任英華，盛迅倫，賈 沁，容維寧，張 爽

?KEYWORDS:autosomal recessive inheritance; retinitis pigmentosa; cone-rod dystrophy; gene detection; mutation analysis

0引言

遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病(hereditary retinal dystrophies, HRD)是臨床上最常見的致盲性遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病[1]，主要病因?yàn)檫z傳性基因突變，具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性。其中常染色體隱形遺傳視網(wǎng)膜色素變性(autosomal recessive retinitis pigmentosa, ARRP)和常染色體隱形遺傳視錐-視桿細(xì)胞營養(yǎng)不良(cone-rod dystrophy, CORD)兩種疾病的表型之間具有一定程度的相似性和交叉性，致病基因又有重疊性，從遺傳學(xué)及臨床表型探索疾病的特點(diǎn)有利于發(fā)現(xiàn)疾病規(guī)律，進(jìn)一步尋找共同治療靶點(diǎn)。視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)是由于光感受器(視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞)或視網(wǎng)膜色素上皮的結(jié)構(gòu)或功能異常相關(guān)的一類遺傳性進(jìn)行性致盲眼病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，在由單一基因所致盲的遺傳性眼病中RP發(fā)病率占首位。世界范圍內(nèi)的發(fā)病率為1/4000[2]，影響全世界約250萬人[3]。CORD以視錐細(xì)胞受損為主，伴不同程度的視桿細(xì)胞損傷。兩者均為高度臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性眼病，許多基因缺陷均可導(dǎo)致上述兩種疾病的發(fā)生，目前不能通過基因檢測結(jié)果直接進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，限制了本病基因診斷在臨床的廣泛應(yīng)用。本研究應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲結(jié)合二代測序技術(shù)對ARRP和CORD患者進(jìn)行基因突變頻譜檢測分析，同時(shí)結(jié)合臨床表型分析，初步探討ARRP和CORD的診斷和鑒別診斷。

1對象和方法

1.1對象選擇2016-09/2020-02在寧夏眼科醫(yī)院就診的35例ARRP患者和18例CORD患者納入研究，采集先證者及家系成員病史資料，所有患者及其家庭成員均接受詳細(xì)的眼部檢查，包括裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、裸眼視力、最佳矯正視力、視野、彩色眼底照相、頻域光相干斷層掃描(optical coherence tomography, OCT)、熒光素眼底血管造影及視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram, ERG)等檢查。ARRP納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合ARRP的診斷標(biāo)準(zhǔn):1)首發(fā)夜盲史；2)視力逐漸下降；3)眼底表現(xiàn)為視盤色蠟黃或變淡，視網(wǎng)膜血管變細(xì)，周邊視網(wǎng)膜可見骨細(xì)胞樣色素沉著，晚期視野呈向心性縮窄；4)暗適應(yīng)檢查早期視桿細(xì)胞功能降低，視錐細(xì)胞功能正常，隨著病情的進(jìn)展，視錐視桿細(xì)胞功能均下降甚至喪失；(2)通過系譜分析確定為RP患者。ARRP排除標(biāo)準(zhǔn)：通過全身檢查排除綜合征性RP患者、非典型RP患者。常染色體隱性遺傳CORD納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合CORD的診斷標(biāo)準(zhǔn)：1)首發(fā)視力逐漸下降；2)視野出現(xiàn)中心暗點(diǎn)；3)全視野ERG出現(xiàn)視錐視桿細(xì)胞功能均下降甚至喪失，并且視錐細(xì)胞功能和視桿細(xì)胞功能相同或受損更嚴(yán)重；4)多數(shù)患者眼底檢查和黃斑OCT檢查顯示黃斑萎縮；(2)通過系譜分析確定為CORD患者。常染色體隱性遺傳CORD排除標(biāo)準(zhǔn)：通過全身檢查及基因檢測排除誤診為CORD患者。本研究遵循赫爾辛基宣言，并經(jīng)寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院寧夏眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過批文號，所有研究對象和未成年患者監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取及測序分析從受檢者外周血中提取DNA。應(yīng)用的目標(biāo)序列捕獲芯片包括232個(gè)由RetNet網(wǎng)站(https://sph.uth.edu/RETNET)所公布的HRD已知致病基因，針對已知的致病基因及突變位點(diǎn)定制特異性的寡核酸苷酸探針，通過Agilent SureSelect外顯子靶向序列富集系統(tǒng)對目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行液相捕獲，高通量測序儀(Illumina HiSeqTM2000)進(jìn)行測序。將高通量二代測序結(jié)果應(yīng)用Burrows-Wheeler Aligner軟件同University of California Santa Cruz(UCSC)人類基因組對照序列hg19完成比對，并運(yùn)用Genome Analysis Tool Kit工具對獲得的測序結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)及完善。將檢測獲得的DNA序列變異信息與單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對過濾，應(yīng)用ANNOVAR對剩余的突變基因進(jìn)行蛋白質(zhì)的改變預(yù)測，剔除同義突變，利用專業(yè)版人類基因突變數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因位點(diǎn)檢索獲得候選致病突變位點(diǎn)。對可疑致病變異進(jìn)行Sanger驗(yàn)證及家系共分離分析。

