劉宇卉，陳安良，武敬君，劉鐵利，董婉，劉昀松，趙瑩，劉愛(ài)連*

直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與腸上皮細(xì)胞的凋亡、增殖速度密切相關(guān)，多種基因、信號(hào)蛋白P53等參與了這個(gè)過(guò)程[1-2]。直腸癌腫瘤新生血管的血管壁成熟性差、動(dòng)靜脈血管間相交通、基底膜完整且血管通透性高等特點(diǎn)，可造成直腸癌微循環(huán)不均衡現(xiàn)象的出現(xiàn)，而動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI)評(píng)價(jià)直腸癌微循環(huán)的病理基礎(chǔ)與此存在關(guān)聯(lián)，間接反映組織生物學(xué)行為[3-4]。P53是一種極其重要的抑制腫瘤的基因，其主要有兩種不同的亞型，即突變型和野生型，這種基因能夠影響細(xì)胞增生的過(guò)程[5]。研究表明，腫瘤生長(zhǎng)中癌細(xì)胞大量增殖，導(dǎo)致高表達(dá)的P53 蛋白和細(xì)胞周期蛋白結(jié)合之間的結(jié)合喪失，進(jìn)而引起與直腸癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程有著密切的分子生物學(xué)聯(lián)系[6-7]。目前P53 與直腸癌組織的相關(guān)研究結(jié)果并不明確，還需要更多更大規(guī)模的前瞻性研究。本研究通過(guò)應(yīng)用從DCE-MRI 紋理分析方法得出的DCE-MRI 紋理特征值與直腸癌中P53 生物標(biāo)志物的可能關(guān)聯(lián)，在術(shù)前預(yù)測(cè)直腸癌P53的表達(dá)狀態(tài)，從而為直腸癌的治療以及術(shù)后評(píng)估等提供更多的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2015 年9 月至2020 年3 月于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行盆腔DCE-MRI掃描的原發(fā)性直腸腺癌患者91例。其中，P53高表達(dá)組50例[男37例，女13 例，年齡(66.32±8.98)歲]，低表達(dá)組41 例[男30例，女11例，年齡(64.02±11.14)歲]。本研究經(jīng)過(guò)大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：PJ-KS-KY-2019-49)，免除受試者知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為直腸腺癌，并且同時(shí)做了免疫組化檢測(cè)、有分子生物學(xué)標(biāo)志物P53 的表達(dá)情況；②MR 檢查后一個(gè)月內(nèi)進(jìn)行手術(shù)治療，術(shù)前未經(jīng)任何免疫治療及新輔助放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①M(fèi)R檢查前已經(jīng)行抗癌治療或手術(shù)治療；②臨床或病理資料不完整，包含腺鱗癌、鱗狀細(xì)胞癌、印戒細(xì)胞癌等病理其他類型；③圖像質(zhì)量不佳或病灶顯示不佳，不利于感興趣區(qū)的勾畫。

1.2 掃描方法及參數(shù)

評(píng)估患者無(wú)MR 檢查禁忌及相關(guān)病史后，囑咐患者于檢查前3 d 低脂、少渣飲食，檢查前6 h 禁食水，并告知患者及家屬相關(guān)注意事項(xiàng)，取得其知情同意。選用3.0 T MR (Signa HDxt，GE MedicalSystems，USA)掃描儀，指導(dǎo)患者采取仰臥位，于檢查前適量飲水，以保持膀胱達(dá)到一定程度的充盈。自兩側(cè)骶髂關(guān)節(jié)連線水平至恥骨聯(lián)合下緣水平范圍內(nèi)，對(duì)患者行盆腔掃描，掃描序列為常規(guī)擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion-weighted imaging，DWI)、T2WI、DCE-MRI。掃描參數(shù)(表1)，掃描啟動(dòng)時(shí)間是一期之后，灌注期相39，本研究選用的對(duì)比劑為GE藥業(yè)生產(chǎn)的釓雙胺注射液(Gd-DTPA-BMA，歐乃影)，經(jīng)肘靜脈注射，注射劑量0.1 mmol/kg，速率為2.5 mL/s，注射后用20 mL生理鹽水沖管。

