宋 佳，閆 雪，夏麗媛，孫為偉，孫 博，范 寰，王文杰，趙 晨?

（1. 國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037；2. 新希望六和股份有限公司/農業(yè)農村部飼料及畜禽產品質量安全控制重點實驗室，四川 成都 610023；3. 天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

殺蟲蛋白，是一類具有殺蟲效果的蛋白質類物質。首次確定殺蟲蛋白是在1953 年，Hannay 等通過研究發(fā)現，促使蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）發(fā)揮殺蟲作用的物質主要是其產生的伴胞晶體，且證實這種伴胞晶體的本質就是蛋白質，由此殺蟲蛋白走進公眾視野。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，1981 年，Schnepf 和Whiteley成功分離得到第一個來自于Bt 的殺蟲蛋白基因cry，開創(chuàng)了殺蟲蛋白在分子水平研究的新紀元。此后，越來越多的殺蟲蛋白基因被挖掘，植物、動物、微生物中均被證實有殺蟲蛋白的存在，其中微生物源殺蟲蛋白種類最多，研究更深入[1]。本文對近年來發(fā)現的微生物源殺蟲蛋白及其靶標昆蟲和作用方式等信息進行匯總（表1），為后續(xù)相關研究提供便利。

表1 殺蟲蛋白信息匯總表Table 1 Summary of insecticidal proteins

1 微生物源殺蟲蛋白

1.1 芽孢桿菌科（Bacillaceae）/類芽孢桿菌科（Paenibacillaceae）

芽孢桿菌，是一類能產生抗力內生孢子的革蘭氏陽性菌。目前，來源于芽孢桿菌屬的蘇云金芽孢桿菌是農業(yè)生產中應用最廣的微生物制劑，很多來源于Bt 的殺蟲蛋白基因也已經被成功商業(yè)化應用[2]。Bt 殺蟲蛋白分為殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs）、營養(yǎng)期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs）和分泌型殺蟲蛋白（secreted insecticidal protein，SIPs）。其中ICPs 是在釋放芽孢時形成的，分為Cry 和Cyt 兩類，對鱗翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）、雙翅目（Diptera）、膜翅目（Hymenoptera）、同翅目（Homoptera）、直翅目（Orthoptera）、線蟲（Nematode）及螨類（Mite）等都具有特異的殺蟲活性[3-7]。VIPs，SIPs 則是在Bt 生長過程中產生的，對雙翅目、鱗翅目、鞘翅目這幾類昆蟲具有殺蟲特異性[8-9]。

除蘇云金芽孢桿菌外，球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）以其對蚊蟲幼蟲的高毒性而聞名，其產生的二元毒素Bin 毒素（TPP 蛋白），已被廣泛用作滅蚊劑[10]。來自蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的天然sphingomyelinase C（SMC）蛋白及在大腸桿菌重組表達后都被發(fā)現可通過低劑量注射快速麻痹和殺死德國小蠊（Blattela germanica）[11]。David Bowen 等經研究確定了三種來自類芽孢桿菌科的側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）的新蛋白 Cry75Aa1（Mpp75Aa1）、Cry75Aa2（Mpp75Aa2）和Cry75Aa3（Mpp75Aa3）具有對西方玉米根蟲（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）的殺蟲活性[12]。（類）芽孢桿菌科是目前發(fā)現殺蟲蛋白種類最多，被業(yè)界認為最具有殺蟲蛋白挖掘潛力的菌種。

1.2 昆蟲病原線蟲共生菌/ 腸桿菌科（Enterobacteriaceae）

昆蟲病原線蟲共生菌是一類與昆蟲病原線蟲（entomopathogenic nematodesm，EPNs）互惠共生的桿狀細菌，屬于腸桿菌科，主要包括致病桿菌屬（Xenorhabdus）和發(fā)光桿菌屬（Photorhabdus）。

