劉奕耘，楊廣磊，朱芮弘，馬永超，謝群慧，趙 斌

(中國科學院大學，北京 100049；中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085)

慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)是世界性的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率持續(xù)增長。尿毒癥是CKD發(fā)展的最后一個階段，患者血液中會積累大量的蛋白結合尿毒素(protein binding urotoxin，PBUTs)，如硫酸對甲酚(para-cresol sulphate，PCS)、吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、硫酸吲哚酚(indophenol sulfate，IS)等，這些物質(zhì)的蓄積可引起腎內(nèi)外細胞氧化應激、炎癥、纖維化和凋亡，從而促進CKD向終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)發(fā)展。在病理過程方面，腎間質(zhì)成纖維細胞的活化、腎小球硬化、以及腎動脈硬化被認為是在CKD發(fā)生發(fā)展中組織損傷的共同病理基礎。在病因方面，除急性腎損傷、高血壓、糖尿病等是已知的可能促進CKD的因素以外，尚有病因不明CKD患者；同時，有學者認為環(huán)境因素也可能參與CKD的發(fā)生發(fā)展。2015年，Kataria等[1]綜述了有機化合物暴露與腎臟健康的關系，指出有機污染物如鄰苯二甲酸酯、雙酚A、二惡英和呋喃、多氟烷基酸、多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)等的暴露會影響腎小球濾過率和血清尿酸濃度，并可導致持續(xù)性腎損傷。

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一種配體激活的轉錄因子，是介導PBUTs和環(huán)境污染物生理毒理作用的重要受體，在胚胎發(fā)育過程中以及成年生物體的組織中廣泛存在。AhR不僅在腎臟的多種細胞中都有表達，Harrill等[2]還發(fā)現(xiàn)AhR基因敲除大鼠的尿液顏色、細胞組分、腎臟組織結構均發(fā)生了改變，說明AhR基因的正常表達在腎臟及泌尿系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生理功能。此外，AhR被內(nèi)源或外源配體激活后，可以調(diào)控其下游一系列基因表達，調(diào)節(jié)機體內(nèi)重要的代謝酶P450酶家族的活性；或與其他信號通路相互作用，進而調(diào)控細胞損傷過程。這些AhR信號通路介導的代謝、氧化應激與炎癥調(diào)節(jié)也同樣存在于腎臟的組織中。由此可見，AhR信號通路活性的調(diào)節(jié)不僅在腎臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用，還參與到腎臟對多種內(nèi)外源化合物產(chǎn)生生物響應的過程；并可能對響應的結局是趨向于代償性防御，或是對毒性損傷產(chǎn)生重要影響。通過系統(tǒng)總結AhR信號通路與CKD病理過程的關系，不僅有助于建立多種AhR活性物質(zhì)對腎臟的生理、毒性與健康效應的評價方法，也為進一步探尋AhR及其信號通路參與CKD的發(fā)生發(fā)展過程的直接和間接證據(jù)提出方向。

因此，本文從AhR介導的腎臟損傷和血管損傷總結了AhR表達與活化對CKD進程的影響，希望借此加深對AhR發(fā)揮生物效應的認識，同時為開展環(huán)境化合物與腎臟健康關系的研究提供思路。另外，由于多種有腎保護作用的天然化合物具有AhR活性，我們還對這些特征化合物進行了探討，并評估了AhR作為CKD干預手段研究靶點的潛力。

1 AhR介導腎臟細胞的損傷

大量實驗證明，急性腎損傷可導致腎臟生理結構和功能發(fā)生改變，比如腎小管形態(tài)變化、腎小管間質(zhì)纖維化、腎小管周微血管網(wǎng)密度降低，化合物誘發(fā)的腎臟炎癥、氧化應激反應等腎臟損傷均能引發(fā)CKD。

