張 璐，劉 京?，李 錦，張勝楠，李榮喬

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035）

玫瑰（Rosa rugosaThunb.）屬薔薇目薔薇科落葉性灌木，在我國具有悠久的栽培歷史，目前在全國各地均有種植，其中以華北、西北、西南等地為主[1-2]。山東平陰縣是中國最大的玫瑰花種植基地，玫瑰花資源十分豐富，其“平陰重瓣紅玫瑰（Rose rugosa cv. Plena）”是原國家衛(wèi)生部于2010 年認(rèn)證的新資源食品和藥食同源品種，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。

重瓣紅玫瑰花在提取玫瑰精油后剩余大量的固體花渣，這些花渣的營養(yǎng)成分豐富，但目前生產(chǎn)中大部分作為廢棄物直接處理掉了，這不僅污染了環(huán)境，也是對資源的浪費[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰精油的提取只是將玫瑰花的香氣等可揮發(fā)性成分提取出來，而其他（如蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)、多酚類和黃酮類等）非揮發(fā)性成分都留在了提取后剩余的花渣中，具有很高的再利用價值[7-10]。因此，提取玫瑰花渣中的功效成分，提高花渣的再利用率具有重要的研究意義和應(yīng)用前景。

目前，關(guān)于玫瑰花中功能性成分開發(fā)較多[11-12]，但是從花渣中提取功能性成分的研究報道較少。玫瑰花渣成分復(fù)雜，含有多酚類、黃酮類等多種化學(xué)成分，具有減少和消除自由基、抗氧化活性、抗血栓、抗癌、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血脂和預(yù)防心臟病等生理活性[13-15]。同時，玫瑰花渣中還含有蛋白質(zhì)、VC和膳食纖維等多種營養(yǎng)成分，其中所含氨基酸中必需氨基酸所占比例較高，所含不飽和脂肪酸中亞油酸所占比例較高，總脂肪含量較低[7,9]。在花渣成分提取技術(shù)研究中，主要的提取方法有溶劑提取法[10,16]、堿提取[17]、加熱提取[18]、酶輔助提取[19]、微波輔助提取[20]、超聲波輔助提取[21-22]等。超聲輔助提取法在多酚提取中表現(xiàn)出較高的提取效率，近年來被廣泛應(yīng)用于植物源化合物的提取。謝瓊等[23]用超聲提取了玫瑰花渣中的總黃酮，確定了超聲提取的最佳工藝條件。張佳嬋等[8]采用醇提法提取了玫瑰花和花渣中的黃酮成分，所得黃酮凍干粉對羥自由基、ABTS+自由基和DPPH 自由基均具有清除能力。馬猛華等[9]提取了玫瑰花渣中的多糖和黃酮類化合物，優(yōu)化了各自的提取工藝。

目前研究較多的是大馬士革玫瑰花渣、苦水玫瑰花渣等的成分提取及其功能性分析，而對于重瓣紅玫瑰花渣的研究相對較少[21,24-26]?；诖?，本項目以重瓣紅玫瑰花精油提取后產(chǎn)生的玫瑰殘渣廢棄物為原料，研究其中黃酮類化合物的提取工藝，同時考察黃酮類化合物的抗氧化活性和抑菌活性，以期為提高重瓣紅玫瑰花的綜合利用價值提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

重瓣紅玫瑰花渣：山東省平陰玫瑰精油生產(chǎn)基地；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；DPPH（純度>96%）、ABTS（純度>98%）：上海麥克林生化科技有限公司；羥自由基測試盒：南京建成生物工程研究所；氫氧化鈉、過硫酸鉀、硝酸鋁、無水乙醇、亞硝酸鈉，均為分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

指示菌：金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC 25923、蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusATCC 11778、大腸桿菌Escherichia coliATCC 44752：河北科技大學(xué)酶工程實驗室保存。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計（Evolution 220）：美國Thermo 公司；全自動菌落計數(shù)儀（Scan-1200）：法國Interscience 公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（SPX-150）、水浴恒溫震蕩器（SHZ-A）、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140MBE）：上海博訊實業(yè)有限公司；電子天平（JJ-1000）：常熟市雙杰測試儀器廠；恒溫?fù)u床（ZHWY）：上海智城分析儀器制造公司；牛津杯（內(nèi)徑6.0 mm，外徑7.8 mm）：武漢藥科新技術(shù)開發(fā)公司；離心機（4-16KS）：德國Sigma 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

玫瑰花固體渣放置于40 ℃烘箱內(nèi)恒溫干燥4 h，烘干后粉碎，將所得粉末狀樣品后，低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本試驗以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品對玫瑰花渣中總黃酮含量進(jìn)行測定。配置不同濃度的蘆丁溶液，利用亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行反應(yīng)，利用紫外分光光度計在510 nm處測得吸光值，并以吸光值為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 玫瑰花渣中總黃酮提取條件的優(yōu)化

