閆玉辰，查云飛

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種全身慢性代謝性疾病，在體內(nèi)高糖刺激下，骨髓微環(huán)境改變，促使骨髓間葉組織向脂肪組織轉(zhuǎn)化，抑制成骨細胞形成，導(dǎo)致骨髓內(nèi)脂肪堆積[1]。骨髓脂肪細胞是骨髓造血微環(huán)境和能量代謝的調(diào)節(jié)器，糖尿病脂肪堆積和脂質(zhì)代謝紊亂會導(dǎo)致骨髓脂肪生成增加及骨髓細胞組成的改變[2]，骨髓微環(huán)境平衡失調(diào)，與骨質(zhì)疏松癥和脆性骨折的風(fēng)險等改變密切相關(guān)[3]，是臨床上糖尿病患者致死、致殘的主要原因[4]。

維生素D是一種脂溶性物質(zhì)，對于脂肪的分化有著調(diào)節(jié)作用[5]；其儲存和代謝的主要場所位于脂肪組織，糖尿病肥胖患者會使得血清1-25 (OH)D3不足[6]。維生素D對于調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境，可改善骨髓脂肪堆積及促進骨強度[7]；有研究表明維生素D 的補充可以限制糖尿病患者皮下脂肪的再增加，但對于已生成的脂肪組織尚無改善作用，并且能促進胰島素釋放、改善胰島素的抵抗[8]；同時，維生素D刺激皮下脂肪細胞活化，加快體內(nèi)葡萄糖的攝取，改善循環(huán)血糖濃度，對于維持體內(nèi)鈣、磷平衡及骨微環(huán)境代謝穩(wěn)態(tài)有調(diào)節(jié)作用[5，9]。

定量非對稱回波的最小二乘估算法迭代水脂分離序列(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation quantitation sequence，IDEAL-IQ)結(jié)合了快速三維多回波梯度回波成像序列和增強的圖像重建技術(shù)改善了局部脂肪的檢出，通過數(shù)據(jù)模型重建、整合水和脂肪多回波的復(fù)數(shù)數(shù)據(jù)來估算器官內(nèi)脂肪含量(fat fraction，F(xiàn)F)[10-11]。IDEAL-IQ 序列掃描具有簡單、快速、重復(fù)性好等特點，其中在后處理工作站上可直接計算出腰椎感興趣區(qū)骨髓脂肪含量百分比，為在活體糖尿病骨髓脂肪含量改變的定量研究中表現(xiàn)出了巨大臨床價值[12-13]。同樣使用IDEAL-IQ 技術(shù)，胡磊等[14]前期研究結(jié)果顯示糖尿病兔腰椎體骨髓內(nèi)脂肪含量較正常組明顯增多。目前尚未見維生素D 干預(yù)糖尿病骨髓脂肪含量的影像學(xué)研究報道，本研究旨在探討IDEAL-IQ 技術(shù)下評價維生素D對于糖尿病骨髓脂肪含量改變的價值。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備

本實驗研究從2019 年8 月開始，2020 年12 月結(jié)束，武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會審查通過所有實驗(第20190421號)。30只28～32周齡健康日本雄性大耳白兔，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供單籠飼養(yǎng)，室溫25 ℃，30 只兔適應(yīng)期間自由攝食、進水，于一周后測得血糖均在正常范圍[(5.5±0.5) mmol/L]。

30 只日本雄性大耳白兔按隨機分為兩組，其中實驗組20 只；造模前，將四氧嘧啶(Sigma 公司)配制成5%溶液，30 只兔均禁食8～12 h，不禁水；造模時，由耳緣靜脈按照100 mg/kg 快速注射入實驗組兔體內(nèi)，對照組10 只給予注射同等量生理鹽水。造模后每小時用血糖儀(三諾安信血糖儀)測量耳緣末梢血糖，自由進食；對于血糖＜2.0 mmol/L 或出現(xiàn)嚴(yán)重低血糖表現(xiàn)的大白兔，如抽搐、尖叫、精神不振、不進食等表現(xiàn)，通過給予注射葡萄糖緩解。四氧嘧啶注射48 h 后重新測量實驗兔末梢血糖濃度，其中測得血糖值大于14 mmol/L 或不同時間點血糖值大于11 mmol/L，可認(rèn)定造模成功[15]；若測得血糖處在正常范圍內(nèi)，則補加50 mg/kg四氧嘧啶，直至血糖水平達標(biāo)；對于血糖水平超過30 mmol/L的嚴(yán)重高血糖水平，通過皮下注射長效胰島素，將其控制在30 mmol/L以下。