病理學研究顯示，暴露于2,3,7,8-四氯二苯并-對-二惡英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)和PCBs均可引起腎臟病理學改變，如間質(zhì)炎癥、近端和遠端曲小管擴張、腎小球炎癥及纖維化等。此外二者聯(lián)合暴露可導致更明顯的腎組織腫脹、細胞質(zhì)空泡化、近端腎小管上皮細胞壞死[3]。人們普遍認為TCDD和類二惡英PCBs同系物的毒性作用主要由AhR所介導，TCDD與AhR的相互作用以及CYP1A亞家族的激活對活性氧(reactive oxygen species，ROS)的形成和毒性作用做出了顯著貢獻。Lu等[4]觀察到CYP1A1在腎臟中的表達在所有TCDD處理組中均顯著上升，并且聯(lián)合接觸PCBs和TCDD后表達更加顯著，因此猜測TCDD的腎臟毒性作用是由AhR介導的。同樣，作為芳香烴類物質(zhì)，AhR的內(nèi)源性配體IS可延長AhR的激活狀態(tài)，在這期間腎透析患者的毒性效應更為明顯。從而說明AhR在CKD發(fā)生發(fā)展過程中具有關鍵的作用，可能是多種腎臟損傷的作用靶點。目前，普遍認為腎纖維化是多種原因引起的CKD進展至終末期腎病的共同病理特征，包括腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化和血管硬化[5]。

1.1 AhR介導腎小管損害腎單位是完成腎基本功能的主要結構，包括腎小球和腎小管兩部分。其中腎小球主要起濾過功能，腎小管則承擔重吸收和分泌功能。由于腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cells，GMCs)和腎小管上皮細胞對芳香烴類化合物表現(xiàn)出不同的細胞毒性反應譜[4]，證明該類化合物對腎小球和腎小管的影響并不相同，因此我們將區(qū)分AhR在不用組織中介導的生物學效應。

近端腎小管因為具有運輸和積累外源性化合物及其代謝產(chǎn)物的能力，成為腎毒性化合物的常見靶點。Sun等[6]通過在人近端腎小管上皮細胞HK-2和小鼠模型上實驗發(fā)現(xiàn)，暴露于IS或PCS可導致腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)標志蛋白和促纖維化因子轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)表達量升高。用RAS靶向藥物氯沙坦處理后，腎臟纖維化程度和TGF-β1表達水平降低。Ng等[7]發(fā)現(xiàn)IS經(jīng)陰離子轉運蛋白3(anion transporter 3，OAT3)的攝取在HK-2細胞中大量累積，并通過AhR/STAT3途徑使Mas受體在大鼠肝臟和HK-2細胞中的含量降低，且在HK-2細胞中其降低量與IS濃度呈時間-劑量依賴性。使用尿毒癥治療藥物AST-120或用AhR和STAT3的干擾RNA抑制相關基因表達后，可抑制Mas受體的降低。Mas受體是RAS的重要組成部分，通過與血管緊張素-(1-7)(angiotensin -(1-7)，Ang-(1-7))結合促進血管擴張、抑制細胞增殖，減少纖維化和炎癥等反應，抗衡血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)與其受體AT1結合產(chǎn)生的氧化應激、血管收縮、細胞增殖、尿鈉潴留等，對于生物體內(nèi)正常穩(wěn)態(tài)的維持和損傷修復具有重要作用[8]。以上實驗表明AhR可通過介導Mas受體的降低，打破RAS的平衡進而對腎小管產(chǎn)生損害。

腎小管纖維化是腎小管損傷的一種表現(xiàn)，可由多種因素造成，比如炎癥、氧化應激等。一氧化氮是重要的炎癥介質(zhì)，一氧化氮合酶分為3個亞型：內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)、神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS，nNOS)和誘導性NOS(inducible NOS，iNOS)。nNOS和iNOS可加重炎癥反應，與之相反，eNOS可抑制細胞衰老，并降低氧化應激，其含量的增加在下調(diào)腎纖維化方面具有顯著的作用，但是eNOS的減少可能會加速腎小球和腎小管間質(zhì)的損傷，改變腎小管微循環(huán)的動態(tài)，加重腎缺血微環(huán)境[9]。Ng等[7]研究發(fā)現(xiàn)，IS可導致eNOS發(fā)生磷酸化，從而失去活性。敲除STAT3、AhR和OAT3基因可抑制IS引起的eNOS磷酸化。因此eNOS的磷酸化可能是腎臟發(fā)生氧化應激、細胞衰老從而產(chǎn)生腎毒性的原因，加速了CKD的進程。

