陳蓉，黃小貞2,，趙德剛,3

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽550025；2.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部DUS中心貴陽分中心，貴州 貴陽550006）

茶樹[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]是山茶科山茶屬植物，它是許多國家重要的木本經(jīng)濟(jì)作物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶國家[1]。水楊酸（salicylic acid，SA）是一種類似于植物酚類的激素，被認(rèn)為是介導(dǎo)防御機(jī)制的信號(hào)分子，在植物抗病防御過程中起著十分重要的作用[2]。大量已有研究表明SA的合成代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和脅迫應(yīng)答反應(yīng)[3,4]。另外，內(nèi)源SA含量對(duì)茶葉特殊香氣的形成以及病害響應(yīng)有重要作用[5-7]，因此，準(zhǔn)確測(cè)定茶樹中SA的含量具有重要意義。

目前檢測(cè)水楊酸含量的方法有紫外分光光度法和酸堿滴定法[8]、反相高效液相色譜法[9]、分光光度法[10]和在線光纖傳感同步吸收-熒光光譜法[11]等，其中高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography,HPLC）廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)學(xué)和法醫(yī)藥理學(xué)等領(lǐng)域[12]。其包括檢測(cè)器、色譜柱、進(jìn)樣器、色譜泵及控制器、數(shù)據(jù)處理和控制儀器的配置[13]，具有適用性比較廣泛、分析速度很快、分離效率極高、檢測(cè)靈敏及樣品回收利用簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[14]，應(yīng)用前景廣泛。相較于傳統(tǒng)的HPLC，超高效液相色譜法（ultra-efficient liquid chromatography,UPLC）具有分析速度更迅速、分離度更高和靈敏程度更強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[15]。目前未見報(bào)道使用UPLC方法檢測(cè)茶樹水楊酸的含量，而且提取茶樹水楊酸的方法還未見報(bào)道，所以建立茶樹水楊酸提取和UPLC的檢測(cè)方法尤為必要。

本研究選用4個(gè)關(guān)鍵可控參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，分別為流動(dòng)相配比、流速、進(jìn)樣量和柱溫，建立UPLC檢測(cè)水楊酸的體系，并通過方法學(xué)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其可靠性，以期為茶樹水楊酸的快速檢測(cè)提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器材料

本實(shí)驗(yàn)使用的黔茶一號(hào)茶苗購自貴州省湄潭星興茶葉專業(yè)合作社。

主要化學(xué)試劑：甲醇（TEDIA，色譜純）；甲醇（天津富宇，分析純）；磷酸（天津科密歐，色譜純）；乙酸（天津科密歐，色譜純）；水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品（ACMEC，純度≥98%）；三氯乙酸（天津科密歐，分析純）；乙酸乙酯（天津富宇，分析純）；環(huán)己烷（天津致遠(yuǎn)，分析純）。

主要實(shí)驗(yàn)操作儀器：UItiMate 3000超高效液相色譜儀（Thermo Scientific），Waters POSSIBLETMC18柱（4.6 mm 250 mm，5 um）。

1.2 試驗(yàn)方法

色譜條件：色譜柱；1%磷酸，1%乙酸-甲醇為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。

樣品處理：精確稱取新鮮葉片組織1.000g、2.000g、3.000g，放入20℃的冰箱冷凍30 min，研磨成勻漿，分別加入20 mL、40 mL和60 mL 90%的甲醇，將其轉(zhuǎn)移至3個(gè)干凈的50 mL的離心管中，渦旋震蕩1 min后，以10 000 r/min離心30 min，分別取其上清液，下層再加20mL、40mL和60mL純甲醇，渦旋震蕩1 min后，以10 000 r/min離心30 min，取上清液，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥（水溫40℃），分別用15 mL 5%的三氯乙酸溶解，再加入40 mL的乙酸乙酯和環(huán)己烷1:1混合物萃取。重復(fù)萃取一次，合并有機(jī)相，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干（水溫40℃）后，用10mL最佳溶劑定容，用0.45m微孔有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾，置于4℃保存。

最佳溶劑確定：分別用1%磷酸、1%乙酸、甲醇和無水乙醇作為溶劑，進(jìn)行超高效液相。

標(biāo)準(zhǔn)品配制：精確稱取水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg（精確至0.000 1 g）溶于最佳溶劑中，置于50 mL容量瓶中，用最佳溶劑溶解并定容至刻度，搖勻。用0.45m微孔有機(jī)濾膜過濾，制成0.400 mg mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