表1 3.0 T MRI掃描序列及參數(shù)Tab.1 3.0 T MRIscan sequence and parameters

1.3 圖像分析與測(cè)量

由GE Functool 4.6 工作站導(dǎo)入DCE-MRI 圖像后，通過(guò)GenIQ 軟件進(jìn)一步完成DCE-MRI 的后處理，以DICOM 格式導(dǎo)出Ktrans、Kep、Ve圖像，并導(dǎo)入ITK-SNAP 3.6 軟件(https：//www.softpedia.com/get/Science-CAD/itk-Snap.shtml)，由兩名影像診斷醫(yī)師(年資分別為8 年和5 年)勾畫病灶，紋理分析過(guò)程中采用雙盲法在每例患者的DCE-MRI 后處理Ktrans、Kep、Ve圖像中選取包括病灶的最大層面及病灶最佳、最大層面及相鄰上下兩個(gè)層面增厚的腸壁的邊緣，并將3 個(gè)層面ROI 融合成1 個(gè)容積感興趣區(qū)(volume of interest，VOI)，包含腫瘤壞死、出血及鈣化區(qū)域，并盡量避開(kāi)周圍脂肪及內(nèi)容物，分別測(cè)量并記錄P53 高低表達(dá)組基于Ktrans、Kep、Ve后處理圖像的紋理分析特征參數(shù)：包括最大強(qiáng)度值(max intensity)、中等強(qiáng)度(median intensity)、均 值(mean value)、最小強(qiáng)度值(min intensity)、偏度(skewness)、峰度(kurtosis)、熵(entropy)、能 量(energy)、群集顯著性(cluster prominence)、集群陰影(cluster shade)、相關(guān)性(correlation)、慣性矩(inertia)，見(jiàn)圖1。

圖1 患者男，71 歲，P53 高表達(dá)，病理結(jié)果顯示：直腸中低分化管狀腺癌，侵及肌層，見(jiàn)神經(jīng)侵犯，無(wú)相關(guān)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況出現(xiàn)。影像表現(xiàn)為：直腸左側(cè)壁局部增厚，漿膜面稍毛糙。A 為T2WI圖像，病灶呈等信號(hào)；B 為DWI圖像，病灶呈明顯高信號(hào)；C 為DCE-MR 原始圖像，增強(qiáng)可見(jiàn)病灶明顯強(qiáng)化；D 為Ktrans重建圖：Ktrans值=0.25/min；E 為Ve重建圖：Ve值=0.171；F 為Kep重建圖：Kep值=1.544/min。G～I(xiàn)分別為Ktrans、Ve、Kep紋理分析ROI勾畫圖；J～L 分別為Ktrans、Ve、Kep紋理分析提取的特征直方圖Fig.1 Male,71 years old,with high expression of P53.The pathological results showed that:poorly differentiated tubular adenocarcinoma of the rectum,which invaded the muscle layer,saw nerve invasion,and no related lymph node metastasis.The image showed that the left wall of the rectum was locally thickened,and the serosal surface was slightly rough.A is a T2WIimage,the lesion is iso-signal;B is a DWIimage,and the lesion is obviously high-intensity;C is the original DCE-MR image,and the visible lesion is obviously enhanced;D is the Ktrans reconstruction image:Ktrans value=0.25/min;E is Ve reconstruction map:Ve value=0.171;F is Kep reconstruction map:Kep value=1.544/min.G—Iare the Ktrans,Ve,Kep texture analysis ROIsketch map;J—L are the Ktrans,Ve,Kep texture analysis extracted feature histogram.

1.4 P53免疫組化蛋白檢測(cè)

本研究中所有直腸癌患者的手術(shù)病理標(biāo)本均由本院病理科醫(yī)生統(tǒng)一檢測(cè)完成。P53 陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核，于100 倍光鏡下任選5 個(gè)視野進(jìn)行觀察，同時(shí)分別計(jì)數(shù)5 個(gè)視野中100 個(gè)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的判定標(biāo)準(zhǔn)如下：小于5%為(-)，5%～25%為(+)，26%～49%為(++)，50%～75%為(+++)，大于75%為(++++)，當(dāng)P53 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于50%時(shí)，屬于低表達(dá)組，反之為高表達(dá)組[8-9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficients，ICC)對(duì)兩位觀察者所測(cè)數(shù)據(jù)的一致性進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)ICC 值＞0.75，即一致性良好時(shí)，采用高年資醫(yī)師測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)比較。比較兩位觀察者所測(cè)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，采用Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)描述為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)量為t值；反之，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)描述為中位數(shù)(25%，75%)，統(tǒng)計(jì)量為Z值。應(yīng)用ROC 曲線分析DCE-MRI 的有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的紋理特征參數(shù)的鑒別效能、敏感度、特異度及95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)；應(yīng)用二元Logistics 回歸分析聯(lián)合DCE-MRI 紋理特征參數(shù)進(jìn)行效能分析，用Delong 檢驗(yàn)對(duì)各單一參數(shù)模型的AUC 進(jìn)行比較，對(duì)聯(lián)合模型AUC 與各單一參數(shù)模型的AUC 進(jìn)行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

直腸癌患者P53 低表達(dá)組和高表達(dá)組的臨床一般資料及比較結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明P53 兩組間高表達(dá)組發(fā)生浸潤(rùn)深度[36 (72.00%)]大于低表達(dá)組[21 (51.22%)](P=0.025)。