四氧嘧啶造模成功一周后，隨機將20 只實驗兔再分為兩組；其中，干預(yù)組10 只每周口服維生素D (400 μg)，連續(xù)給藥4 周；對照組和單純糖尿病組每周用生理鹽水10 mL灌胃。

1.2 MRI設(shè)備及成像方法

所有兔在第0、4、8、12、16周的時間點，分別從耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉溶液(3%，2 mL/kg)麻醉，在3.0 T Discovery MR750 Plus 磁共振設(shè)備(GE Healthcare)上，固定于8 通道膝關(guān)節(jié)專用相控陣線圈，擺放體位呈仰臥位、足先進；使用常規(guī)腰椎矢狀位FSE-T2WI、FSE-T1WI及腰椎IDEAL-IQ掃描。

矢狀位T1WI 掃描參數(shù)：TR 300 ms，TE Min Full，掃描層厚3 mm，視野16 cm×16 cm，矩陣320×288，激勵次數(shù)為2，掃描時間2 min 6 s。矢狀位T2WI 掃描參數(shù)：TR 2500 ms，TE 120.0 ms，掃描層厚3 mm，視野16 cm×16 cm，矩陣320×320，激勵次數(shù)為4，掃描時間2 min 45 s。矢狀位IDEAL-IQ 掃描參數(shù)：翻轉(zhuǎn)角6°，TR 17.2 ms，TE 1.2、3.2、5.2、7.2、9.2、11.2 ms。帶寬31.25 kHz，掃描層厚3 mm，視野18 cm×0.8 cm，矩陣192×160，激勵次數(shù)為3，掃描時間5 min 37 s。

1.3 兔腰椎IDEAL-IQ骨髓脂肪含量百分比測定

在AW4.6 后處理工作站上(GE Healthcare)，將對照組、單純糖尿病組及維生素D 干預(yù)組所有兔的IDEAL-IQ 掃描圖像導(dǎo)入，選取3 組各個時間點Fat Fraction 圖像中兔腰椎第5～7 椎體中心層面，由同一觀察者勾畫感興趣，每1 個椎體的ROI 要避開椎體終板軟骨、邊緣骨皮質(zhì)的干擾，重復(fù)3 次，取平均值。見圖1。

圖1 A～C 分別為矢狀位T1WI、T2WI、FF 圖。紅色區(qū)域為勾畫的腰7 椎體(白色箭頭)興趣區(qū)Fig.1 A—C showed the T1WI,T2WI,FF,respectively.The red area was the ROIarea of fat fraction of the 7th lumbar vertebra(white arrow).

1.4 兔腰椎骨髓組織病理學(xué)檢查

完成檢查后，在第16 周采取空氣栓塞法處死所有實驗兔，取腰5、6、7椎體作為病理標(biāo)本，10%多聚甲醛固定組織，脫鈣兩周后用石蠟包埋，垂直于椎體蠟塊短軸位作4 μm 切片，行HE 染色。隨機選取3 個相互不連續(xù)的區(qū)域，由同一觀察者分別于顯微鏡高倍鏡(×400)視野下統(tǒng)計脂肪細胞數(shù)目，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 23.0，對第0、4、8、12 及16 周各時間點IDEAL-IQ 測量所得的3 組間腰椎體骨髓脂肪含量，其中空白對照組、單純糖尿病組、維生素D 干預(yù)組各采用兩兩重復(fù)測量的方差分析統(tǒng)計。第16 周IDEAL-IQ 測量腰椎體脂肪含量FF 與HE 染色切片鏡下脂肪細胞計數(shù)采用Pearson 相關(guān)分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

因麻醉意外在實驗期間實驗組共死亡7 只，其中單純糖尿病組剩余6 只，維生素D 干預(yù)組剩余7 只，對照組死亡1 只，空氣栓塞處死2只，剩余7只。

IDEAL-IQ 測量單純糖尿病組及維生素D 干預(yù)組各組組內(nèi)在造模后第16 周椎體骨髓脂肪含量FF 值較第0 周明顯增高，且兩時間點測得FF 值具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.971，P＜0.05；F=3.055，P＜0.01)，兩 組其他時間點測得FF 值不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；對照組椎體各時間點骨髓脂肪含量百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(圖2)。

圖2 空白對照組、單純糖尿病組、維生素D 干預(yù)組各時間點IDEAL-IQ椎體脂肪比的趨勢圖Fig.2 Trend chart of the proportion of vertebral bone marrow fat measured by IDEA-IQ at each time point between the simple diabetes group,vitamin D intervention group and control group.