1.3.3.1 乙醇濃度的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取重瓣紅玫瑰花渣粉1.0 g，按照1∶15 的料液比，分別溶于體積分?jǐn)?shù)為55%、60%、65%、70%、75%的乙醇溶液中，于40 ℃、120 r/min 水浴震蕩1.5 h，離心除蛋白后得到樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行操作，測定黃酮含量。

1.3.3.2 提取時間的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取玫瑰花渣粉1.0 g，按照料液比1∶15 溶于體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，將溶解好的溶液置于恒溫震蕩器中40 ℃、120 r/min 水浴震蕩，設(shè)置時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，離心除蛋白后得到樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定黃酮含量。

1.3.3.3 提取料液比的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱量玫瑰花渣粉1.0 g，分別按照料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 溶解于體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，將溶解好的溶液置于恒溫震蕩器中，40 ℃、120 r/min水浴震蕩1.5 h，離心除蛋白后得到樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定黃酮含量。

1.3.3.4 提取溫度的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取玫瑰花渣粉1.0 g，按照料液比為1∶30 的比例，溶于體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，分別置于40、50、60、70、80、90 ℃恒溫震蕩器，水浴震蕩提取1.5 h，離心除蛋白后得到樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定黃酮含量。

1.3.4 玫瑰花渣中總黃酮超聲波輔助提取條件的正交實驗

采用L25（56）正交實驗對玫瑰花渣中總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的提取工藝條件。正交表如表1 所示：

1.3.5 玫瑰花渣總黃酮的抗氧化性的測定

1.3.5.1 對 DPPH·自由基的清除效率 參照Ravindran 等[27]的方法，將上述條件下得到的黃酮提取液，稀釋5 個合適梯度，分別對不同濃度的樣品進(jìn)行一組實驗：在第一只試管中加入1 mL黃酮提取液和3 mL、50 μg/mL 的DPPH 溶液，充分混勻后于室溫下避光反應(yīng)30 min；在第二只試管中加入1 mL 黃酮提取液和3 mL 無水乙醇；在第三只試管中加入1 mL 無水乙醇和3 mL 的DPPH 溶液。蒸餾水調(diào)零后，于517 nm 下測定每組三支試管的吸光值，分別將吸光值記作Ac、Ad、Ak。按照公式（1）計算黃酮提取液對DPPH·自由基的清除率：

1.3.5.2 對ABTS+自由基的清除效率 參照Yan等[1]的方法，將7 mmol/L 的ABTS 和2.45 mmol/L的過硫酸鉀按照1∶1（v/v）均勻混合后，室溫下避光放置24 h 備用。用95%乙醇溶液稀釋配置好的ABTS 溶液至波長734 nm 處的吸光度值在(0.7±0.02) nm 內(nèi)，作為 ABTS+測定溶液。取制備好的黃酮提取液進(jìn)行試驗：0.4 mL 待測樣液，加入ABTS+測定溶液3.6 mL，靜置5 min，于734 nm波長處測定吸光度。按照如下（2）公式計算黃酮提取液對ABTS+自由基的清除率：

式中：Amax 為ABTS+測定溶液的吸光值；As 為樣品管的吸光值。

1.3.5.3 對羥自由基清除效率 將提取后的黃酮提取液使用羥自由基測定試劑盒進(jìn)行羥自由基（·OH）清除率的測定，將所得結(jié)果代入（3）公式，計算的羥自由基清除率：

抑制羥自由基能力（U/mL）=

式中：標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8.824 mmol/L，取樣量為1 mL，n 為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.3.6 玫瑰花渣總黃酮的抑菌性研究

采用牛津杯擴散法[28]，選用金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC 25923、蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusATCC 11778、大腸桿菌Escherichia coliATCC 44752 為指示菌進(jìn)行抑菌實驗。將指示菌的菌懸液（108CFU/mL）按照1%的添加量加入到與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，傾倒滅菌平板，在平板的牛津杯中添加50 μL 玫瑰花渣的黃酮提取液，預(yù)擴散后恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，抑菌圈測量儀測定抑菌圈直徑。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實驗組設(shè)三個平行，數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007 進(jìn)行處理，正交設(shè)計助手專業(yè)版V3.1 破解綠色版對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰花渣中總黃酮提取條件的優(yōu)化

2.1.1 乙醇濃度對玫瑰花渣中黃酮提取的影響

不同濃度乙醇提取重瓣紅玫瑰花渣中黃酮結(jié)果見圖1。圖1 結(jié)果顯示，隨著乙醇濃度的提高，黃酮提取量先增大后減小，這可能是因為乙醇濃度較大時，玫瑰花渣中的其他成分會被浸提出來從而影響了玫瑰黃酮的析出。在乙醇濃度為60%時黃酮含量最高，達(dá)到7.47 mg/g。周小琦[14]的實驗結(jié)果為當(dāng)乙醇濃度為65%時黃酮含量最高為3.68 mg/g。

