鐘火清,閆盆吉,牟 斌,楊芳芳,惠愛平,王愛勤

(1.中國科學院蘭州化學物理研究所 甘肅省黏土礦物應用研究重點實驗室,蘭州730000；2.中國科學院大學 材料科學與光電子工程中心，北京 100049；3.中國科學院蘭州化學物理研究所 盱眙凹土應用技術研發(fā)中心，江蘇 盱眙 211700；4.河西學院 化學化工學院，甘肅 張掖 734000)

0 引 言

香芹酚(Carvacrol，CAR)是一種來源于百里香精油的酚類化合物，具有優(yōu)異的抗菌活性與抗氧化性能，對哺乳動物細胞沒有毒性，已經被美國食品藥品監(jiān)督管理局認定為安全的食品添加劑[1-4]。但由于揮發(fā)性強和水溶性差等缺點，大幅降低了生物利用率、抗菌活性和抗氧化性能，制約了在相關領域的廣泛應用。為了改善CAR的環(huán)境穩(wěn)定性，目前常用的方法包括納米乳[5]、蛋白納米顆粒[6]和環(huán)糊精包覆[7]等，但存在成本較高和制備工藝較繁瑣等不足。

凹凸棒石(attapulgite,APT)是一種含水富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物，集一維納米棒晶(棒晶長約0.5～5 μm，直徑約20～70 nm)、規(guī)整孔道(0.37 nm×0.64 nm)、結構負電荷和硅羥基于一體，可用于構筑各種納米功能復合材料[8-10]。Lei等[11]用APT負載姜精油，顯著改善了精油穩(wěn)定性。在前期研究中，我們采用機械力化學法以APT為載體制備了CAR/APT雜化抗菌材料[12]。研究表明，部分CAR分子進入APT孔道，形成了穩(wěn)定的雜化體系，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度達到2.0 mg/mL，但與現有抗菌材料相比，抗菌活性還有待提升。

眾所周知，不同精油分子具有不同的結構和理化性能，對細菌的作用方式也不盡相同。研究表明，基于不同精油分子之間的協同效應，通過不同精油分子的組合，可以明顯增強精油分子的抗菌效果[13-16]。例如，傘花烴單獨使用時沒有表現出明顯的抗菌活性，但與CAR協同后顯著提升了抗菌活性[4,17]。為此，在系統(tǒng)開展CAR/APT雜化材料研究工作基礎上[12]，本研究利用不同精油活性成分的協同抗菌效應，通過機械力化學法構筑了6種雙組分植物精油/APT雜化抗菌材料(圖1)，涉及的不同植物精油包括百里香酚(THY)[5]、香芹酮(CAV)[18]、薄荷醇(MEN)[19]、傘花烴(CYM)[17]、檸檬烯(LIM)[4]和萜品烯(TER)[4]。系統(tǒng)研究了雜化材料的結構、熱穩(wěn)定性及其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性，為發(fā)展新型抗菌材料奠定了應用基礎。

圖1 (a)CAR、THY、CAV、MEN、CYM、LIM和TER植物精油分子的結構圖和(b)APT、CAR/APT及雙組分植物精油/APT雜化材料的數碼照片Fig 1 Molecular structure of CAR,THY,CAV,MEN,CYM,LIM and TER,and digital photograph of APT,CAR/APT and bi-component EOs/APT hybrid materials

1 實驗部分

1.1 材 料

APT來自江蘇玖川納米材料有限公司，XRF測定化學組成為CaO (1.24%)、Al2O3(8.03%)、Na2O (1.51%)、MgO (12.65%)、SiO2(59.18%)、K2O (0.95%)和Fe2O3(5.07%)。CAR (99%)和THY(99%)購買自上海麥克林生化科技有限公司，MEN (98%)、CAV (98%)、CYM (97%)和LIM (97%)購買自阿法埃莎(中國)化學有限公司，TER (98%)購買自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。金黃色葡萄球菌(S.aureus,ATCC25912)和大腸桿菌(E.coli,ATCC25922)由蘭州大學第二醫(yī)院提供，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)購買自青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 雙組分植物精油/APT雜化抗菌材料的制備