上皮-間質(zhì)轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)現(xiàn)象在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、組織再生、器官纖維化和癌癥進展中起著關鍵作用。小鼠腎臟纖維化的過程中，大約12%的成纖維細胞來源于骨髓，約30%是腎小管上皮細胞通過EMT作用轉化而來，此外約有35%是腎臟的微血管系統(tǒng)通過內(nèi)皮-間質(zhì)轉分化而來[10]。雖然沒有直接的研究證據(jù)表明，在腎臟中AhR與EMT的過程相關，但通過對其余組織和多種生物體的研究發(fā)現(xiàn)，AhR介導內(nèi)外源配體對肝、肺等細胞的EMT過程。例如，AhR的激活可誘導小鼠肝臟細胞纖維化，同時使上皮標志物緊密連接蛋白(Claudin-1)和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達水平下降。當AhR基因敲除后，上述現(xiàn)象消失，證明EMT依賴于AhR的轉錄[11]。AhR的內(nèi)源性配體犬尿氨酸可以通過AhR促進人肺癌細胞95D的遷移和EMT標志物波形蛋白增加，抑制上皮蛋白如E-cadherin的下調(diào)[12]。因此我們猜測在人類的腎臟中，TCDD、PCBs、IS等AhR內(nèi)外源配體也有可能通過AhR誘發(fā)EMT，促進腎間質(zhì)纖維化，進而加快CKD進程。

1.2 AhR介導腎小球損害腎小球濾過率是反映腎小球濾過功能的直接、客觀的指標，是CKD患者分期的主要依據(jù)。腎毛細血管中的腎小球內(nèi)皮細胞是參與腎小球濾過功能的第一屏障，即機械屏障-濾孔，也是參與腎小球選擇性濾過的重要成員。如上所述，AhR介導的Mas受體減少將導致細胞內(nèi)Ang II含量上升。已有研究表明，Ang II參與腎臟血管受到外源性或內(nèi)源性損傷后的重塑。在重塑過程中腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞的丟失能夠直接影響腎小球的濾過功能，同時激活血小板和凝血系統(tǒng)，這些變化與腎小球毛細血管的塌陷及腎小球硬化的發(fā)展相關。Yisireyili等[13]研究顯示在大鼠主動脈細胞和人主動脈平滑肌細胞HASMCs中IS上調(diào)前腎素受體(prerenin receptor，PRR)表達，誘導血管細胞增殖和纖維化，并通過ROS/OAT3/AhR/NF-κB途徑促進PRR與前腎素分泌和結合，使血管緊張肽原向Ang II轉化，Ang II可引起腎上腺皮質(zhì)球狀帶細胞合成和分泌從而促進腎小球硬化的醛固酮。腎小球硬化將引起腎單位生理結構破壞和功能改變，進而發(fā)展為慢性腎衰竭。

腎小球基底膜是腎小球濾過功能的第二屏障。它是由內(nèi)皮細胞和上皮細胞分泌物融合而成，具有復雜的結構。類似于內(nèi)皮細胞，GBM帶負電荷，對過濾的物質(zhì)具有電荷選擇性。同時機體通過收縮這些細胞來調(diào)節(jié)腎小球濾過率，并調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成和降解。ECM由細胞自身分泌到胞外間質(zhì)中的大分子物質(zhì)組成，其含量在腎臟中處于動態(tài)平衡，當ECM的產(chǎn)生大于降解量時將會導致沉積，如I型和IV型膠原，層粘連蛋白和纖維連接蛋白，在腎小球系膜區(qū)和細胞間隙的沉積會改變細胞結構，引起腎小球硬化[14]。Parrish等[15]證明，AHs可以通過AhR誘導GMC的線粒體損傷、干擾線粒體功能和谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)，并可以選擇性地耗盡GMC中細胞的谷胱甘肽。

足細胞(腎小球上皮細胞)是終末分化細胞，是腎小球濾過功能的第三道也是最后一道屏障，是維持腎小球正常功能的重要細胞組成部分。然而，在各種致病因素的作用下，足細胞是腎小球中最易受到損傷的細胞，在糖尿病、IgA和高血壓腎病中其損傷程度與腎病的嚴重性成正比，會引起腎小球硬化和相關疾病發(fā)展[16]。IS引起小鼠足細胞的形態(tài)變化，誘導更多的梭形和應力纖維肌動蛋白細胞骨架的重組。對正常小鼠的腎組織免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)AhR的表達局限于足細胞的細胞核，IS暴露兩個小時后AhR被激活，腎小球中CYP1A1的含量升高[17]。表明足細胞可能是循環(huán)中內(nèi)源性AhR配體的靶點。Ichii等[17]發(fā)現(xiàn)IS可通過激活AhR對足細胞產(chǎn)生損傷，使磷酸化Rac1/Cdc42增加，增加細胞的絲狀偽足結構，促進細胞運動和遷移，出現(xiàn)炎癥表型，擾亂肌蛋白骨架。Rac1和Cdc42都是Rho蛋白家族的成員，它們均能與GTP和GDP結合，在哺乳動物的信號轉導系統(tǒng)中發(fā)揮著“分子開關”的作用，而Cdc42可以通過調(diào)節(jié)蛋白誘導EMT發(fā)生。

