孫丹丹，鄒宜芳，宋柳，楊浩，初迪，韓淑蘭，劉昕，郭建鋒

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春130021）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，已成為全球第四大致命癌癥。據(jù)2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計，新確診CRC患者約180萬人，且每年有近90萬人死于該病，約占每年診斷出的癌癥和癌癥死亡數(shù)的10%[1,2]。目前，早期CRC治療方法主要包括內(nèi)窺鏡或手術(shù)局部切除、局部消融治療和姑息化療等，晚期CRC治療方法主要包括化療和放射性治療。但大劑量的化放療產(chǎn)生不良反應(yīng)和副作用，例如神經(jīng)毒性和肝毒性[3-5]，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，因此，建立更安全、有效的CRC治療方法已成為醫(yī)藥學(xué)界亟待解決的重點問題。

人參系五加科多年生草本植物人參（Panaxginseng）的根莖，在我國有著幾千年的藥用歷史。人參皂苷是人參中主要的活性物質(zhì)，其中人參皂苷Rg3和人參皂苷Rh2具有抑制多種癌細(xì)胞生長的作用[6,7]。近年來，大量的文獻[8-11]顯示人參皂苷Rg3在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥、與化療聯(lián)合協(xié)同增效及提高機體免疫力等方面具有顯著的作用。目前，已證實Rg3也可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的增殖和遷移，但其體外促進結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡機制還需進一步研究[12]。

為更好地研究Rg3的抗腫瘤效果，本文對其體外抗癌機制進行了研究。采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）對Rg3單體進行含量測定，并利用流式細(xì)胞術(shù)法和蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot,WB）測定Rg3誘導(dǎo)結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞凋亡，為建立新型結(jié)直腸癌免疫治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；全自動雪花制冰機（常熟雪科電器有限公司）；高速冷凍離心機（Eppendrof有限公司）；低溫離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司)；電子分析天平（美國丹佛儀器公司）；移液器（Thermo公司）；超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；CO2培養(yǎng)箱（SANYO公司）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（北京東勝創(chuàng)新科技有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；立式蒸汽壓力滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；垂直電泳槽（上海天能科技有限公司）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；迷你轉(zhuǎn)印儀（杭州諾揚生物技術(shù)有限公司）；多功能熒光酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；MYC-80上下?lián)u蹺蹺板式振蕩器（常州榮華儀器）。

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Corning公司）；0.25%胰酶-EDTA（美國Corning公司）；FBS（以色列Biological Industries公司）；青-鏈霉素雙抗（以色列Biological Industries公司；臺盼藍（北京索萊寶科技有限公司）；DMSO（天津百倫斯生物技術(shù)有限公司）；PMSF（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；RIPA細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA工作液（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；5 Protein Loading Buffer（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；牛血清白蛋白（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；SDS-PAGE預(yù)制膠（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；SDS（北京博奧拓達科技有限公司）；甘氨酸（美國VWR生命科技公司）；Tris（北京博奧拓達科技有限公司）；吐溫-20（北京博奧拓達科技有限公司）；抗體Affinity（北京生物科技有限公司）；ECL發(fā)光液（上海翊圣生物科技有限公司）；Rg3（成都德斯生物技術(shù)有限公司）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件的確定與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為迪馬C18色譜（4.6 mm 150 mm,5m）；流動相為50%乙腈和50%超純水（含0.05%磷酸）；檢測波長為203 nm；柱溫為30℃；進樣量為20L；流速為1.0 mL/min。理論塔板數(shù)按Rg3色譜峰計算，不得低于3 000。

2.2 MTT法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞屬貼壁生長細(xì)胞，使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基，內(nèi)含1%的雙抗和10%的FBS，在37℃、5%CO2和95%空氣的無菌培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

2.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇在超凈臺中提前做好準(zhǔn)備工作，取15 mL離心管，加入9 mL培養(yǎng)基備用，另取T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入5 mL完全培養(yǎng)基，準(zhǔn)備完畢。將細(xì)胞從液氮中取出后，迅速在37℃恒溫水浴鍋中溶解，可適當(dāng)輕輕搖動以加速溶解，完全溶解后，適當(dāng)噴灑75%的酒精滅菌，快速移入超凈臺中，取出液體加入到事先準(zhǔn)備好的離心管中，1 000 r/min離心5 min，離心后，棄上清液，加入適量完全培養(yǎng)基于離心管中，輕柔吹打重懸后，將重懸液吸出，全部加入到事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶中，輕柔搖晃使細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中分布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第2天觀察細(xì)胞狀態(tài)，若貼壁良好，棄掉舊培養(yǎng)基，無菌PBS清洗后，更換新培養(yǎng)基。