分別將6種不同精油活性成分與CAR混合得到混合精油，在前期抗菌性能測試篩選下，CAR與不同植物精油的質量比為4∶1。分別將1.5 g混合精油與5.0 g APT拌合均勻，密封后置于黑暗處放置24 h，然后采用研磨儀(CRINOER,MG100)在60 rpm轉速下研磨30 min。根據混合精油的活性成分的名稱，將制得樣品分別標記為THY/CAR/APT、CAV/CAR/APT、MEN/CAR/APT、CYM/CAR/APT、LIM/CAR/APT和TER/CAR/APT。

1.3 表 征

傅立葉紅外光譜儀(FTIR)：Thermo Nicolet NEXUS TM spectrophotometer 6700型(美國)，樣品經光譜純 KBr 壓片后在掃描波長400～4 000 cm-1范圍內測試；熱重分析儀(TG)：STA449 C TG-DSC型(德國)，測試溫度為35～750 ℃，氮氣氣氛，升溫速率為10 ℃/min。

1.4 抗菌試驗

參照美國臨床和實驗室標準協會指導的瓊脂稀釋法[12]，通過測定材料對S.aureus和E.coli的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)來評價雜化材料的抗菌性能。具體相關操作如下所述，取-80 ℃保存的標準菌種，接種至L-B肉湯中進行復活，當細菌傳代進入對數期時，制備標準菌株菌懸液，調整菌懸液至0.5 McFarland標準濁度，稀釋至107CFU/mL后備用；將20 mL高壓滅菌后的NA與紫外線滅菌后的樣品混合均勻，倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，冷卻后即得含有抗菌樣品的瓊脂平板。用移液槍取1 μL稀釋后的菌懸液，點種于瓊脂平板上3個不同的位置，干燥后將瓊脂平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況，能完全抑制細菌菌落生長的最低樣品濃度即為MIC。同時設置不加樣品的瓊脂平板為陽性對照。每個樣本每個濃度下重復兩次操作。

1.5 計 算

基于密度泛函理論(Density Functional Theory,DFT)通過Gaussian 09[20]計算軟件在B3LYP-(D3BJ)/6-31G(d)水平下優(yōu)化得到APT計算模型、吸附物以及吸附復合物的幾何結構，為了得到更為精確的吉布斯自由能熱力學數據，對穩(wěn)定結構在M062X(D3)/def2-TZVP水平下進行單點計算[21]，計算吉布斯自由能GBS2 =GBS1-EBS1+EBS2 (其中G是吉布斯自由能，E是電子能,BS1指B3LYP-(D3BJ)/6-31G(d)水平，BS2指M06-2X(D3)/def2-TZVP計算水平)。基于分子中的原子量子理論(quantum theory of atom in molecular ,QTAIM)，利用Mu1tiwfn3.7[22]波函數分析軟件及其獨立梯度模型(Independent Gradient Model,IGM)考察復合物中氫鍵相互作用。所有的可視化圖形都是利用GaussianView 6.0[23]和VMD1.0[24]可視化繪圖軟件。

2 結果與分析

2.1 雜化材料紅外光譜分析

圖2為APT、CAR/APT和雙組分植物精油/APT雜化材料的FTIR譜圖。在APT的紅外光譜圖中，3 548 cm-1處的吸收峰屬于孔道內八面體邊緣鎂離子配位水的伸縮振動，3 421和1 654 cm-1處的吸收峰分別屬于沸石水和表面吸附水伸縮振動和反對稱伸縮振動[25]。在CAR/APT雜化材料的紅外光譜圖中，2 962 cm-1處的吸收峰來源于精油分子中-CH2的反對稱伸縮振動，1 459和1 423 cm-1處的吸收峰來源于其分子結構中苯環(huán)C=C的伸縮振動[12]。這些特征吸收峰的出現，表明CAR成功負載到APT上。比較CAR/APT和雙組分植物精油/APT雜化材料的紅外譜圖，沒有明顯區(qū)別，這主要歸因于植物精油分子較為相似的分子結構。

圖2 APT、CAR/APT和雙組分植物精油/APT雜化材料的紅外光譜Fig 2 FTIR of APT,CAR/APT and bi-component EOs/APT hybrid materials