2 AhR介導血管損傷

腎臟內(nèi)含有豐富的血管系統(tǒng)，環(huán)境污染物以及尿毒素引起的血管炎癥，血栓、動脈粥樣硬化等能引起血流動力學、代謝和免疫異常，刺激腎小管周圍毛細血管及血管內(nèi)皮細胞，導致內(nèi)皮細胞活化，氧自由基增多等一系列生理病理反應，產(chǎn)生的血管疾病與CKD相互作用進而加速腎臟疾病的進展[18]。AhR介導的血管的氧化應激和炎癥反應[19]，在內(nèi)外源物質(zhì)導致的血管疾病中同樣起著重要作用。

2.1 AhR介導血管炎癥炎癥過程的一個重要特征是白細胞通過黏附和穿越血管內(nèi)皮細胞，向炎癥部位滲出。選擇素是一類重要的黏附分子，主要介導白細胞與血管內(nèi)皮細胞的起始黏附。Ito等[19]發(fā)現(xiàn)IS和IAA通過AhR誘導細胞氧化應激激活Jun-N-終端酶和激活蛋白-1，協(xié)同促進內(nèi)皮細胞選擇素(E-selecin)表達上升。E-selectin是一種由細胞因子激活的僅在內(nèi)皮細胞上表達的細胞黏附分子，加劇白細胞和內(nèi)皮細胞相互作用，引發(fā)炎癥。Oesterling等[20]用AhR的激動劑β-萘芬處理HUVEC細胞后，苯并芘(benzo(a)pyrene,BaP)能增加細胞間粘附分子ICAM-1的分泌；而通過干擾RNA抑制AhR基因表達，或用AhR拮抗劑α-萘芬可消除BaP誘導的ICAM-1。Dou等[21]發(fā)現(xiàn)IAA通過增加ROS產(chǎn)生介導內(nèi)皮細胞氧化應激，并通過AhR誘導激活p38 MAPK/NF-κB炎癥反應信號通路，活化COX-2。在CKD動物模型中COX-2的表達與促炎反應相關，參與前列腺素E2的合成，在動脈粥樣硬化中發(fā)揮著重要作用。

2.2 AhR介導血管硬化和栓死動脈粥樣硬化被認為是一種血管壁的慢性炎癥性疾病，其特征是趨化因子驅(qū)動的人外周血的單核細胞募集到內(nèi)皮細胞下空間，在該部位單核細胞分化為巨噬細胞。在單核細胞中IS通過激活AhR/Nrf2信號通路促使細胞發(fā)生免疫應答，分泌白細胞介素-6、COX-2、白細胞介素-10、TGF-β等炎癥因子，導致單核細胞分化為低炎癥，纖維化的巨噬細胞，有助于造成慢性炎癥和不良血管重塑[22]。這些巨噬細胞通過分泌許多炎癥介質(zhì)，如細胞因子和趨化因子，促進斑塊的發(fā)展。Dalei等[23]發(fā)現(xiàn)，TCDD通過AhR誘導U937巨噬細胞內(nèi)皮生長因子上游基因CXCR2的表達，且CXCR2抑制劑和AhR拮抗劑可降低TCDD誘導的載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)敲除小鼠早期動脈粥樣硬化病變的過程。體脂積累過多也是動脈粥樣硬化性血管疾病的主要原因，Violeta等[24]發(fā)現(xiàn)注射PCB-77后ApoE-/-小鼠的體重增加，脂肪細胞肥大，血脂異常，動脈粥樣硬化加重。PCB-77給藥增加野生型小鼠的體重，但不增加AhR-/-小鼠的體重；低濃度PCB-77或TCDD增加脂肪細胞分化、甘油-3-磷酸脫氫酶活性，AhR拮抗劑α-萘黃酮可消除PCB-77的作用。Gondouin等[25]發(fā)現(xiàn)CKD患者血液中組織因子(tissue factor，TF)的含量高于健康人群。TF廣泛表達于各種組織，是凝血過程的啟動者，正常情況下，組織因子位于血管壁外膜細胞，而在血管中膜或內(nèi)膜層卻很稀少。當血管壁的完整性遭到破壞時TF才暴露于循環(huán)血液，通過激活凝固級聯(lián)反應發(fā)揮止血作用。IS和IAA通過AhR阻止血管內(nèi)皮細胞中TF泛素化，使循環(huán)中TF水平顯著增加，引發(fā)血栓形成，進而影響血液流動，甚至可導致血管完全阻塞[25]。

