郝中偉 劉祖秋 李紅敏 胡巖松 羅學(xué)勝

血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）是動(dòng)脈血管的主要組成部分，病理?xiàng)l件下VSMC會(huì)由“收縮型”向“合成型”轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為收縮相關(guān)蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌活躍，遷移、侵襲能力增強(qiáng)［1］。炎癥因子可誘導(dǎo)VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化［2］，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化、血管支架置入術(shù)后再狹窄等疾病的發(fā)生發(fā)展［3-4］。腫瘤壞死因子α（TNF-α）在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中顯著升高，硬化斑塊組織中也能檢測(cè)到TNF-α的高水平富集［5-7］?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化參與動(dòng)脈重塑［8］、泡沫細(xì)胞形成［9］、新生內(nèi)膜增生［10］等病理過程。本研究旨在探索TNF-α誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵信號(hào)分子，并通過細(xì)胞拯救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向該分子能否阻斷TNF-α對(duì)VSMC表型的影響。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)下載和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）下 載GSE115311轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)矩陣，從中提取來自TNF-α處理的VSMC（GSM3175352、GSM3175353）和 正 常VSMC（GSM3175354、GSM3175354）的RNA-seq結(jié)果。利用GSEA軟件（4.1.0版），選擇MSigDB庫中c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt基因集進(jìn)行富集分析。顯著富集標(biāo)準(zhǔn)為校正后的富集分?jǐn)?shù)（normalized enrichment score，NES）絕對(duì)值>1.0，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<25%，且P<0.01。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞購自Gibco公司，于添加平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑的231培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，37 ℃、5% CO2環(huán)境條件。取第3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞處理及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMC，經(jīng)2%胎牛血清預(yù)處理24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在12孔板中加入10 ng/mL 的TNF-α（abcam公司），分別處理0 h、12 h、24 h和48 h，用于檢測(cè)桿狀病毒IAP重復(fù)序列3（baculoviral IAP repeat-containing 3，BIRC3）的mRNA和蛋白表達(dá)。在6孔板中，采用lipofectamine 2000試劑盒，分別將BIRC3特異性干擾RNA（siBIRC3）和陰性對(duì)照干擾RNA（siNC）轉(zhuǎn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，再用TNF-α（10 ng/mL）處理兩組細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） Trizol法提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）步驟合成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa公司）步驟配制20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)所用的引物序列：BIRC3上游引物：5'-TTTCCGTGGCTCTTATTCAAACT-3'，下游引物：5'-GCACAGTGGTAGGAACTTCTCAT-3'；α-SMA上游引物：5'-GTGTTGCCCCTGAAGAGCAT-3'，下游引物：5'-GCTGGGACATTGAAAGTCTCA-3'；MYH11上游引物：5'-CGCCAAGAGACTCGTCTGG-3'，下游引物：5'-TCTTTCCCAACCGTGACCTTC-3'；GAPDH上 游 引物：5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，下游引物：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。

1.5 蛋白免疫印跡（western blot，WB）檢測(cè) 用SDS裂解液充分裂解細(xì)胞，4 ℃、10,000 r/min離心10 min，取上清，獲得總蛋白。BCA法測(cè)定上清液濃度，上樣緩沖液配平各個(gè)樣品致使每孔上樣30 μg蛋白。經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF上。WB封閉液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）室溫封閉1 h，4 ℃下孵育一抗過夜。TBST洗滌3次，室溫下孵育二抗1 h。TBST洗滌后，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）進(jìn)行顯影，成像后使用Image J軟件定量蛋白質(zhì)條帶。

1.6 平板劃線實(shí)驗(yàn) 使用200μL移液器槍頭在各組細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板板底中央做出劃痕，無菌PBS緩沖液洗滌去除細(xì)胞殘?jiān)?。分別在劃痕后0 h和24 h取樣拍照，以0 h的細(xì)胞劃痕寬度為基準(zhǔn)，計(jì)數(shù)24 h后遷移至劃痕內(nèi)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，作為遷移能力的定量指標(biāo)。

1.7 Transwell檢測(cè) 采用無血清培養(yǎng)液稀釋的Matrigel包被Transwell上室后，置于室溫下干燥凝固。重懸并調(diào)整各組細(xì)胞濃度致1×105個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液接種于Transwell上室中，下室中加入500 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后去除小室。吸去培養(yǎng)液后，用棉簽輕輕擦去小室上層細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌后，采用4%多聚甲醛固定，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下隨機(jī)選取3～5個(gè)視野拍照，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基因集富集分析 GSEA分析發(fā)現(xiàn)，NOD-like受體信號(hào)通路（P<0.001，NES=1.64，F(xiàn)DR=0.056）相關(guān)基因在TNF-α刺激的VSMC中明顯富集，見圖1A。其中，BIRC3基因的表達(dá)在TNF-α處理組中顯著上調(diào)（logFC=6.3，P<0.01），見圖1B。

