喬成桓,楊 凌,范雪彤,潘仕梅,楊守軍

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院,山東 煙臺 264670

沼液是有機(jī)廢棄物經(jīng)厭氧發(fā)酵后獲得的富含氮磷鉀養(yǎng)分、植物生長激素的液體有機(jī)肥料，具有提升農(nóng)田耕地質(zhì)量、增產(chǎn)提質(zhì)的作用。在國家大力推進(jìn)保護(hù)環(huán)境優(yōu)先、廢棄物資源化利用的形勢下，沼液消納和安全施用不僅是沼氣工程可持續(xù)運(yùn)行的核心，更是構(gòu)建生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)體系、化肥減量的關(guān)鍵。眾多研究表明，沼液還田可有效提高土壤養(yǎng)分，提高微生物代謝活性和生物多樣性[1-3]。由于沼液中含有大腸桿菌等致病菌，施用后可能造成土壤污染，并通過食物鏈對人體造成傷害，制約了沼液的還田利用[4]。因此，研究不同溫度下土壤中源自沼液的大腸桿菌的變化規(guī)律顯得尤為重要。

目前有關(guān)土壤溫度對大腸桿菌數(shù)量消漲變化規(guī)律的研究存在不同觀點(diǎn)。有學(xué)者認(rèn)為土壤溫度為5 ℃時(shí)，大腸桿菌滅活時(shí)間比37 ℃處理更長，但有的研究發(fā)現(xiàn)相比于44 ℃，37 ℃更有利于牛糞水中大腸桿菌的生存，低于一定溫度時(shí)大腸桿菌滅活時(shí)間與溫度成負(fù)相關(guān)[5-7]。造成這種現(xiàn)象的原因，可能是因?yàn)榇竽c桿菌屬于中溫型微生物，當(dāng)溫度不適宜微生物生存時(shí)，其新陳代謝、數(shù)量和活性將發(fā)生變化[8]。除了溫度對土壤中大腸桿菌數(shù)量產(chǎn)生顯著影響外，土壤質(zhì)地、總碳、總氮、硝酸鹽等土壤理化性質(zhì)也對大腸桿菌具有顯著影響，說明土壤中大腸桿菌數(shù)量的變化是多種影響因素共同作用的結(jié)果[9-12]。目前，有關(guān)土壤溫度變化以及土壤溫度變化所引起的土壤理化性質(zhì)的相應(yīng)變化對土壤大腸桿菌數(shù)量的協(xié)同影響機(jī)理研究鮮有報(bào)道。為此，本研究探討了不同溫度下土壤中源自沼液的大腸桿菌數(shù)量變化的影響機(jī)理，以期為沼液農(nóng)田施用土壤衛(wèi)生控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)起始于2020 年11 月初，于2021 年1 月末結(jié)束，試驗(yàn)地點(diǎn)為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)所用沼液為山東省煙臺市牟平區(qū)某沼氣工程的豬糞沼液，試驗(yàn)所用土壤為棕壤。供試沼液和土壤的主要化學(xué)性質(zhì)如表1 所示。

表1 供試沼液和土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1 Characteristics of the experimental biogas slurry and soil

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用土柱培養(yǎng)法，所用培養(yǎng)容器為PVC 管，高度為25 cm、內(nèi)徑為7.5 cm。試驗(yàn)分別以培養(yǎng)溫度0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃、37 ℃設(shè)置4 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次。土壤經(jīng)風(fēng)干、研磨、過2 mm篩后裝入柱子，每柱裝土1000 g，隨后每柱加入沼液145 g，用無菌水調(diào)節(jié)土壤持水量為60%，柱子上下端用耐高溫封口膜封閉，于不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 樣品采樣與測定方法

于土壤培養(yǎng)后1 d、2 d、4 d、8 d、15 d、30 d、45 d、60 d，分別采集0～1 cm、4～5 cm、9～10 cm、14～15 cm、19～20 cm 處土壤用于樣品分析。土壤中大腸桿菌的測定采用平板計(jì)數(shù)法[13]；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量測定分別采用蒸餾后直接滴定法和紫外分光光度計(jì)法[14]；土壤全氮含量測定采用蒸餾后直接滴定法[15]；土壤有機(jī)質(zhì)含量測定采用重鉻酸鉀外加熱法[16]。土壤含氧量測定采用青島駿源環(huán)保設(shè)備有限公司提供的便攜式四合一有毒有害氣體檢測儀，儀器型號為20H17041。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016 和SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著差異法（LSD）處理顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)溫度對土壤中大腸桿菌數(shù)量的影響