單純糖尿病組及維生素D 干預(yù)組兩組第16 周椎體IDEAL-IQ 測量脂肪含量百分比與第16 周對照組比較，腰椎骨髓FF%差異分別存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。但是，同一時間點糖尿病組與維生素D 干預(yù)組組間在第16 周的FF 值差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.390，P=0.06)(表1)。

表1 單純糖尿病組、維生素D干預(yù)組、對照組各時間點IDEAL-IQ椎體脂肪比的比較(%)Tab.1 Comparison of IDEAL-IQ values at each time point between the simple diabetes group,vitamin D intervention group and control group(%)

第16周，腰椎骨髓HE染色顯示單純糖尿病組與維生素D干預(yù)組中骨髓脂肪細胞較空白對照組相比明顯增多、增大(圖3)；空白對照組、單純糖尿病組與維生素D干預(yù)組骨髓脂肪細胞數(shù)目平均值分別為12.80±5.26/mm2、21.30±6.80/mm2、19.20±5.81/mm2，單 純糖尿病組與維生素D 干預(yù)組骨髓脂肪細胞數(shù)值高于空白 對照 組(t=-19.549，P＜0.05；t=-15.681，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但維生素D 干預(yù)前后，兩實驗組骨髓脂肪細胞數(shù)值差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.481，P=0.412)。

圖3 A～C 分別為第16 周空白對照組、單純糖尿病組、維生素D 干預(yù)組兔腰椎骨髓HE 染色(×400)。黑色箭頭所指為脂肪細胞Fig.3 A—C showed HE staining of lumbar bone marrow of rabbits in the control group,the simple diabetes group and the vitamin D intervention group at week 16 (×400).The black arrows indicate adipocyte.

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兔糖尿病模型成功后第16周，實驗兔腰椎骨髓脂肪含量(FF)值與HE染色后的脂肪數(shù)目呈正相關(guān)(r=0.828，P＜0.05)(圖4)。

圖4 四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型后第16 周，實驗兔腰椎骨髓FF 值與脂肪數(shù)目呈正相關(guān)Fig.4 FF values of lumbar bone marrow was positively correlated with the number of adipocyte at the 16th week in alloxan-induced diabetic rabbits.

3 討論

本實驗探討基于IDEAL-IQ 技術(shù)評估維生素D 干預(yù)前后糖尿病骨髓脂肪含量變化，研究結(jié)果表明，在第16 周單純糖尿病組和維生素D 干預(yù)組骨髓脂肪含量較對照組脂肪含量增高，其中單純糖尿病組增高較為明顯；第16 周維生素D 干預(yù)組組較第16 周單純糖尿病的脂肪含量差異無相關(guān)性，但維生素D干預(yù)下骨髓脂肪分?jǐn)?shù)值整體呈下降趨勢。

多種MRI 定量技術(shù)在評價骨髓脂肪含量方面具有獨特優(yōu)勢，磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy，MRS)檢測是一種通過充分利用化合物間的差別而無創(chuàng)性的光譜觀察檢測生物體活體組織中的各種組織新陳代謝、生化變化和對其化合物進行定量檢測的科學(xué)技術(shù)[16]。Li 等[17]研究結(jié)果表明3.0 T MRS 對于低骨密度個體的椎體骨髓脂肪含量的測定具有可行性；但是，1H-MRS 技術(shù)難點是骨髓磁場譜圖曲線的線寬易直接受到松質(zhì)骨髓的小梁和骨髓磁場不均勻的因素影響，且掃描時間長，要求較高、后處理較為復(fù)雜而受到限制。水和脂肪的回波不對稱迭代分解和最小二乘估計量化序列(IDEAL-IQ)作為一種新的MR 圖像脂肪含量百分比的量化方法，該方法已被用于估計多個器官的脂肪含量[10]。相對于1H-MRS，IDEAL-IQ 技術(shù)具有用時短、可重復(fù)性高等優(yōu)勢，從工作站中可以對所生成的FF 圖上直接計算出各組織器官感興趣區(qū)內(nèi)的脂肪含量百分比。Ergen 等[18]首次采用IDEAL-IQ 技術(shù)展示了定量測量女性椎體脂肪含量的可行性；Hu 等[19]前期實驗首次利用IDEAL-IQ 技術(shù)，揭示四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病兔椎體終板下骨髓腔脂肪含量隨著時間累積的變化，證實了IDEAL-IQ 在實驗動物糖尿病模型上定量評估椎體骨髓脂肪含量是可行的。