2.2.3 細(xì)胞傳代在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞長至70%~90%時對細(xì)胞進行傳代。棄掉舊培養(yǎng)基，無菌PBS清洗后，加入適量含EDTA的胰酶進行消化，若細(xì)胞難消化可置于37℃培養(yǎng)箱中消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞呈圓形、培養(yǎng)瓶底部呈現(xiàn)霧狀時，加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，用移液槍適當(dāng)輕柔吹打培養(yǎng)瓶底部，盡量將全部細(xì)胞吹打下來，將培養(yǎng)瓶中的液體移到15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，離心后，棄上清液，加入適量完全培養(yǎng)基于離心管中，輕柔吹打重懸后，吸取適量重懸液加入到含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，輕柔搖晃使細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中分布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.4 細(xì)胞凍存取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行凍存。按照FBS:DMSO為9:1的比例配制細(xì)胞凍存液。棄掉舊培養(yǎng)基，PBS清洗后，加入適量含EDTA的胰酶進行消化，加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，將培養(yǎng)瓶中的液體移到15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，離心后，棄上清液，加入適量細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，然后在凍存管中加入1 mL上述重懸液，封口膜封口。將凍存管放置在4℃冰箱30 min，﹣20℃冰箱2~4 h，﹣80℃冰箱中過夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。

2.2.5 IC50測定 取處于對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞進行鋪板，待細(xì)胞長至約70%時，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min；PBS重懸細(xì)胞，使用臺盼藍進行計算細(xì)胞懸液濃度，按所得的結(jié)果將細(xì)胞懸液加入到96孔板中，5 000個/孔，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，當(dāng)96孔板內(nèi)細(xì)胞密度為65%~75%時給藥。將Rg3配制成一定濃度的母液，用完全培養(yǎng)基梯度稀釋母液至設(shè)定的濃度。給藥孵育24 h后，小心吸出孔內(nèi)含藥培養(yǎng)基，每孔更換100L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后每孔加入20L上述配制得到的MTT溶液，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育4 h，孵育完成后，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150L DMSO，放置于微孔板恒溫振蕩器中，37℃震蕩孵育10 min，使孔內(nèi)甲瓚充分溶解于DMSO中。使用酶標(biāo)儀570 nm下檢測各孔吸光度值，細(xì)胞存活率按照以下公式進行計算，并采用GraphPad Prism8.0軟件計算IC50。

2.3 細(xì)胞凋亡測定

取2 mL對數(shù)生長期CT26細(xì)胞于6孔板中，每空細(xì)胞初始密度為2 105個，過夜，待細(xì)胞貼壁，長到60%左右進行給藥。設(shè)置對照組以及給藥6、12和24 h，給藥濃度為2.2.5項中得到的IC50。棄掉孔中舊培養(yǎng)基，1 PBS輕柔洗一遍，使用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞（消化時間不宜過長，否則會影響細(xì)胞膜上PS與Annexin-V-FITC的結(jié)合；如果用含EDTA的胰酶消化，必須徹底清除EDTA：標(biāo)記前用1 PBS或1 binding buffer洗滌，清除EDTA，以免殘留的EDTA與Ca2+螯合影響Annexin-V的結(jié)合），室溫2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。1 PBS重懸，2 000 r/min離心5 min，棄上清液；加300L 1 binding buffer重懸細(xì)胞；加10L Annexin-V-FITC，渦旋混勻，避光常溫孵育15 min；上流式細(xì)胞儀前5 min加10L PI；上流式細(xì)胞儀前補200L 1 binding buffer。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法

2.4.1 細(xì)胞鋪板和給藥消化細(xì)胞后使用臺盼藍計數(shù)，取10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿，每皿加入2 106個細(xì)胞和10 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁，長至60%左右進行給藥。設(shè)置3個時間點6 h、12 h和24 h，給藥濃度為2.2.5項中得到的IC50。

2.4.2 總蛋白提取 棄上清液，用無菌PBS清洗細(xì)胞3次；RIPA裂解液與PMSF按100:1混勻，使PMSF終濃度達到1 mmol/L，置于冰上待用；在培養(yǎng)皿中加入200L配制好的RIPA裂解液，用細(xì)胞刮刀使RIPA裂解液與細(xì)胞充分接觸裂解；吸取裂解后的液體至1.5mL EP管中，14 000 g、4℃離心5 min，小心吸取上清液至新的EP管中，于﹣80℃冰箱保存。