表2 P53低表達(dá)組和高表達(dá)組患者的一般臨床資料Tab.2 General clinical data of patients in P53 low expression group and high expression group

2.2 兩名觀察者測(cè)量數(shù)據(jù)的一致性檢驗(yàn)

觀察者一和觀察者二所測(cè)量的DCE-MRI 紋理參數(shù)最大強(qiáng)度值、中等強(qiáng)度、均值、最小強(qiáng)度值、偏度、峰度、熵、能量、群集顯著性、集群陰影、相關(guān)性、慣性矩的ICC 值分別為0.997、0.964、0.948、0.874、0.992、0.893、0.996、0.903、0.995、0.994、0.993、0.986，一致性良好，ICC值均＞0.75。

2.3 P53兩組間的紋理參數(shù)測(cè)量結(jié)果

P53 高表達(dá)組紋理參數(shù)Cluster ProminenceKtrans(23.00±50.84)×106、CorrelationKtrans(1.49±1.42)×10-2、InertiaKep(13.52±22.31)×104值均大于低表達(dá) 組Cluster ProminenceKtrans(4.89±5.92)×106、CorrelationKtrans(0.16±0.17)×10-2、InertiaKep(50.52±61.27) ×103，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表3)。

表3 P53低表達(dá)組和高表達(dá)組的紋理分析特征參數(shù)測(cè)量結(jié)果Tab.3 Texture analysis feature parameter measurement results of P53 low expression group and high expression group

2.4 P53高低表達(dá)組DCE-MRI紋理參數(shù)的效能分析

P53分析Ktrans、Ve、Kep3個(gè)后處理圖像的紋理分析，得到以下有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義紋理參數(shù)AUC 值分別為0.712(Cluster ProminenceKtrans)、0.838 (CorrelationKtrans)、0.638 (InertiaKep)，其中單個(gè)參數(shù)診斷效能最高的是CorrelationKtrans，AUC 為0.838。聯(lián)合3 個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的參數(shù)Cluster ProminenceKtrans、CorrelationKtrans、InertiaKep得到聯(lián)合診斷效能，AUC為0.914，敏感度為80%，特異度為95% (見(jiàn)表4、圖2)。經(jīng)Delong 檢驗(yàn)，P53 兩組間有組間差異紋理參數(shù)聯(lián)合模型AUC大于單一Cluster ProminenceKtrans、CorrelationKtrans、InertiaKep參數(shù)模型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表5。

表4 P53低表達(dá)組和高表達(dá)組的定量參數(shù)、紋理參數(shù)的效能分析Tab.4 Effectiveness analysis of quantitative parameters and texture parameters of P53 low expression group and high expression group

表5 P53兩組間聯(lián)合參數(shù)和單一參數(shù)經(jīng)Delong試驗(yàn)比較結(jié)果Tab.5 Delong test results of combined parameters and single parameters of P53 between the two groups

圖2 P53 低表達(dá)組和高表達(dá)組DCE-MRI紋理參數(shù)及其聯(lián)合分析的ROC曲線Fig.2 The ROC curve of DCE-MRItexture parameters and joint analysis of P53 low expression group and high expression group.

采用Logistic回歸，將P53兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的紋理參數(shù)依據(jù)加權(quán)系數(shù)進(jìn)行聯(lián)合，紋理參數(shù)聯(lián)合回歸模型：-2.703+7.648×ClusterProminenceKtrans+3.819×CorrelationKtrans+0.462×InertiaKep。

3 討論

直腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，由于早期癥狀不夠顯著，因而不易診斷，發(fā)現(xiàn)時(shí)常有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去最佳治療時(shí)機(jī)。因此，術(shù)前早期、準(zhǔn)確的診斷成為直腸癌精準(zhǔn)診治亟待解決的臨床問(wèn)題。近年來(lái)，人工智能影像檢查分析手段備受關(guān)注，但目前尚無(wú)紋理分析用于直腸癌P53表達(dá)狀態(tài)的研究。

紋理分析通過(guò)圖像像素的分布、像素之間的關(guān)系進(jìn)行量化來(lái)反映直腸癌腫瘤的異質(zhì)性，能夠評(píng)價(jià)整個(gè)腫瘤的內(nèi)部組織特點(diǎn)，包括壞死區(qū)、水腫區(qū)和腫瘤活性區(qū)等分布情況，從而反映出腫瘤的生物學(xué)特性及其發(fā)生發(fā)展變化[10-14]。在惡性腫瘤患者中，有50%的患者存在P53 抑癌基因突變的現(xiàn)象，P53 的表達(dá)情況一定程度上引起組織生物學(xué)特性的變化，反映組織生物學(xué)行為，主要是腫瘤病理形態(tài)以及血流動(dòng)力學(xué)方面的改變，間接指代影像成像所獲得的反映腫瘤血管灌注滲透的參數(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于與直腸惡性腫瘤相關(guān)的研究中[5-7]。