目前很多研究都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人體血清中的維生素D 循環(huán)水平濃度(以人體血清中的維生素D3 水平為主要指標(biāo))可能會與2 型糖尿病患者風(fēng)險增加相關(guān)[20]，同樣糖尿病疾病也會導(dǎo)致鈣、磷及維生素D 水平的減低。維生素D 通過刺激脂肪細胞對葡萄糖的攝取可改善鈣磷平衡及骨代謝[5]。Shab-Bidar等[8]研究表明血清維生素D 水平可與內(nèi)臟脂肪含量呈負相關(guān)，但對于已經(jīng)生成的脂肪組織尚無明顯改善作用。長期給肥胖小鼠補充維生素D，可誘導(dǎo)炎癥趨化因子mRNA 表達水平降低，有助于肥胖小鼠體內(nèi)減輕脂肪組織炎癥及改善肝臟脂肪變性趨勢[21]；對于糖尿病患者的皮下脂肪的累積，補充維生素D可以有效限制皮下脂肪的再增加[8]。本實驗利用IDEAL-IQ技術(shù)快速、動態(tài)監(jiān)測等特點，定量測定維生素D干預(yù)前后糖尿病兔腰椎骨髓脂肪含量值變化，為揭示維生素D影響早期糖尿病骨病中骨髓微環(huán)境中脂肪代謝的病理生理機制及未來為臨床評估相關(guān)抑脂藥物療效結(jié)果提供了較為可靠的影像學(xué)證據(jù)。

本實驗結(jié)果顯示，維生素D干預(yù)四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型16 周后，兔腰椎骨髓脂肪含量分?jǐn)?shù)值較單純糖尿病組骨髓脂肪分?jǐn)?shù)呈下降趨勢，但兩組間腰椎脂肪FF 值無明顯改變，兩者差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。維生素D 作用具有兩重性，合理劑量的1，25-二羥維生素D3 [1，25-(OH)2D3]濃度利于髓內(nèi)干細胞向成骨細胞分化、成熟，抑制脂肪細胞的累積，改善骨髓微環(huán)境平衡[22]；超過生理劑量的1，25-二羥維生素D3 濃度會改變骨髓微環(huán)境穩(wěn)定，抑制成骨細胞分化，提高破骨細胞的活性，從而改變骨髓內(nèi)脂肪含量。本實驗維生素D 按照實驗動物和人類之間的劑量轉(zhuǎn)換的簡單實踐指南[23]，轉(zhuǎn)化為兔模型生理劑量范圍，推測在糖尿病16 周病程中，給藥4 周時間中腰椎骨髓脂肪成分發(fā)生的改變，可能因為干預(yù)時間過短，或者是給藥濃度較低，使得體內(nèi)維生素D濃度未達到閾值或藥物持續(xù)時間較短未能達到讓IDEAL-IQ技術(shù)測得的宏觀脂肪組織改變的表現(xiàn)，這可能是導(dǎo)致維生素D 干預(yù)糖尿病骨髓脂肪含量下降趨勢不明顯的重要原因之一。未來的研究應(yīng)更多地從維生素D 干預(yù)時間及干預(yù)劑量上評價IDEAL-IQ測量兔糖尿病模型中骨髓脂肪含量分?jǐn)?shù)值的變化。

本實驗的局限性：(1)本實驗研究的樣本量較少，維生素D 對于糖尿病骨髓脂肪含量改變的變化機制仍需要大樣本予以證實；(2)干預(yù)組給予維生素D 的劑量及給藥時間較短，對于長期、大劑量維生素D 干預(yù)糖尿病骨髓脂肪改變是否存在相同效果仍需要后續(xù)研究進一步觀察；(3)糖尿病動物模型的發(fā)生發(fā)展和臨床患者糖尿病慢性自然病程存在差異。

綜上所述，IDEAL-IQ技術(shù)評價維生素D干預(yù)四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型骨髓脂肪含量變化是可行的，維生素D 干預(yù)16 周內(nèi)，骨髓脂肪含量改變呈現(xiàn)下降趨勢。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。