2.4.3 BCA法測定蛋白濃度 按照BCA說明書，將試劑盒中的Solution A和Solution B以50:1的比例混合均勻，配制成BCA工作液；BSA Protein Standard母液為2 mg/mL，用蒸餾水稀釋成不同濃度的液體，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；向96孔板中加入20L上述不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白、待測樣品和空白對照（n=3），每孔再分別加入200L BCA工作液，37℃恒溫振蕩，孵育30 min；待冷卻至室溫后，用多功能酶標(biāo)儀檢測562 nm處的吸光值。根據(jù)設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算待測蛋白樣品濃度；根據(jù)計算得到的樣品濃度，將同組樣品稀釋成同一濃度，以方便后續(xù)試驗。

2.4.4 電泳將蛋白樣品和5 Loading buffer按照4:1的體積比混合均勻，95℃水浴煮沸10 min，使蛋白變性；將預(yù)制膠膠板安裝到電泳槽中，加入1電泳緩沖溶液，拔出梳子，按照預(yù)先設(shè)計好的方式，在各孔中分別加入蛋白marker或蛋白樣品。初始電壓100 V，待樣品到達分離膠后，將電壓調(diào)整為130 V。

2.4.5 轉(zhuǎn)膜將配制的1電轉(zhuǎn)緩沖溶液在冰上預(yù)冷；裁剪一定規(guī)格和數(shù)量的濾紙備用；將PVDF膜提前5min浸泡在甲醇中激活；根據(jù)所檢測蛋白的分子量，切取對應(yīng)位置的凝膠；在轉(zhuǎn)膜陰極板上依次鋪海綿、3層濾紙、凝膠和PVDF膜，使用滾膠棒緩緩排除凝膠和PVDF膜之間的氣泡，使二者緊密貼合；再依次蓋上3層濾紙、海綿，夾緊夾板，放置在電轉(zhuǎn)槽中，加滿預(yù)冷的1電轉(zhuǎn)緩沖溶液，恒流濕轉(zhuǎn)，200 mA恒流，電壓調(diào)至最大，轉(zhuǎn)膜90 min，注意整個轉(zhuǎn)膜過程在冰上進行。轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至5%BSA封閉液中，放置在翹板搖床上，輕微晃蕩孵育3 h。

2.4.6 孵育抗體封閉后，將一抗按照推薦比例用封閉液稀釋，分別加入到對應(yīng)的PVDF膜上，4℃孵育過夜；吸出一抗稀釋液，用TBST洗膜5次，每次5 min；將二抗按照推薦比例稀釋后，加入到PVDF膜上，室溫條件下，避光孵育1 h，TBST洗膜5次，每次5 min。

2.4.7 顯影按照ECL顯影試劑盒說明，將A液和B液按照1:1混合均勻，避光；將PVDF膜浸入ECL工作液中，孵育1 min；使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀掃描成像，使用Image J軟件計算各組蛋白條帶灰度值，計算相對表達量。

2.5 統(tǒng)計分析

本實驗采用Graphpad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 液相條件確定

陰性樣品、對照品溶液色譜圖見圖1 A。在與對照品峰相應(yīng)的保留時間位置無干擾峰檢出，即陰性無干擾。由圖1 B可見，供試品溶液在色譜圖相應(yīng)的位置上有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照溶液在此無峰，各主成分峰與其他組分分離良好，說明陰性樣品對Rg3含量測定無干擾。

3.2 體外抑瘤效果

隨著Rg3濃度增加對CT26細(xì)胞毒性增強，可知，Rg3對CT26細(xì)胞具有抑制作用。如圖2，當(dāng)Rg3濃度增加至12.5g/mL時，對CT26細(xì)胞開始出現(xiàn)毒性作用；隨著濃度增至100g/mL時，CT26細(xì)胞存活率僅為（10.2±1.43）%，證明Rg3對CT26細(xì)胞有明顯的抑制作用，且隨給藥濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸下降。通過Graphpad Prism 8.0軟件對實驗結(jié)果進行處理，計算各細(xì)胞半數(shù)抑制最大濃度（median inhibition concentration,IC50），結(jié)果所得Rg3對CT26細(xì)胞的IC50值為（27.36±8.75）g/mL。

3.3 細(xì)胞凋亡

3.3.1 促進細(xì)胞凋亡 結(jié)果如圖3和圖4所示，細(xì)胞凋亡率與給藥時間呈正相關(guān)。在給藥6 h后開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，但與對照組相比差異不大；在給藥12 h后凋亡細(xì)胞顯著增加（P＜0.01），且在給藥12 h到24 h之間凋亡細(xì)胞持續(xù)增多，尤其是CT26凋亡細(xì)胞數(shù)量由12 h的30%左右增加至24 h的80%。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測分析Rg3處理CT26細(xì)胞后6 h、12 h、24 h細(xì)胞凋亡水平Fig.3 The apoptosis level of CT26 cell after treated with Rg3 determined for 6 h,12 h and 24 h by the flow cytometry