1998 年， Bowen 等首次在發(fā)光桿菌（Photorhabdus luminescens）W14 發(fā)酵液中發(fā)現與蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白顯現出類似殺蟲活性和致病特征的Tcs 殺蟲蛋白復合體，復合體由TcA（280 kDa）、TcB（170 kDa）、TcC（110 kDa）三種類型的功能蛋白組成[13]，在喂食或注射的條件下對鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、雙翅目等多種害蟲均具有毒殺作用[14-16]。而后，類似Tcs 復合體的蛋白也在其它昆蟲病原線蟲共生菌中被發(fā)現，如來自致病桿菌屬細菌的Xpt（Xenorhabdus protein toxin）蛋白，來自嗜蟲沙雷氏菌（Serratia entomophila）的Sep（Sentomophila pathogenicity）蛋白。2019 年，Mai Morishita 等從腸桿菌科細菌Enterobacter sp.532 菌株中分離到一種對家蠶具有致病性的蛋白itcA，因經鑒定是Tcs 復合體A組分的同源物，其VRP1 結構域是保守的，且在itcA 下游區(qū)域，還發(fā)現了Tcs 復合體B 和C 成分基因的同源物[17]。由此看來，Tc 蛋白在腸桿菌科中具有廣譜性。

除TcS 外，發(fā)光桿菌中普遍存在的致軟毒素Mcf（makes caterpillars floppy）能夠促使煙草天蛾等蛾類幼蟲的血細胞和中腸上皮細胞凋亡，同時破壞腸道，使昆蟲滲透失調，最后癱軟死亡[18]。將Mcf 的C 端截短，保留N 端促細胞凋亡的BH3結構域，仍能對甜菜夜蛾幼蟲表現出喂食毒性和血腔毒性[19]，可見BH3 結構域是Mcf 發(fā)揮殺蟲作用的重要功能區(qū)。發(fā)光桿菌中還有一種常見的二元殺蟲蛋白 pirA/pirB（Photorhabdus Insect-Related，Pr）蛋白具有較強的昆蟲口服和血腔毒性，孫建宇通過實驗確定PirA2B2 蛋白對致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）和白紋伊蚊（Aedes albopictus）有口服殺蟲活性，對大蠟螟（Galleria mellonella）和斜紋夜蛾（Spodopteralitura Fabricius）5 齡幼蟲、黃粉蟲（Tenebrio molitor）、德國小蠊（Blattella germanica）具有一定的血腔殺蟲活性，但當pirA2 和pirB2 基因單獨表達時，對大蠟螟和斜紋夜蛾5 齡幼蟲則不表現血腔活性[20]。Txp40（Toxin from Xenorhabdus and Photorhabdus，40kDa）是一種普遍存在于昆蟲病原線蟲共生菌致病桿菌屬和發(fā)光桿菌屬中的殺蟲蛋白，在對棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的毒性研究中，Prakash Y 等分析Txp40 可能與棉鈴蟲中腸受體蛋白鈣粘蛋白、ATP 結合盒、氨基肽酶N1 和堿性磷酸酶相互作用，從而產生毒性[21]。