分別從標(biāo)準(zhǔn)品溶液取出1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、16 mL、32 mL于50 mL容量瓶中，用最佳溶劑混勻并定容至刻度。以峰面積為橫坐標(biāo)，水楊酸濃度為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程。

正交試驗(yàn)因素水平：通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)從而對(duì)茶樹中水楊酸的檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，包括考察流速（A）、柱溫（B）、1%磷酸、1%乙酸－甲醇溶液的配比（C）和進(jìn)樣量（D）對(duì)檢測(cè)效果的影響，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 The factor level of the the orthogonal test

加標(biāo)回收試驗(yàn)：取同一樣品3份，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液（終濃度分別為32g mL-1、64g mL-1、128g mL-1），在同一色譜條件下測(cè)定茶樹水楊酸含量，每個(gè)條件重復(fù)3次。

加標(biāo)回收率=［（加標(biāo)后測(cè)得量－樣品量）/加標(biāo)量］100%。

重復(fù)性和精密度試驗(yàn)：在優(yōu)化后的色譜條件下，取3份不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，1份標(biāo)準(zhǔn)品溶液分為6份，分別測(cè)定茶樹中水楊酸含量，計(jì)算6份樣品之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究采用Microsoft Excel和SPSS Statistics 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳溶劑的確定

無水乙醇和流動(dòng)相1%磷酸、1%乙酸與水楊酸有相同保留時(shí)間，且水楊酸難溶于流動(dòng)相1%磷酸、1%乙酸中，水楊酸在流動(dòng)相甲醇中溶解性好且沒有相同保留時(shí)間，故選擇甲醇作為最佳溶劑。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表（表2）進(jìn)行9組試驗(yàn)，每組重復(fù)3次，均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品含量測(cè)定。

水楊酸的濃度設(shè)置為y軸，峰面積設(shè)置為x軸。根據(jù)表2內(nèi)容，繪制9個(gè)不同處理組相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過數(shù)據(jù)求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表3）。結(jié)果表明，在9個(gè)不同檢測(cè)條件下，水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品在0.008~0.256 mg mL-1之間且R2在0.998 8~0.999 8之間浮動(dòng)，濃度及峰面積均呈現(xiàn)出良好的線性相關(guān)關(guān)系。

表3 水楊酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=9）Table 3 The standard curve of salicylic acid(n=9)

回收率方差和分離度方差分析結(jié)果（表4）表明，4因素對(duì)回收率影響均顯著；除了D因素，其他3因素對(duì)分離度影響也顯著?；厥章蕵O差（表2）大小為：C＞A＞D＞B，RSD在0.20%~0.55%之間波動(dòng)，分離度極差分析（表2）順序?yàn)镃＞A＞B＞D，RSD在0.9%~1.24%之間波動(dòng)，且均未超過2%。綜合方差分析和極差分析來看，4因素中對(duì)分離度影響最大的為C，對(duì)回收率影響最大的為A。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果（n=6）Table 2 The design and result of the orthogonal test(n=6)

表4 方差分析Table 4 ANOVA analysis

綜合回收率、分離度的極差分析與方差分析，4因素中對(duì)回收率和分離度的影響最大為C，最小是B。在4因素中選取最佳檢測(cè)方法為A2B1C2D2，流速為0.8 mL min-1，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為3L，1%磷酸、1%乙酸水溶液－甲醇的比為30:70。

2.3 方法學(xué)檢驗(yàn)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度 以最佳檢測(cè)方法：流速設(shè)置為0.8mL min-1，柱溫設(shè)置為30℃，進(jìn)樣量為3L，1%磷酸、1%乙酸水溶液－甲醇的配比為30:70。檢測(cè)水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積為橫坐標(biāo)，水楊酸濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖1）。曲線方程為y=0.062 9x-0.002 1，R2=0.999 8。表明水楊酸在0.008~0.256 mg mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 優(yōu)化條件下水楊酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of salicylic acid concentration under the optimized conditions

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和樣品（B、C、D）色譜圖Fig.2 The chromatograms of the standard(A)and spmples(B,C,D)