加入精油分子不會影響凹凸棒石的結構[26]，但機械力研磨可使精油分子與APT孔道沸石水和八面體邊緣的配位水發(fā)生相互作用[12]，從而引起APT位于3 548、3 421和1 654 cm-1處特征吸收峰發(fā)生偏移。因此，對比分析了負載植物精油前后這3個吸收峰位置的變化。如表1所示，對于CAR/APT，僅僅在3 548和3 421 cm-1處有2個波數的偏移，但形成雙組分植物精油/APT雜化材料后波數偏移相對較為明顯。在1 654 cm-1處的吸收峰均發(fā)生了紅移，并且除CAV/CAR/APT位移較小外，其它5個雜化材料的波數位移都大于6；對于3 421 cm-1處的吸收峰，除TER/CAR/APT發(fā)生4個波數的藍移外，其余均發(fā)生紅移現象，且CAV/CAR/APT、MEN/CAR/APT和LIM/CAR/APT的紅移現象都較為明顯。相比之下，位于3 548 cm-1處的吸收峰偏移較小，CYM/CAR/APT幾乎沒有發(fā)生位移，TER/CAR/APT發(fā)生4個波數紅移，其余都呈現藍移現象。這表明雙組分精油體系與APT的相互作用強于CAR與APT之間的作用。

表1 雙組分植物精油/APT雜化材料在3 548、3 421和1 654 cm-1處的位移情況Table 1 Absorption peak shift of EOs/APT hybrid materials at 3 548/cm,3 421/cm and 1 654/cm

2.2 雜化材料熱性能分析

圖3給出了雙組分植物精油/APT雜化材料的TGA及DTG曲線。APT在200 ℃以下出現了兩個吸熱峰，分別在75和180 ℃附近[12]，其中75 ℃附近的失重峰歸因于表面吸附水的脫除，180 ℃附近的吸熱峰歸因于孔道內沸石水的脫除[27-28]。前期研究結果表明，CAR/APT在200 ℃以下只在135 ℃出現了一個吸熱峰[12]，主要是雜化材料制備過程中研磨置換了APT的吸附水和沸石水。表2列出了雙組分精油與APT形成雜化材料后的吸熱峰溫度和失重率。由表中數據可見，混合MEN、THY、CAV和CYM后，相應雜化材料的吸熱峰溫度分別升高至141、140、138和138 ℃；但混合LIM和TER后，相應雜化材料的吸熱峰溫度分別降為125和133 ℃。同時，引入LIM和TER制得雜化材料的失重率也較低，說明加入THY、CAV、MEN和CYM可以協同提高雜化材料的穩(wěn)定性。

圖3 (a)THY/CAR/APT,(b)CAV/CAR/APT,(c)MEN/CAR/APT,(d)CYM/CAR/APT,(e)LIM/CAR/APT和(f)TER/CAR/APT雜化材料的TGA和DTG曲線Fig 3 TGA and DTG cures of bi-component EOs/APT hybrid materials:(a)THY/CAR/APT;(b)CAV/CAR/APT;(c)MEN/CAR/APT;(d)CYM/CAR/APT;(e)LIM/CAR/APT and (f)TER/CAR/APT

表2 CAR/APT和雙組分植物精油/APT雜化材料的吸熱峰溫度及失重率Table 2 Endothermic peak and mass loss of CAR/APT and bi-component EOs/APT hybrid materials

2.3 雜化材料穩(wěn)定機理

雜化材料的穩(wěn)定性與植物精油分子的結構有明顯相關性。由圖1a各種植物精油分子的結構圖可見，THY、CAV、MEN和CYM分子中有含氧官能團或者苯環(huán)，而LIM和TER分子中既沒有含氧官能團也沒有苯環(huán)。研究結果表明，CAR、THY、CAV和MEN分子中的含氧官能團可與APT表面的Si-OH及孔道邊的Mg-OH2基團形成較強的氫鍵，且不同的分子結構與兩個基團形成氫鍵的強度不同[26]，所以植物精油分子結構中含有氧官能團及苯環(huán)可提升雜化材料穩(wěn)定性。此外，植物精油分子也可能與CAR分子產生相互作用，如氫鍵和π-π作用，從而有助于提高雜化材料的穩(wěn)定性。因此，加入THY、CAV、MEN和CYM后穩(wěn)定性提高的原因可歸因于不同精油分子之間的相互作用，或者是與APT作用位點的差異。