1.2.2數(shù)據(jù)分析依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American college of medical genetics and genomics, ACMG)，2015年發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對新發(fā)變異進(jìn)行基因變異致病性評估。已報(bào)道變異分類標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)方法[4]，采用GERP++軟件和UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在線工具對突變位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行保守性分析。在1000Genome(http://browser.1000genomes.org/index.html)、EVS(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)和ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)數(shù)據(jù)庫中查看變異在正常人群中的等位基因頻率，最小等位基因頻率小于0.005作為排除良性變異的標(biāo)準(zhǔn)。選用Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)、SIFT(http://sift.jcvi.org)、PROVEAN(http://provean.jcvi.org/index.php)和MutationTaster(http://www.Mutationtaster.org)進(jìn)行致病性預(yù)測。用Human Splicing Finder和MaxEntScan(http://www.umd.be/HSF/)預(yù)測變異對pre-mRNA正確剪切的影響。使用HOPE(https://www3.cmbi.umcn.nl/hope)分析變異對于編碼蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

2結(jié)果

有些遺傳性眼病家系中除先證者外，家庭成員中暫找不到其他患者，無法確定其遺傳方式，既往稱為散發(fā)型。但是隨著近年來二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，許多對散發(fā)遺傳性眼病的研究表明這些病例大部分屬于常染色體隱性遺傳。本研究的35例ARRP患者中，首發(fā)癥狀為夜視力下降者26例，不同程度進(jìn)行性視力下降者為5例，健康查體發(fā)現(xiàn)為4例，首發(fā)癥狀年齡為6～49歲，最佳矯正視力范圍為0.1～2.0。本研究的18例CORD患者中，首發(fā)癥狀為進(jìn)行性視力下降，首發(fā)癥狀年齡為12～36歲，最佳矯正視力范圍為指數(shù)/30cm～0.3。

本研究中對35例ARRP患者和18例CORD患者進(jìn)行基因檢測分析，其中表1提示：在35例ARRP患者中，檢測到突變基因共有16個(gè)，分別是ABCA4、C2orf71、C8orf37、CLRN1、EYS、CLN3、CRB1、CNGA1、KIAA1549、MERTK、NRL、PROM1、RDH12、RHO、RP1和TULP1，其中以RP1基因突變率最高，占14%(5/35)，其次為以ABCA4、CRB1和EYS基因，均占11%(4/35)；表2提示：18例CORD患者中，共檢測到突變基因10個(gè)，分別是ABCA4、ALMS1、CLN3、CRB1、NRL、PROM1、RPE65、USH2A、GUCY2D、CDH23，其中以ABCA4基因突變率最高，占28%(5/18)，其次為以ALMS1、PROM1、RPE65、USH2A基因，均占11%(2/18)；在ARRP和CORD患者中，共同致病基因有ABCA4、CLN3、CRB1、PROM1、NRL共5個(gè)，占42%(22/53)。