血管系統(tǒng)是腎臟發(fā)揮正常功能的執(zhí)行者，尿毒素在腎臟累積的實質(zhì)是血液累積，腎臟和心血管疾病通常存在有害的反饋共存，他們相互間并不是獨立的系統(tǒng)。因此對于CKD除關注腎臟本身外，對心血管相關疾病的研究也是人們了解其致病機制的關鍵點。

3 AhR活性天然產(chǎn)物的腎保護作用

綜上可見，AhR是各種內(nèi)外源化合物引起CKD，產(chǎn)生腎臟損傷的關鍵因子。日常飲食是人類接觸AhR配體的最大來源，各種天然膳食化學物質(zhì)已被證實具有AhR活性，可通過激活或抑制AhR信號通路對腎臟產(chǎn)生保護作用。這說明AhR兼具介導化合物對腎臟的損傷效應和藥物對腎臟保護的雙重作用。AhR在腎臟疾病的發(fā)生和保護過程中發(fā)揮重要作用，然而對AhR信號通路進行調(diào)控是否能預防或恢復腎損傷的研究還較少。

傳統(tǒng)中藥大黃、雷公藤、川穹、黃芪等的復方制劑或提取物具有緩解GMC異常增生、腎小球硬化，保護內(nèi)皮血管，抗氧化損傷，促進腎小管再生修復等功能[26]。從植物種分離的天然化合物，如白藜蘆醇，小檗堿等的腎臟保護功能也已在多種細胞和動物模型中被證實，可減輕腎臟病理損傷，對腎臟炎癥、纖維化、氧化應激損傷等產(chǎn)生保護作用，改善腎功能[27-28]。這些天然化合物中有許多為AhR的激動劑或拮抗劑。已知正常的飲食水平下，部分黃酮類化合物可以有效地抑制TCDD與AhR的相互作用，進而抑制TCDD的毒性[29]。例如山奈酚是黃酮類化合物的一種，可以下調(diào)BaP損傷模型中凋亡基因及AhR基因的表達，從而抑制BaP導致HTR8-SVneo細胞的氧化損傷，通過提高抗氧化酶SOD活性，降低脂質(zhì)過氧化物MDA、NO的產(chǎn)生來減少BaP損傷[30]。雖然目前沒有明確的證據(jù)表明這些天然化合物是通過AhR對腎臟產(chǎn)生保護作用，但基于AhR在腎臟生理病理過程中所扮演的重要角色，有必要對AhR在腎保護方面的潛在作用進行更深入的研究。

4 總結

綜上所述，AhR在CKD的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，一方面AhR不僅可以介導內(nèi)源性代謝產(chǎn)生的PBUTs和外源性環(huán)境污染物所導致的多種腎臟固有細胞的損傷或轉化功能異常，從而引起腎纖維化與腎小球硬化；還可以在腎血管內(nèi)皮細胞中介導這些毒性物質(zhì)所導致的氧化應激及炎癥反應，從而產(chǎn)生血栓、血管硬化等腎血管病變，協(xié)同加速腎功能的損傷(Fig1)。另一方面，腎臟的損傷使具有AhR活性的PBUTs在體內(nèi)的累積，在加重腎臟損傷的同時還可能通過腎外組織中的AhR促進CKD并發(fā)癥的發(fā)生(Fig1)。因此，深入系統(tǒng)的掌握AhR在CKD病程中的作用，可以為特異性阻斷相關的毒性通路，并形成有效的疾病干預手段提供理論支撐。此外，針對目前已有文獻報道的AhR活性天然產(chǎn)物開展腎保護作用研究，可以為基于AhR靶點的CKD干預藥物的研發(fā)提供潛在的活性化合物庫。

Fig 1 Mechanisms for AhR mediated nephrotoxicity and renal protection