昆蟲病原線蟲共生菌因其含有的殺蟲蛋白種類之多，殺蟲圖譜之廣，已被廣泛認可為可替代Bt，用于新的轉基因抗蟲植物研究的潛力菌種。

1.3 假單胞菌科（Pseudomonadaceae）

假單胞菌是幾乎無處不在的細菌，包括土壤、水和植物表面，是生防常用菌，具有殺蟲、降解有毒物質等生物防治作用[22]。2016 年9 月，美國杜邦先鋒公司報道，從綠葉假單胞菌（Psuedomonaschlororaphis）中發(fā)現IPD072Aa 蛋白對西方玉米根蟲表現出殺蟲能力，轉ipd072Aa 基因的玉米可免受西方玉米根蟲的危害，且經證實其重要農藝性狀和營養(yǎng)成分可視為與常規(guī)玉米基本一樣[23]。2021 年2 月9 日，澳新食品標準局（Food Standards Australia New Zealand，FSANZ）發(fā)布批準能同時表達DvSSJ1 雙鏈RNA 和IPD072Aa 蛋白的耐除草劑和抗蟲玉米品系DP23211 用于食品，這是非Bt 基因轉基因作物的一次成功應用。2017 年6 月美國杜邦先鋒公司再次報道了從摩氏假單胞菌（Pseudomonas mosselii）中發(fā)現了一個全新的殺蟲蛋白PIP47-Aa，不存在任何已知的結構域和模體。該蛋白除了能夠殺死西方玉米根蟲外，還能夠殺死鞘翅目北方玉米根蟲（Diabrotica barberi）、南方玉米根蟲（Diabrotica undecimpunctata howardi）、南美葉甲（Diabrotica speciosa）、蘿卜菜跳甲（Phyllotreta cruciferae）及鱗翅目害蟲小菜蛾（Plutella xylostella）、大豆尺夜蛾（Pseudoplusia includens）等，同時對益蟲瓢蟲無毒性[24]。殺蟲譜更廣、對非靶標昆蟲無害、與已知殺蟲蛋白無交互抗性成為了PIP47-Aa 殺蟲蛋白的3 個突出優(yōu)勢。

此外，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的Fit 蛋白對煙草天蛾（Manduca sexta）和蠟螟具有毒殺活性[25]。嗜蟲假單胞菌（Pseudomonas entomophila）的Monalysin 蛋白與來自臺灣假單胞菌（Pseudomonas Taiwanensis）的TccC 殺蟲蛋白等均表現出對果蠅（Drosophila）幼蟲的毒性[26-27]。假單胞菌中殺蟲蛋白的發(fā)現，證明在其它細菌源甚至是革蘭氏陰性菌中尋找強力有效的殺蟲蛋白是具有可能性的。

1.4 真菌（Fungi）

真菌是最早被發(fā)現可以作為防治害蟲的微生物，當前已知的以昆蟲為寄主的真菌超過750 種，涉及昆蟲超過200 種[28]。其中，白僵菌和綠僵菌是在蟲害防治中應用最廣泛的蟲生真菌，其主要代謝產物為破壞素（destruxins，dtxs），是由一個α-羥基酸和五個氨基酸殘基組成的環(huán)六肽，可以抑制細胞和體液免疫反應，從而幫助真菌在昆蟲中繁殖，達到毒殺目的[29]。王成樹課題組通過比較產破壞素的金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）和不產破壞素的蝗綠僵菌（Metarhizium acri）的基因組信息，同時對靶向基因進行破壞確定了破壞素合成途徑主要是由dtxS1、dtxS2、dtxS3、dtxS4四個基因編碼調控，并經驗證，綠僵菌突變菌ΔdtxS1 確實由于NRP 合成酶的缺失不能產生破壞素，改變殺蟲活性[30]。該課題組還通過全基因組測序不同殺蟲真菌以發(fā)掘殺蟲毒力蛋白，分別證實缺失mast12、mpl1、mrVeA、mrVelB 等基因的綠僵菌突變體，會失去殺蟲能力[31-33]。此外，在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）培養(yǎng)液中也分離純化出能夠通過注射蠟螟引起細胞毒性及昆蟲黑化反應的殼聚糖酶類似蛋白BcIP（Beauveria chitosanase-like protein）和對東亞飛蝗(Locnsta migratoria)具有?；缘淖⑸涠拘缘腂assiacridin蛋白[34-35]。

