié)果表明，PHAP可以增強(qiáng)病毒preS啟動子的活性，HBV的大表面蛋白的表達(dá)隨之增加并引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。PHAP特異性降低了Huh7細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的GRP 78的基因和蛋白水平，同時還導(dǎo)致病毒在細(xì)胞內(nèi)的明顯積累。此外，用毒胡蘿卜素(ER伴侶誘導(dǎo)劑)處理減輕了PHAP對細(xì)胞上清液中HBV DNA水平的抑制作用。根據(jù)以上結(jié)果推測，PHAP的抗HBV機(jī)制可能是通過干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路，調(diào)控病毒表面基因表達(dá)和阻斷病毒粒子分泌。

Tab 1 Summary of mechanism of action of anti-HBV natural products

CompoundStructureSourceMechanismofactionReferencesOMTROMTRdown-regulatestheexpres-sionlevelofHsc70mRNAbyde-stroyingthestabilityofHsc70mR-NA,thusinhibitingthesynthesisofHBVDNA[27-28]CHCHinhibitsthesynthesisofHBVDNAbydown-regulatingexpres-sionofHsc70mRNAinhostcells[29]PHAPArtemisiamorrisonensisPHAPregulatesexpressionofHBVsurfacegeneandinterruptsthese-cretionofvirionsbyinterferingwiththeERS[30]

3 結(jié)語

到目前為止，臨床上還沒有有效的藥物或方法可以治愈乙肝病毒感染性疾病。因此，抗乙肝病毒藥物的研發(fā)仍然是當(dāng)務(wù)之急。從目前研究發(fā)現(xiàn)的天然化合物抗HBV作用機(jī)制來看，大部分活性化合物是通過作用于宿主相關(guān)因子來抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，或是通過調(diào)控病毒S、C和X基因啟動子的活性來調(diào)控病毒自身因子而影響病毒的復(fù)制。但是發(fā)現(xiàn)抗HBV活性化合物直接作用靶點(diǎn)的報道還非常少，而且專注于發(fā)現(xiàn)抑制病毒某個生命周期階段的研究也比較缺乏。比如，cccDNA在細(xì)胞中的持續(xù)存在是HBV形成慢性感染的一個重要原因，如果專注以篩選抑制rcDNA到cccDNA形成階段或者抑制rcDNA的再形成再補(bǔ)充cccDNA的階段的活性化合物為目標(biāo)，可能會在抗HBV新藥研發(fā)方面有新的突破。

綜上所述，關(guān)于天然產(chǎn)物抗HBV的新作用機(jī)制或新靶點(diǎn)的報道并不多。許多天然產(chǎn)物被報道顯示出顯著的抗HBV作用，但它們僅限于基于細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，但具體的作用機(jī)制并不清楚，靶標(biāo)蛋白不明確。此外，也有很多文章報道了天然化合物的潛在抗乙肝病毒的活性，但沒有開展構(gòu)效關(guān)系討論或是進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾和改造，很難為后續(xù)的靶點(diǎn)和作用機(jī)制的系統(tǒng)深入研究提供支撐。因此，非常有必要通過化學(xué)生物學(xué)等學(xué)科交叉的手段，深入系統(tǒng)開展活性天然產(chǎn)物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制的深入研究，推進(jìn)天然抗HBV新先導(dǎo)分子的發(fā)現(xiàn)或是乙肝病毒新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。