沼液施用后不同溫度處理的土壤中大腸桿菌數(shù)量均呈現(xiàn)先升后降趨勢（圖1）。由圖1-A 可知當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，0～1 cm 處土壤中大腸桿菌的數(shù)量在第192 h 到達(dá)峰值，分別比0.6 ℃、16.1℃、25 ℃處理升高了7.34%、25.54%和120.25%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃時(shí)，0～1 cm 處土壤大腸桿菌數(shù)量到達(dá)峰值的時(shí)間分別比37 ℃處理延后了158 h、148 h 和8 h；當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，0～1 cm 土壤中菌群數(shù)量在第35 d 低于0.6 ℃、16.1 ℃、37 ℃處理，在第60 d 分別是0.6 ℃、16.1 ℃、37 ℃處理的79.76%、90.45%、93.39%。其他深度土壤溫度對大腸桿菌數(shù)量的影響與0～1 cm 處相似。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對土壤中大腸桿菌數(shù)量的影響Fig.1 The influence of different cultivation temperatures on the amount of Escherichia coli in soil

2.2 不同培養(yǎng)溫度對土壤有機(jī)質(zhì)含量的影響

由圖2 得知，不同溫度處理土壤有機(jī)質(zhì)含量均呈下降趨勢，有機(jī)質(zhì)含量與深度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。由圖2-A 所示，在培養(yǎng)溫度為37 ℃下培養(yǎng)60 d 時(shí)，0～1 cm 處土壤有機(jī)質(zhì)含量分別是0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃處理的86.87%、88.22%和89.41%。當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，0～1 cm、4～5 cm、9～10 cm、14～15 cm 處土壤銨態(tài)氮含量在第60 d 分別比19～20 cm 處土壤減少了3.85%、2.02%、1.83%和0.65%。0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃培養(yǎng)溫度對不同深度土壤有機(jī)質(zhì)具有相似影響。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對土壤有機(jī)質(zhì)含量的影響Fig.2 The influence of different cultivation temperatures on soil organic matter content

2.3 不同培養(yǎng)溫度對土壤硝態(tài)氮含量的影響

如表2 所示，所有溫度處理土壤硝態(tài)氮含量均成上升趨勢。在培養(yǎng)溫度0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃、37 ℃下培養(yǎng)60 d 時(shí)，0～1 cm、4～5 cm、9～10 cm、14～15 cm、19～20 cm 處土壤中硝態(tài)氮含量分別比培養(yǎng)1 d 時(shí)上升了15.59%、20.04%、23.84%、19.84%、16.50%、20.21%、25.23%、22.64%、16.41%、23.52%、28.91%、26.57%、23.12%、26.14%、35.73%、35.41%和16.87%、25.91%、30.60%、33.23%。與25 ℃相比，在培養(yǎng)溫度為0.6 ℃、16.1 ℃、37 ℃下，0～1 cm 處土壤硝態(tài)氮含量分別降低了14.59%、5.34%、5.06%。溫度對其他深度土壤硝態(tài)氮變化趨勢的影響與0～1 cm 處土壤相似，均以14～15 cm處土壤硝態(tài)氮含量最高。

表2 不同培養(yǎng)溫度對土壤硝態(tài)氮含量的影響Table 2 The influence of different cultivation temperatures on the soil nitrate nitrogen content

2.4 不同培養(yǎng)溫度對土壤銨態(tài)氮含量的影響

由表3 得知，不同溫度處理土壤中銨態(tài)氮含量均呈下降趨勢，銨態(tài)氮含量與深度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。在培養(yǎng)溫度為25 ℃下培養(yǎng)60 d 時(shí)，0～1 cm 處土壤銨態(tài)氮含量分別是0.6 ℃、16.1 ℃、37 ℃處理的75.86%、98.01%和102.31%。當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，0～1 cm、4～5 cm、9～10 cm、14～15 cm 處土壤銨態(tài)氮含量在第60 d 分別比19～20 cm 處土壤減少了10.70%、8.22%、5.62%和2.46%。0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃培養(yǎng)溫度對不同深度土壤銨態(tài)氮影響與培養(yǎng)溫度為37 ℃相似。

表3 不同培養(yǎng)溫度對土壤銨態(tài)氮含量的影響Table 3 The influence of different cultivation temperatures on soil ammonium nitrogen content

2.5 不同培養(yǎng)溫度對土壤C/N 的影響

土壤C/N 隨溫度升高呈下降趨勢，降低程度與溫度成顯著正相關(guān)（P＜0.05）。與培養(yǎng)溫度0.6 ℃處理相比，培養(yǎng)溫度為16.1 ℃、25 ℃、37 ℃時(shí)，0～1 cm 處土壤C/N 在第60 d 分別降低了1.28%、2.03%、20.79%。與37 ℃相比，0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃處理的0～1 cm 處土壤C/N 數(shù)值維持在9.5～10.5范圍的時(shí)間分別延長了69.23%、53.85%和23.08%。其他深度土壤C/N 變化趨勢與0～1 cm 處土壤相似（表4）。

表4 不同培養(yǎng)溫度對土壤C/N 的影響Table 4 The influence of different cultivation temperatures on soil C/N