本研究中紋理特征Cluster Prominence 在P53高表達(dá)組高于低表達(dá)組，Cluster Prominence作為衡量一種分布不對(duì)稱型的表達(dá)形式，其大小與圖像的對(duì)稱性呈負(fù)相關(guān)，假如影像結(jié)果顯示，Cluster Prominence 存在低值，表明灰度級(jí)上圖像值具有的峰值相對(duì)較小，同時(shí)在不同組織之間灰度也并不具有較大的差異。因此分析本研究結(jié)果，可能因?yàn)镻53 在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)增強(qiáng)，腫瘤的新生血管豐富，腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)活躍，灰度差異性大。Cluster Prominence 同時(shí)應(yīng)用于腦腫瘤研究中，研究表明紋理參數(shù)Cluster Prominence 值可預(yù)測(cè)高危非典型腦腫瘤的復(fù)發(fā)，腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)，Cluster Prominence值增加[15-17]。

本研究表明P53高表達(dá)組Ktrans圖像的Correlation值更高，Correlation用來(lái)測(cè)量相鄰像素的灰度級(jí)的相似性和線性相關(guān)性，表示像素在整個(gè)圖像上與其相鄰像素的相關(guān)性。本研究結(jié)果表示P53高表達(dá)組病灶像素在整個(gè)Ktrans圖上與其相鄰像素的相關(guān)性更高。有研究顯示在基于3.0 T DCE-MRI 的Ktrans圖像的紋理分析預(yù)測(cè)局部進(jìn)展期直腸癌患者術(shù)前新輔助化療病理反應(yīng)的研究結(jié)果表明，病理上完全反應(yīng)組的Mean Intensity、Entropy 和Correlation 值減低，并且認(rèn)為Correlation 是鑒別進(jìn)展期直腸癌患者是否獲得病理完全緩解的最有價(jià)值參數(shù)[18-19]。

而紋理特征參數(shù)Inertia 是度量矩陣值的分布情況，反映圖像的清晰度和紋理的溝紋深淺。本研究表明P53 高表達(dá)組Kep圖像Inertia 值比低表達(dá)組高，表示P53 高表達(dá)Kep圖像更清晰、紋理的溝紋更深，信號(hào)強(qiáng)度變化更高。分析原因是腫瘤微環(huán)境的不同，導(dǎo)致了發(fā)生P53高表達(dá)組的腫瘤組織異質(zhì)性較高，表現(xiàn)為腫瘤新生血管的密度較大、細(xì)胞密度較為致密、排列順序較為混雜、血管基膜的完整性不佳等，而應(yīng)考慮為一種惡性程度較高的表現(xiàn)。有研究表明ADC 圖的紋理特征Inertia 是直腸癌治療反應(yīng)的預(yù)后因素[20-21]。

本研究的主要不足有以下兩點(diǎn)：一是使用的樣本量相對(duì)較小，選擇的研究方式為回顧性研究，因此最終獲得的研究成果可能存在一定的偏差，今后研究中應(yīng)增大樣本量，保證研究的科學(xué)性、可靠性，同時(shí)開(kāi)展前瞻性研究，結(jié)果更有說(shuō)服力；二是結(jié)合腫瘤的相鄰兩層面以及最大層面情況可以看出，通過(guò)人工的方式對(duì)ROI進(jìn)行勾畫，可能存在主觀性判斷的問(wèn)題，難免丟失部分病灶信息，沒(méi)有對(duì)病灶進(jìn)行全面的評(píng)估。

目前尚無(wú)學(xué)者應(yīng)用DCE-MRI 紋理分析方法在直腸癌中預(yù)測(cè)P53 表達(dá)狀態(tài)的研究，本結(jié)果顯示，當(dāng)僅考慮直腸癌組織的DCE-MRI 某個(gè)紋理參數(shù)，多數(shù)情況下其評(píng)估價(jià)值有限，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的紋理特征參數(shù)AUC 值分別為0.712、0.838、0.638。本研究將P53 高低表達(dá)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的紋理特征值進(jìn)行聯(lián)合分析，其診斷效能提高到0.914，此時(shí)判斷P53 表達(dá)的特異度高達(dá)95%，因此DCE-MR 后處理圖像紋理特征的聯(lián)合分析對(duì)預(yù)測(cè)直腸癌P53 表達(dá)狀態(tài)的價(jià)值更高。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無(wú)利益沖突。