唐敏，王恩鵬，陳雪，李瓊，王歡，陳長(zhǎng)寶

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春130117）

猴頭菌（Hericium erinaceus）隸屬擔(dān)子門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）紅菇目（Russulales）猴頭菌科（Hericiaceae）猴頭菌屬（Hericium）[1]，具有一定的抗氧化、抗菌、抗衰老、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)、抗炎等作用[2-7]。作為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源的大型真菌，因其具有重要的食用價(jià)值和藥用功效而受到了消費(fèi)者的廣泛喜愛。人參（Panax ginseng C.A.Mey.）為多年生宿根陰性草本雙子葉植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有抗癌、抗腫瘤、抗焦慮和保護(hù)心腦血管等活性作用[8,9]，具有顯著的藥理活性和極高的藥用價(jià)值。

受猴頭菌及人參的資源限制及市場(chǎng)價(jià)格的影響，使這兩種珍貴資源未能得到很好地開發(fā)利用。首先，本實(shí)驗(yàn)從微生物角度出發(fā)，采用新型發(fā)酵技術(shù)，即以猴頭菌為發(fā)酵菌種、人參為藥性基質(zhì)進(jìn)行雙向固體發(fā)酵。在此發(fā)酵體系中，人參既能為猴頭菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，又能通過猴頭菌次生代謝產(chǎn)物修飾某些藥效物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而獲得具有更高藥效活性的物質(zhì)；其次，以猴頭菌-人參雙向固體發(fā)酵得到的菌質(zhì)為原材料進(jìn)行提取，利用提取物進(jìn)行二次開發(fā)。希望通過這種猴頭菌與人參有機(jī)結(jié)合的新型發(fā)酵技術(shù)，可以大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物的食藥用價(jià)值，為日后中藥材藥渣的開發(fā)及利用提供新的思路，同時(shí)，希望通過該方法可深入挖掘其食藥用價(jià)值，實(shí)現(xiàn)對(duì)猴頭菌及人參的市場(chǎng)再開發(fā)，為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供新途徑及新思路。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

猴頭菌由吉林省生物研究所張金亭研究員贈(zèng)予；人參購(gòu)自吉林省怡生對(duì)外貿(mào)易有限公司；葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母粉及瓊脂粉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木糖醇、糊精、微晶纖維素、淀粉、乳糖及蔗糖購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SLI-700恒溫培養(yǎng)箱（上海愛朗儀器有限公司）；YXQ-LS-50A壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；ZQZY-85CNS震蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；BT25S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；A11BS025粉碎機(jī)（德國(guó)IKA）；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種培養(yǎng)及固體發(fā)酵菌質(zhì)提取物的制備

將保存于4℃冰箱的猴頭菌菌種在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基中，于26℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)，待猴頭菌菌絲布滿培養(yǎng)基表面時(shí)進(jìn)行液體菌種的培養(yǎng)。取1 cm大小的菌塊接種于液體培養(yǎng)基中（葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、KH2PO42 g、MgSO47 H2O 1 g、蒸餾水1 L），在26℃、160 r/min的黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)液體培養(yǎng)基中含有大量黃色菌球時(shí)，終止液體發(fā)酵。

將人參藥材粉碎，過篩裝瓶，加適量水，121℃高壓滅菌30 min，待藥性基質(zhì)冷卻至室溫后，將液體菌種接至人參藥性基質(zhì)中，避光培養(yǎng)。當(dāng)猴頭菌菌絲布滿整個(gè)藥性基質(zhì)且形成明顯的菌蕾結(jié)構(gòu)時(shí)，即為發(fā)酵終點(diǎn)。取出發(fā)酵菌質(zhì)，40℃烘干，密封保存。稱取適量上述固體發(fā)酵菌質(zhì)，采用水煎煮法對(duì)其進(jìn)行提取、濃縮，得菌質(zhì)浸膏（浸膏相對(duì)密度約為1.3），備用。

2.2 顆粒劑的制備工藝

采用濕法制粒，準(zhǔn)確稱取發(fā)酵菌質(zhì)提取物1 g，輔料適量，混勻，制軟材，過14目篩進(jìn)行制粒，將濕顆粒置于60℃烘箱烘干2 h后，利用藥典1號(hào)篩與5號(hào)篩進(jìn)行整粒，得菌質(zhì)顆粒劑，將制備好的顆粒劑裝入自封袋中，置于干燥器中保存。

2.2.1 矯味劑用量由于猴頭菌-人參發(fā)酵菌質(zhì)自身具有獨(dú)特的味道，為改善菌質(zhì)顆粒的口感，本實(shí)驗(yàn)分別選用蘋果、葡萄、大棗和山楂4種水果，經(jīng)熱水提取、濃縮，得到相對(duì)應(yīng)的4種果味浸膏（浸膏相對(duì)密度為1.18~1.2）。以上述實(shí)驗(yàn)室自制的4種水果浸膏與菌質(zhì)浸膏分別按0.5:1、1:1、1.5:1、2:1和3:1的比例逐一進(jìn)行混合，以感官評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，共10人對(duì)顆粒進(jìn)行品嘗，根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果選擇合適的矯味劑用量。