圖4 流式細(xì)胞儀檢測分析Rg3處理CT26細(xì)胞后6 h、12 h、24 h細(xì)胞凋亡水平量化圖Fig.4 The apoptosis of CT26 cell treated with Rg3 determined for 6 h,12 h and 24 h by the flow cytometry

3.3.2 抑制細(xì)胞凋亡如圖5，實驗已證明Rg3能夠活化多種Caspase蛋白從而誘導(dǎo)凋亡，因此通過抑制Caspase家族蛋白，可以間接證明Rg3對CRC細(xì)胞的抑制作用是通過凋亡引起的[13]。Z-VAD-FMK是Caspase家族蛋白抑制劑，能夠不可逆地抑制Caspase蛋白活性。實驗設(shè)計對照組和實驗組，其中Z-VAD-FMK和Rg3聯(lián)合給藥組，需在給藥前用Z-VAD-FMK預(yù)孵育4 h。如圖5所示，與對照組相比，Z-VAD-FMK組未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）；而在相同給藥濃度的兩組中，使用Z-VAD-FMK預(yù)孵育的細(xì)胞存活率有所增加（P＜0.05），說明封閉Caspase家族蛋白活性可減少細(xì)胞的凋亡死亡數(shù)量，側(cè)面證明了Rg3可以通過凋亡的方式抑制腫瘤細(xì)胞生長，但是考慮到Z-VADFMK并未完全逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的死亡趨勢，推測Rg3并非僅通過凋亡的方式引起細(xì)胞死亡。

圖5 MTT法檢測分析Z-VAD-FMK對Rg3處理CT26細(xì)胞毒性的影響Fig.5 The effect of Z-VAD-FMK on the toxicity of CT26(A)cells treated with Rg3 was analyzed by MTT assay

3.4 蛋白免疫印跡

如圖6和表1所示，活化的c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK激酶）即P-JNK（46+54 kDa）表達較對照組顯著增加（P＜0.001,P＜0.01）。JNK激酶可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基膜上的促凋亡因子BAX構(gòu)象改變而活化，并弱化BCL-2的抗凋亡能力，這與實驗結(jié)果相一致；BAX（21 kDa）在CT26結(jié)直腸癌細(xì)胞系中表達顯著增加（P＜0.01,P＜0.01），而BCL-2（26 kDa）呈現(xiàn)完全相反的趨勢（P＜0.001,P＜0.01），這也暗示著Rg3在激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的同時，能進一步誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。

圖6 WB法檢測CT26細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（BCL-2、BAX）表達情況Fig.6 The expression of apoptosis related proteins(BCL-2,BAX)in CT26 cells was detected by WB

表1 CT26細(xì)胞內(nèi)凋亡通路蛋白（BCL-2,BAX）相對表達量Table 1 The relative expression of apoptosis pathway protein(BCL-2,BAX)in CT26 cells

4 討論

CRC的治療現(xiàn)狀并不理想，傳統(tǒng)的手術(shù)治療僅適用于癌癥早期，且會嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，因此，建立更安全、有效的CRC治療方法已成為醫(yī)藥學(xué)界亟待解決的重點問題[14]。

研究表明，人參皂苷Rg3在一定濃度范圍內(nèi)可以明顯促進乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，這可能與人參皂苷Rg3通過干擾乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的MGBA基因的表達，從而影響H2S/CSE系統(tǒng)的活性得以實現(xiàn)[15]。Rg3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制研究表明，Rg3通過SP1升高和HSF1下調(diào)抑制了FUT4的表達，說明人參皂苷Rg3對胃癌患者具有有效的治療作用[16]。由上可知，Rg3具有體外抑制腫瘤生長的作用，且機制各不相同。人參皂苷Rg3還可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞的增殖，促進其凋亡，機制可能與抑制細(xì)胞間黏附分子1的表達，活化閉鎖蛋白的表達有關(guān)[17]。但其對凋亡相關(guān)蛋白沒做進一步研究，因此，我們進一步探討了Rg3誘導(dǎo)結(jié)直腸癌凋亡作用，初步研究了其下游誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的機制。

隨著Rg3濃度增加，對CT26細(xì)胞出現(xiàn)明顯的抑制作用，同時Rg3可促進CT26細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，然而Caspase抑制劑可阻斷Rg3誘導(dǎo)CT26細(xì)胞的凋亡，進一步證明Rg3通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺傷CT26細(xì)胞。本文為人參皂苷研究和抗腫瘤藥物開發(fā)提供依據(jù)，也為CRC的免疫治療提供了思路和方法。