2.6 不同培養(yǎng)溫度對土壤含氧量的影響

如圖3 所示，不同溫度處理土壤的含氧量均呈先升后降的趨勢。方差分析表明，第60 d 不同溫度處理土壤含氧量無顯著性差異（P＞0.05）。土壤中大腸桿菌數(shù)量到達(dá)峰值時(shí)土壤含氧量與溫度呈負(fù)相關(guān)，在培養(yǎng)溫度為37 ℃下培養(yǎng)8 d 和15 d 時(shí)，9～10 cm 處土壤含氧量分別是0.6 ℃、16.1 ℃和25 ℃處理的99.32%、99.66%、100%和98.98%、99.32%、99.66%，其他深度土壤含氧量對溫度的變化趨勢與9～10 cm 處土壤相似。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對土壤含氧量的影響Fig.3 The influence of different cultivation temperatures on soil oxygen content

3 討論

研究結(jié)果表明，與37 ℃處理相比，16.1 ℃、25 ℃培養(yǎng)溫度抑制大腸桿菌擴(kuò)繁，這是因?yàn)樵?7.5 ℃大腸桿菌體內(nèi)酶的活性最高，低于37.5 ℃大腸桿菌代謝受到抑制，溫度越低代謝活性越弱[17,18]。但0.6 ℃處理土壤中大腸桿菌數(shù)量在第60 d 高于其他溫度處理，說明低溫下大腸桿菌產(chǎn)生了大量保護(hù)酶等蛋白質(zhì)并降低了細(xì)胞膜對有害物質(zhì)的滲透性，不利于大腸桿菌的滅活[19]。

土壤中大腸桿菌峰值與土壤含氧量呈負(fù)相關(guān)，說明大腸桿菌在好氧環(huán)境下降低速率更快[20]。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于37 ℃時(shí)，隨溫度的升高土壤呼吸增強(qiáng)，導(dǎo)致土壤含氧量降低，削弱了溶解氧對大腸桿菌的抑制作用，更有利于大腸桿菌的擴(kuò)繁[21]。

土壤中氮素存在礦化作用、銨態(tài)氮揮發(fā)、硝化作用等氮素的轉(zhuǎn)化過程，沼液施用后土壤中銨態(tài)氮含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長呈下降趨勢，但硝態(tài)氮含量呈上升趨勢[22]。與其他溫度處理相比，培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)第60 d 土壤硝態(tài)氮含量最高且大腸桿菌數(shù)量最低，其中14～15 cm 處土壤對大腸桿菌數(shù)量的抑制作用最顯著。數(shù)據(jù)說明，25 ℃條件更有利于硝化作用，導(dǎo)致土壤中硝態(tài)氮含量的升高，進(jìn)而對大腸桿菌的生長產(chǎn)生抑制作用[23,24]。研究發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮的降低強(qiáng)度明顯高于硝態(tài)氮，這可能是因?yàn)闇囟鹊纳邔?dǎo)致了銨態(tài)氮的逸散，抑制了硝化作用[25]。所有溫度處理14～15 cm 處土壤硝態(tài)氮含量最高，對大腸桿菌數(shù)量抑制效果強(qiáng)于其他深度土壤，主要是因?yàn)?4～15 cm 處土壤的氨氮揮發(fā)量明顯低于上層土壤，利于氨氧化作用，為硝化作用提供更多的氮源[26,27]；14～15 cm 處土壤銨態(tài)氮含量無顯著性差異且土壤含氧量更高，由于氧含量降低能夠促進(jìn)反硝化作用[28]，因此14～15 cm 處土壤硝態(tài)氮含量明顯高于19～20 cm。

土壤C/N 為10:1 時(shí)最不利于大腸桿菌的生存[29]。沼液施用后所有溫度處理土壤C/N 均高于或低于10:1，對大腸桿菌生長產(chǎn)生抑制，造成數(shù)量上的降低。研究結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)溫度的降低和土層深度的增加，土壤C/N 下降幅度減少，C/N 維持在10 左右的時(shí)間越長。這是因?yàn)橥庠从袡C(jī)質(zhì)使微生物產(chǎn)生了更多胞外酶，當(dāng)培養(yǎng)溫度較高時(shí)這些胞外酶分解潛力得到表達(dá)，分解有機(jī)質(zhì)使土壤C/N降幅增大[30]。研究表明，0.6 ℃培養(yǎng)溫度下大腸桿菌數(shù)量最高，這可能是由于降低溫度削弱了C/N波動對硝態(tài)氮還原的抑制作用[31]，導(dǎo)致硝態(tài)氮還原量明顯高于其他溫度處理，不利于硝態(tài)氮對大腸桿菌產(chǎn)生毒害，同時(shí)溫度對大腸桿菌代謝的影響對大腸桿菌的抑制作用比土壤C/N 對菌群產(chǎn)生的直接影響更顯著。

4 結(jié)論

沼液施用后所有溫度處理土壤中大腸桿菌數(shù)量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。土壤溫度為0.6 ℃時(shí)不利于大腸桿菌滅活，土壤溫度為25 ℃時(shí)大腸桿菌滅活效果最好，土壤溫度為37 ℃時(shí)利于大腸桿菌的擴(kuò)繁。