2.2 TNF-α上調(diào)VSMC中BIRC3的表達(dá) 為明確TNF-α對(duì)BIRC3表達(dá)的影響，分別以10 ng/mL的TNF-α處理VSMC細(xì)胞0 h、12 h、24 h和48 h。定量PCR結(jié)果提示，TNF-α對(duì)BIRC3 mRNA的促表達(dá)作用呈時(shí)間梯度依賴性。TNF-α處理12 h后，BIRC3的mRNA水平已顯著高于對(duì)照組（2.90±0.12，P<0.01），24 h后的表達(dá)水平則進(jìn)一步上調(diào)（5.45±0.16，P<0.01），見圖2A。Western Blot結(jié)果提示，TNF-α能夠顯著上調(diào)BIRC3蛋白在VSMC中的表達(dá)，見圖2B。

圖2 TNF-α對(duì)VSMC中BIRC3表達(dá)的影響

2.3 干擾BIRC3表達(dá)逆轉(zhuǎn)TNF-α對(duì)VSMC收縮表型標(biāo)志物的抑制作用 TNF-α刺激VSMC的同時(shí)干擾敲低BIRC3。定量PCR結(jié)果提示，siBIRC3組中MYH11（2.43±0.18，P<0.01，見圖3A）和α-SMA（2.57±0.13，P<0.01，見圖3B）的mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組。Western Blot結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，siBIRC3組中MYH11和α-SMA蛋白表達(dá)明顯升高（見圖3C），提示敲低BIRC3表達(dá)能夠阻斷TNF-α對(duì)VSMC收縮表型標(biāo)志物的抑制作用。

圖3 干擾抑制BIRC3對(duì)TNF-α處理的VSMC中收縮表型標(biāo)志物的影響

2.4 干擾敲低BIRC3對(duì)TNF-α誘導(dǎo)VSMC遷移的影響 平板劃線實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與對(duì)照（siNC）組（68.50±7.53）比較，siBIRC3組細(xì)胞的遷移能力（51.0±4.56）顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

圖4 干擾抑制BIRC3對(duì)TNF-α處理的VSMC遷移的影響

2.5 干擾BIRC3表達(dá)減弱TNF-α對(duì)VSMC的促侵襲作用 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，TNF-α刺激VSMC的同時(shí)干擾敲低BIRC3能夠顯著減弱細(xì)胞的侵襲能力（25.83±4.27），與對(duì)照（siNC）組（44.83±4.15）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖5 干擾抑制BIRC3對(duì)TNF-α處理的VSMC侵襲能力的影響

3 討論

慢性炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的VSMC表型轉(zhuǎn)化是許多疾病共同的病理基礎(chǔ)之一［11］，心血管疾病的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，TNF-α作為引起血管炎癥反應(yīng)的重要因子，可通過多途徑參與調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)化［12］。本研究篩選驗(yàn)證，BIRC3基因的表達(dá)在TNF-α處理的VSMC中顯著上調(diào)，并通過拯救實(shí)驗(yàn)證明BIRC3是TNF-α誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)分子。BIRC3，又稱細(xì)胞內(nèi)抑制凋亡蛋白2（cIAP2），是細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族中的一員，其N末端含有3個(gè)相連的桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)域（BIR），C末端含有一個(gè)指環(huán)RING結(jié)構(gòu)域，具有E3泛素連接酶活性。ZHOU等［13］研究表明，TNF-α可促進(jìn)多種不同類型細(xì)胞中BIRC3的表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠顯著上調(diào)BIRC3在VSMC中的表達(dá)，提示該作用在不同種類細(xì)胞間具有一定的保守性。

從蛋白功能角度來看，當(dāng)TNF-α作用于細(xì)胞時(shí)，BIRC3的BIR結(jié)構(gòu)域與腫瘤壞死相關(guān)因子1、2（TRAF1，TRAF2）形成復(fù)合物，并被招募至腫瘤壞死因子受體附近，通過激活NF-κB經(jīng)典通路影響下游基因的表達(dá)，而BIRC3又是受NF-κB正向調(diào)控的基因之一［14］。由此可見，TNF-α/BIRC3/NF-κB在胞內(nèi)可形成正反饋環(huán)路，放大TNF-α對(duì)細(xì)胞的影響［15］。既往研究亦表明，TNF-α/NF-κB是介導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵通路［12］。據(jù)此推測(cè)，抑制BIRC3的表達(dá)或許能夠阻斷TNF-α對(duì)VSMC表型的影響。本研究在TNF-α處理VSMC的同時(shí)，利用干擾RNA敲低BIRC3的表達(dá)，結(jié)果顯示BIRC3表達(dá)下降能夠顯著阻斷TNF-α對(duì)α-SMA和MYH11等收縮表型標(biāo)志物的抑制作用，并且能夠有效抑制TNF-α對(duì)VSMC遷移的促遷移作用。大量研究表明，慢性炎性刺激可促使發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的合成型VSMC分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致其侵襲性遷移，這也是PCI術(shù)后再狹窄等許多心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)胞學(xué)機(jī)制［16］。本研究進(jìn)一步Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制VSMC中BIRC3的表達(dá)可以有效阻斷TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲。

綜上，TNF-α可上調(diào)VSMC中BIRC3的表達(dá)，抑制BIRC3能夠有效阻斷TNF-α誘導(dǎo)的VSMC表型轉(zhuǎn)化，為治療慢性血管炎癥反應(yīng)提供新的潛在靶點(diǎn)，但鑒于BIRC3功能的多樣性，其對(duì)VSMC表型調(diào)控的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。