2.2.2 單一輔料篩選將浸膏與輔料微晶纖維素、木糖醇、蔗糖、淀粉、可溶性淀粉、麥芽糊精、甘露醇和乳糖分別按1:2、1:3、1:4和1:5的比例逐一進(jìn)行制粒工藝的摸索，篩選出最佳輔料用量。

2.2.3 復(fù)合輔料篩選浸膏+乳糖+其他輔料、浸膏+蔗糖+其他輔料和浸膏+木糖醇+其他輔料進(jìn)行最佳復(fù)合輔料處方的篩選。

2.3 顆粒劑指標(biāo)考察

通過測(cè)定顆粒劑的成型率、堆密度、休止角、溶化率和吸濕率，評(píng)判得出各處方相應(yīng)分值，以其綜合評(píng)分值為評(píng)判指標(biāo)，篩選得出最佳輔料配比。采用百分制的綜合評(píng)分方法對(duì)顆粒劑的質(zhì)量進(jìn)行考察，綜合得分=（15/最大成型率值）成型率值+（最小休止角值15）/休止角值+（15/最大堆密度值）堆密度值+（20/最大溶化性值）溶化性值+（最小吸濕率值35）/吸濕率值[10]。

2.3.1 成型率的測(cè)定將制備好的顆粒劑稱重，分別過藥典1號(hào)篩和5號(hào)篩，收集能過1號(hào)篩但不能通過5號(hào)篩的顆粒，稱重。按如下公式進(jìn)行計(jì)算，成型率=（能通過1號(hào)篩而不能通過5號(hào)篩的顆粒質(zhì)量/過篩前的顆粒質(zhì)量）100%。

2.3.2休止角的測(cè)定休止角指粉體堆積成的自由斜面與水平面所形成的最大角，休止角越小，流動(dòng)性越好。本文采用固定漏斗法，將3只漏斗串聯(lián)并固定在水平的坐標(biāo)紙上1~2 cm的高度，將顆粒從最上面的漏斗壁慢慢加入，直到顆粒在坐標(biāo)紙上形成一個(gè)圓錐體，圓錐體的頂端與最下面的漏斗口接近為止，由坐標(biāo)紙測(cè)出圓錐體的直徑（2 R），并測(cè)定圓錐體的高度（H），按公式tg=H/R計(jì)算出休止角，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算平均值。

2.3.3 堆密度的測(cè)定取適量整粒后的顆粒稱重，質(zhì)量記為（M），放入干燥的量筒內(nèi)，輕輕震搖均勻后，讀取量筒刻度（V），二者比值即為堆密度，堆密度值=M/V。

2.3.4 顆粒溶化率的測(cè)定精密稱取干燥顆粒0.5 g，加入到10 mL干燥恒重的離心管中，加入沸水5 mL，振蕩5 min，3 000 r/min的條件下離心15 min，棄上清液，將殘?jiān)?0℃下烘干至恒重，精密稱定，計(jì)算顆粒的溶化率。溶化率=（顆?？傎|(zhì)量未溶化的顆粒質(zhì)量）/顆?？傎|(zhì)量）100%。

2.3.5 吸濕性的測(cè)定精密稱取烘干至恒重的一定量顆粒，平鋪于干燥至恒重的稱量瓶中，厚度不超過5 mm。將放有NaCl過飽和溶液的干燥器在室溫下放置48h，使其相對(duì)濕度為75%。將顆粒劑置于干燥器內(nèi)，定時(shí)補(bǔ)足NaCl至形成飽和溶液，于48 h后精密稱定，計(jì)算顆粒劑的吸濕率。吸濕率=（吸濕后顆粒質(zhì)量吸濕前顆粒質(zhì)量）/吸濕前顆粒質(zhì)量100%，計(jì)算吸濕率。

3 結(jié)果與分析

3.1 矯味劑用量結(jié)果

根據(jù)不同品嘗者的評(píng)價(jià)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)果味浸膏的比例較小時(shí)，顆粒口感較苦；當(dāng)果味浸膏的比例過大時(shí)，掩蓋了菌質(zhì)本身的味道且顆?？诟羞^甜；最終確定果味浸膏（g）和菌質(zhì)浸膏（g）比例為2:1時(shí)，顆?？诟性u(píng)價(jià)最佳，具有較適宜的酸甜口感且保留了菌質(zhì)的味道，故以此浸膏比例為最佳的矯味劑用量。