2.3.2加標(biāo)回收率結(jié)果如表5所示，3濃度條件下加標(biāo)樣品的回收率均高于96%，RSD=1.04%，RSD低于2%，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表明，此研究方法具有良好的回收率和準(zhǔn)確度，符合檢測(cè)的所需要求。

表5 回收率結(jié)果（n=9）Table 5 The results of the recovery rates(n=9)

2.3.3 精密度和重復(fù)性取3份不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，1份標(biāo)準(zhǔn)品溶液分為6份，在優(yōu)化條件下，分別測(cè)定后，計(jì)算6次進(jìn)樣的平均RSD，分別測(cè)得為0.23%、0.15%和0.11%（n=6），都低于2%，結(jié)果表明該方法精密度高，重復(fù)性良好，符合檢測(cè)要求。

2.3.4 樣品檢測(cè)在優(yōu)化后的色譜條件下，檢測(cè)水楊酸出峰時(shí)間（即保留時(shí)間）為4.323 min，峰型良好，樣品保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，檢測(cè)樣品的濃度分別為0.038 mg g-1（圖B）、0.024 mg g-1（圖D）和0.013mg g-1（圖C）。結(jié)果表明，檢測(cè)提取的樣品效果良好，并且出峰時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品的顯示一致，目標(biāo)峰沒有分叉和拖尾的現(xiàn)象，且分離度高，說明提取的茶樹水楊酸可以被此檢測(cè)方法分離出來。

3 討論

水楊酸在植物中含量較少且提取過程易升華[16,17]，因此，影響到分析結(jié)果最主要的因素是樣品的提取[18,19]。趙偉偉、鮑峰偉等[20,21]檢測(cè)蓬蘽懸鉤子和煙草中水楊酸含量，采用高效液相色譜法對(duì)懸鉤子和煙草中的水楊酸進(jìn)行了甲醇直接萃取、三氯乙酸萃取、乙醚反萃取和三氯乙酸萃取，但是通過分析結(jié)果顯示，使用甲醇提取的樣品成分比較復(fù)雜，對(duì)水楊酸的測(cè)定干擾極大；三氯乙酸萃取樣品的目標(biāo)峰與雜峰不能完全分離。本試驗(yàn)參照楊國慧、王倩倩等[22,23]提取樹莓葉片和果實(shí)中水楊酸的方法，利用有機(jī)溶劑甲醇粗提、乙酸乙酯和環(huán)己烷萃取的方法，液相分析結(jié)果表明，提取的茶樹水楊酸峰形良好，雜峰比較少，但是提取的水楊酸溶液中摻雜有色素污染。與王倩倩[23]的報(bào)道相似。因此，色素的去除還有待于進(jìn)一步研究，從而穩(wěn)定水楊酸的檢測(cè)方法。

在整個(gè)提取茶樹水楊酸和檢測(cè)含量過程中，水楊酸易分解的性質(zhì)在一定程度上會(huì)給檢測(cè)到的結(jié)果帶來誤差。本研究對(duì)提取茶樹水楊酸和測(cè)定的過程中進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)若在提取過程中操作迅速并且在避光狀態(tài)下，可以有效減少水楊酸分解。提取的水楊酸避光并短時(shí)間保存于4℃效果最佳，檢測(cè)過程中樣品放置溫度宜在4℃條件下；宜用HPLC或UPLC檢測(cè)的物質(zhì)沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差且具有生理活性以及相對(duì)分子質(zhì)量較大[24]。本研究結(jié)果表明，UPLC的柱效較高，9個(gè)處理的回收率均不低于85%，在85.78%~98.91%之間波動(dòng)，各組的RSD均小于2%。本研究探索出的UPLC檢測(cè)方法，不但分離效果與回收率得到了保證，而且低流速流動(dòng)相的使用和待測(cè)物的迅速出峰，最終達(dá)到了減少流動(dòng)相的使用和縮短檢測(cè)用時(shí)的目的[25]。

本研究通過優(yōu)化色譜條件，發(fā)現(xiàn)此條件下檢測(cè)茶樹水楊酸樣品的效果良好，具有出峰時(shí)間短、峰型良好且分離度高等優(yōu)點(diǎn)，此UPLC檢測(cè)方法可為茶樹水楊酸的快速高效檢測(cè)提供參考。