近年來，大型食用真菌的活性成分在生物源殺蟲劑方面的開發(fā)也逐步受到重視，如平菇（Pleurotus mushrooms）中的溶血素家族蛋白OlyA6（ostreolysin A6），PlyA2（pleurotolysin A2）和 EryA（erylysin A）會與蛋白伴侶 PlyB（pleurotolysin B）結合，協(xié)同作用于磷酸乙醇胺神經酰胺（ceramide phosphoethanolamine，CPE）和跨膜孔的形成，蛋白與蛋白伴侶形成的復合物對西方玉米根蟲幼蟲、成蟲和科羅拉多馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）幼蟲表現出選擇性毒性。同時，由于它們是與受體相互作用，因此進化出抗性的機會應較小[36]。此外，真菌酶系豐富，分泌的蛋白酶、幾丁質酶和脂酶等能夠降解害蟲體壁從而達到殺蟲效果，但這些酶的經口毒性還有待研究[37]。

1.5 其他

除上述來源分類，還有其它來自細菌的殺蟲蛋白，如紫色桿菌（Chromobacterium piscinae）中發(fā)現的革蘭氏陰性殺蟲蛋白GNIP1Aa（Mpf3Aa1）不僅對西方玉米根蟲表現出特異性的殺蟲活性，且經過序列分析未發(fā)現與任何已知的殺蟲蛋白具有同源性，這表明該蛋白可能是以一種新的方式殺滅WCR，為今后殺蟲蛋白的應用提供了更多的可能性[38]。

其實，隨著基因組測序項目的不斷增加，以及蛋白質結構預測方法的不斷改進，人們發(fā)現，細菌產生殺蟲蛋白的范圍越來越廣，蘇云金芽孢桿菌早已不再是殺蟲蛋白的唯一來源。2020 年，國際殺蟲蛋白命名委員會就以1998 年蘇云金芽孢桿菌蛋白命名規(guī)則為基礎[39]，根據蛋白結構及保守結構域對蛋白序列重新進行分組，并更新了命名方式。修訂后的命名信息可通過細菌殺蟲蛋白資源中心網站（BPPRC，https://www.bpprc.org/）進行搜索，該資源中心網站上的信息顯示，截至2021 年5 月，細菌殺蟲蛋白有App、Cry、Cyt、Gpp、Mcf、Mpf、Mpp、Mtx、Pra、Prb、Spp、Tpp、Vip、Vpa、Vpb、Xpp 十六大類，共1 047種[40]。當然，這個數據還會不斷被更新。

2 討論與展望

蟲害嚴重制約著農林業(yè)的發(fā)展，據農業(yè)部統(tǒng)計，農藥的施用可減少因蟲害造成的經濟損失約300 億元[41]，但化學農藥的長期施用不僅使害蟲抗性提高，而且對環(huán)境造成污染，因此開發(fā)環(huán)境友好的新型生物農藥已成為必然趨勢。殺蟲蛋白作為一種優(yōu)質的生物防治劑，同化學農藥相比，具有安全性高、對環(huán)境友好、不易產生抗藥性等優(yōu)點，同其它生物農藥如：昆蟲信息素、植物源殺蟲劑及微生物源菌劑相比，又具有來源廣泛、作用位點獨特、重組蛋白獲取成本低等特點，在蟲害防治上已逐漸成為新的技術儲備和其它農藥的有力補充。但目前也存在亟待解決的問題，實際防治應用中只以蘇云金芽孢桿菌為主，長期大面積連續(xù)種植Bt 轉基因作物以及單一使用Bt 菌劑，缺乏多樣性，導致昆蟲抗性日益嚴重。所以，對微生物源除蘇云金芽孢桿菌外的細菌及殺蟲真菌，乃至植物源和動物源的殺蟲蛋白基因的發(fā)掘將是至關重要的。

另一方面，由于蛋白類物質較化合物類藥劑在結構穩(wěn)定性上存在劣勢，在開放環(huán)境中的應用受到限制，目前主要以轉基因作物的形式實現其蟲害防治功能。若能通過基因工程和蛋白質工程的手段，提升殺蟲蛋白質的穩(wěn)定性，便可為生物藥劑形式的應用提供可能。這不僅可以緩解民眾對轉基因作物的排斥心理，同時還能為將來與其它生物藥劑進行復配，對害蟲進行多靶點消滅打下堅實的基礎，最終實現綜合防治。