為了進一步明晰加入THY、CAV、MEN和CYM分子后雜化材料穩(wěn)定性提高的原因，計算模擬了這幾種分子與CAR分子相互作用情況。計算以CAR/APT復合物為底物，由圖4可見，CAR 與其它植物精油分子之間存在氫鍵等弱相互作用力。CAR 與CAV、THY 和MEN之間主要存在O-H…O之間的氫鍵，這從IGM圖上可以清晰的表現出來，分子之間綠色片狀區(qū)域中的藍色部分表示氫鍵作用力，說明CAV/CAR、MEN/CAR 和THY/CAR 之間的弱相互作用力以氫鍵為主。通過吉布斯自由能數據可知(圖5)，該過程分別需要吸熱2.25、2.38和1.83 kcal/mol，但與TER、LIM和 CYM分子之間，雖然也有氫鍵作用力存在，但主要以范德華力為主，在熱力學上表現為吸熱更多，需要吸熱3.83、3.66和4.29 kcal/mol。對比前期對這些精油分子與APT相互作用的數據[26]，發(fā)現APT與精油分子之間的作用力遠強于CAR與其它分子間的作用力，所以加入THY、CAV、MEN和CYM后雜化材料穩(wěn)定性提高的原因主要是精油分子與APT不同位點之間作用強度差異引起的。

圖4 精油分子復合結構及IGM分析分子間氫鍵相互作用力,其中δginter =0.05 a.u.Fig 4 Structure of bi-component EOs molecules and intermolecular hydrogen bond (δginter =0.05 a.u.)

圖5 混合精油分子的吉布斯自由能Fig 5 Gibbs free energy of mixed EOs molecules

2.4 抗菌性能

CAR和THY都是具有良好抗菌效果的精油分子，研究結果表明，CAR/APT和THY/APT對E.coli和S.aureus的MIC都為2.0 mg/mL[12,26]，而其它精油分子單獨使用時抗菌效果較差[4]。根據文獻報道，不同精油分子之間的協同作用可以提升單一精油分子的抗菌活性[13-16]。圖6給出了雙組分植物精油/APT雜化材料對E.coli和S.aureus的MIC值。從表中MIC值可見，與CAR/APT的MIC值相比，除MEN/CAR/APT外，其它雜化材料對E.coli的MIC都降低到了1.0 mg/mL；除LIM/CAR/APT外，其它雜化材料對S.aureus的MIC值都降低到了0.5 mg/mL。由此可知，其它精油成分的引入都明顯增強了CAR/APT的抗菌性能，表明這幾種精油分子能與CAR產生協同作用。對于協同作用機理，除了不同精油分子與細菌之間作用方式外，不同精油分子與APT的作用位點是一個重要因素。

圖6 雙組分植物精油/APT雜化材料對E. coli和S. aureus的MIC：(a)THY/CAR/APT,(b)CAV/CAR/APT,(c)MEN/CAR/APT,(d)CYM/CAR/APT,(e)LIM/CAR/APT 和(f)TER/CAR/APTFig 6 MIC values of bi-component EOs/APT hybrid materials against E. coli and S. aureus:(a)THY/CAR/APT;(b)CAV/CAR/APT;(c)MEN/CAR/APT;(d)CYM/CAR/APT;(e)LIM/CAR/APT and (f)TER/CAR/APT

3 結 論

(1)在APT上同時引入CAR和THY、CAV、MEN、CYM精油分子可以改善雜化材料的熱穩(wěn)定性。對于有含氧官能團的THY、CAV和MEN，提高雜化材料熱穩(wěn)定性的原因是本身與APT能形成較強的氫鍵，而CYM與CAR分子之間存在π-π相互作用。

(2)引入不同植物精油分子也有助于提高雜化材料的抗菌活性，除MEN和LIM外，其它雙組分植物精油雜化材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為1.0 mg/mL和0.5 mg/mL。抗菌活性的提升與精油分子間的協同效應密切相關。