圖1 乙醇濃度對玫瑰花渣中黃酮提取的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on the extraction of flavonoids from rose residue

2.1.2 提取時間對玫瑰花渣中黃酮提取的影響

不同提取時間對玫瑰花渣黃酮提取的影響見圖2。由圖2 結(jié)果可知，隨著提取時間的增大，黃酮提取量先增大后減小，可能是隨著時間的延長，花渣中其它雜質(zhì)也會浸出，因此最佳提取時間為1.5 h，黃酮含量達(dá)到11.48 mg/g。

圖2 提取時間對玫瑰花渣中黃酮提取的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the extraction of flavonoids from rose residue

2.1.3 提取料液比對玫瑰花渣中黃酮提取的影響

不同提取料液比對玫瑰花渣中黃酮提取的結(jié)果見圖3。由圖3 可知，料液比為1∶30 的時候，黃酮的提取量最高，達(dá)到了15.83 mg/g，這可能是因為溶劑量大時，黃酮溶出的較多。因此，本研究選擇重瓣紅玫瑰花渣黃酮的最佳提取料液比為1∶30。

圖3 料液比對玫瑰花渣中黃酮提取的影響Fig. 3 The effect of ratio of material to liquid on the extraction of flavonoids from rose residue

2.1.4 提取溫度對玫瑰花渣中黃酮提取的影響

不同提取溫度對玫瑰花渣黃酮影響的結(jié)果見圖4。由圖4 可知，黃酮提取量隨溫度的升高先增大后減小，可能溫度過高會破壞黃酮結(jié)構(gòu)，所以最適宜提取溫度為80 ℃時，黃酮提取量達(dá)到22.43 mg/g。

圖4 提取溫度對玫瑰花渣中黃酮提取的影響Fig. 4 Effect of extraction temperature on the extraction of flavonoids from rose residue

2.2 玫瑰花渣中總黃酮超聲波輔助提取條件的優(yōu)化

對超聲輔助提取的提取條件進(jìn)行正交試驗優(yōu)化，優(yōu)化的結(jié)果見表2。由表2 結(jié)果可得出最優(yōu)組合為A3B3C3，即超聲處理時間為45 min、超聲溫度為60 ℃、超聲功率為140 W，在此條件下黃酮含量達(dá)到58.53 mg/g。宋可珂[29]篩得最優(yōu)提取妙峰山玫瑰黃酮條件下，含量達(dá)到66.040 mg/g。牛元[30]采用紫外分光光度計法測定黃酮含量，苦水玫瑰花蕾中黃酮含量為93.056 mg/g。

表2 正交優(yōu)化實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

2.3 黃酮的抗氧化性的測定

2.3.1 黃酮對DPPH·自由基的清除效率

根據(jù)實驗結(jié)果所得吸光值，代入計算公式，得到黃酮對于 DPPH·自由基的清除率最高為91.58%。楊虎[21]篩得最優(yōu)提取玫瑰黃酮條件下，對DPPH·的清除率為88.28%。

2.3.2 黃酮對ABTS+自由基的清除效率

經(jīng)計算，黃酮對 ABTS+自由基的清除率為73.71%。陸秀云[26]玫瑰廢水中黃酮對ABTS+的最大清除率為98.96%。

2.3.3 黃酮對羥自由基清除效率

經(jīng)計算，黃酮提取液對羥自由基的抑制能力為467.91 U/mL。

2.4 黃酮的抑菌性研究

由玫瑰花渣黃酮的抑菌實驗結(jié)果見表3、圖5。由表3、圖5 可知，黃酮提取液對大腸桿菌沒有明顯的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌具有抑制性，尤其是對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，其抑菌圈均大于14 mm。

表3 黃酮提取液對細(xì)菌的抑菌圈Table 3 Bacteriostatic circle of flavonoid extract on bacteria

圖5 黃酮提取液對蠟樣芽孢桿菌（a）和金黃色葡萄球菌（b）的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of flavonoid extract on A (Bacillus cereus) and B (Staphylococcus aureus)

3 結(jié)論

根據(jù)上訴實驗結(jié)果，可以得到結(jié)論：經(jīng)過優(yōu)化后得到黃酮提取的最佳工藝為在乙醇濃度為60%、料液比1∶30，80 ℃水浴震蕩1.5 h，超聲處理45 min，超聲功率140 W，超聲溫度60 ℃，此時的所得黃酮提取量為58.53 mg/g，超聲法具有提取時間短、提取率高、溶劑需要量少等優(yōu)點[23]。此時黃酮對DPPH·自由基的清除率為91.58%，對ABTS+自由基的清除率為73.71%，對羥自由基的抑制能力為467.91 U/mL，且對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑制效果。