3.2 單一輔料篩選結(jié)果

當(dāng)浸膏與淀粉、乳糖的比例分別為1:2、1:5時(shí)可成功制粒，但浸膏與輔料微晶纖維素、可溶性淀粉和麥芽糊精等輔料單獨(dú)制粒時(shí)，軟材不合格，無(wú)法成功制粒。

3.3 復(fù)合輔料篩選結(jié)果

根據(jù)單一輔料的篩選結(jié)果，進(jìn)一步選擇適宜輔料進(jìn)行混合輔料的篩選。稱取浸膏適量，分別與復(fù)合輔料進(jìn)行制粒，制粒結(jié)果見表1、表2和表3。通過對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定的輔料比例下，乳糖及木糖醇可與大多數(shù)輔料進(jìn)行制粒工藝的研究，同時(shí)，通過本實(shí)驗(yàn)對(duì)蔗糖進(jìn)行工藝對(duì)比發(fā)現(xiàn)，蔗糖與淀粉復(fù)合使用時(shí)，顆粒劑具有更高的成型性。

表1 乳糖與微晶纖維素、糊精、甘露醇、淀粉比例考察Table 1 The investigation of the ratio of lactose to microcrystalline cellulose,dextrin,mannitol and starch

表2 蔗糖與微晶纖維素、糊精、甘露醇、淀粉比例考察Table 2 The investigation of the ratio of sucrose to microcrystalline cellulose,dextrin,mannitol and starch

表3 木糖醇與微晶纖維素、糊精、甘露醇、淀粉比例考察Table 3 The investigation of the ratio of xylitol to microcrystalline cellulose,dextrin,mannitol and starch

3.4 最佳符合輔料處方篩選結(jié)果

通過對(duì)以上復(fù)合輔料的篩選，最終得到8種最優(yōu)輔料處方，見表4。采用綜合評(píng)分法對(duì)該8種處方的成型率、休止角、堆密度和溶化率等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果，見表5。根據(jù)表5結(jié)果可知，處方4的評(píng)分最高，即當(dāng)浸膏、乳糖和淀粉的比例為1:2:1時(shí)，可作為猴頭菌-人參菌質(zhì)顆粒劑的最優(yōu)處方。根據(jù)最優(yōu)處方的復(fù)合輔料配比進(jìn)行工藝放大驗(yàn)證，得到的顆粒成粒性好，溶化性佳，證明該顆粒劑的工藝條件穩(wěn)定可行，為進(jìn)一步開發(fā)猴頭菌-人參菌質(zhì)產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。

表4 復(fù)合輔料最佳處方篩選結(jié)果Table 4 The screening results of the best prescriptions for compound excipients

表5 復(fù)合輔料最佳處方綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 The comprehensive evaluation results of the best prescription of compound excipients

4 討論

利用猴頭菌與人參雙向發(fā)酵得到的固體菌質(zhì)，既保留了猴頭菌與人參的原有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又提高了藥效物質(zhì)的含量、豐富了藥效物質(zhì)的種類。王洪峰等[11]在研究人參雙向固體發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)微生物次生代謝產(chǎn)物的作用下，人參的化學(xué)成分發(fā)生了一定的轉(zhuǎn)化，在人參藥性菌質(zhì)中檢測(cè)到大量稀有人參皂苷，推測(cè)人參皂苷Rg1、Re和Rb可能轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3和Rh等。而稀有人參皂苷在更利于人體吸收的同時(shí)具有更高效的藥理活性作用，如Rg2和Rg3具有更高效的抗焦慮、抗炎和抗癌活性作用[8,9]，CK和F12在抗腫瘤、抗突變、抗炎保肝及抗哮喘等諸多方面都表現(xiàn)出良好的藥效活性[12-18]。

本文以發(fā)酵菌質(zhì)為原材料，采用濕法制粒法對(duì)猴頭菌-人參固體發(fā)酵菌質(zhì)顆粒劑的制粒工藝進(jìn)行探索。利用水煎煮工藝提取菌質(zhì)中的有效活性物質(zhì)，以乳糖、蔗糖和木糖醇等傳統(tǒng)輔料進(jìn)行顆粒劑最佳輔料的摸索，同時(shí)以水果浸膏為矯味劑調(diào)整顆粒劑的口感，使顆粒劑滿足大多數(shù)人的感官需求。通過對(duì)復(fù)合輔料處方配比的進(jìn)一步優(yōu)化，以成型率、休止角、堆密度、溶化率和吸濕性為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行顆粒劑的綜合評(píng)分，確定了輔料浸膏、乳糖和淀粉配比為1:2:1，為猴頭菌-人參固體菌質(zhì)顆粒劑的最佳輔料配比。希望通過本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為我國(guó)傳統(tǒng)的猴頭菌及人參加工方式提供新的思路，為進(jìn)一步研發(fā)相關(guān)食品及保健品提供新的發(fā)展方向，為深入開發(fā)猴頭菌與人參的寶貴資源提供科學(xué)背景。