表1 ARRP患者中突變基因位點(diǎn)

表2 常染色體隱性遺傳CORD患者中突變基因位點(diǎn)

3討論

在HRD的研究中，致病基因臨床表型存在很大的異質(zhì)性。研究HRD表型異質(zhì)性有利于豐富疾病表型譜特征，促進(jìn)HRD的精準(zhǔn)診斷和個(gè)體化治療。本研究應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲結(jié)合第二代測序技術(shù)對患者進(jìn)行突變基因篩查，篩查技術(shù)快速而準(zhǔn)確。在ARRP和CORD兩種疾病中，ARRP共篩查出16個(gè)致病基因，CORD共篩出10個(gè)致病基因，覆蓋范圍為常見致病基因，表現(xiàn)為高度的遺傳異質(zhì)性和臨床異質(zhì)性，其中有5個(gè)共同致病基因，分別為ABCA4、PROM1、CLN3、CRB1、NRL。ABCA4的檢出頻率最高，其次為PROM1。根據(jù)RetNet網(wǎng)站公布的數(shù)據(jù)(RetNet：https://sph.uth.edu/Retnet/sum-dis.htm)顯示，ABCA4、C8orf37、CERKL、PROM1共4個(gè)基因既可以導(dǎo)致ARRP又可導(dǎo)致CORD。由此可見，以上ARRP和CORD兩種疾病的致病基因具有重疊性，本研究結(jié)果中檢測出5個(gè)共同致病基因也證實(shí)了這一結(jié)果。由于ARRP和CORD兩種疾病無論在表型上還是在疾病進(jìn)展嚴(yán)重程度上均表現(xiàn)一定程度的相似性和交叉性，在不同年齡階段和疾病發(fā)展的不同時(shí)期具有明顯的臨床異質(zhì)性，在致病基因上也存在一定重疊，兩種疾病表型主要區(qū)別在于首發(fā)臨床癥狀，ARRP首發(fā)癥狀為夜盲，該癥狀可持續(xù)多年后出現(xiàn)視力下降，此時(shí)ERG檢查表現(xiàn)視錐視桿細(xì)胞均重度下降。本研究中患者首診原因主要為夜視力下降，最佳矯正視力范圍0.1～2.0，視盤顏色明顯變淡或蠟黃，視網(wǎng)膜血管變細(xì)，后極部及周邊散在骨細(xì)胞樣色素顆粒沉著。而CORD首發(fā)癥狀主要為視力下降，主要為視錐細(xì)胞功能障礙伴較晚的視桿細(xì)胞受累，黃斑區(qū)視網(wǎng)膜外層光感受器受損，隨年齡增長范圍擴(kuò)大，可累及周邊部甚至全視網(wǎng)膜，ERG檢查視錐細(xì)胞反應(yīng)可呈熄滅型或明顯下降。

ABCA4基因突變能夠引起Stargardt病(STGD)、COD/CORD、ARRP或部分類型的年齡相關(guān)性黃斑變性等臨床表型，且患者的發(fā)病年齡、發(fā)病特點(diǎn)也各不相同，ABCA4基因突變?nèi)巳喊l(fā)生率是4.5%～10%[5]。ABCA4基因定位于1p22.1，主要編碼ABCA4蛋白，ABCA4蛋白是感光細(xì)胞中重要的功能性蛋白。功能正常的ABCA4蛋白能夠?qū)⒁曆h(huán)視黃醛代謝的中間產(chǎn)物N-視黃基磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)運(yùn)，幫助其自發(fā)分解為全反式視黃醛，進(jìn)入視循環(huán)。當(dāng)ABCA4蛋白功能異常時(shí)，N-視黃基磷脂酰乙醇胺聚集，并隨感光細(xì)胞脫落至RPE中，經(jīng)進(jìn)一步反應(yīng)生成N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)，A2E是脂褐質(zhì)的主要基團(tuán)，具有細(xì)胞毒性，會(huì)導(dǎo)致RPE細(xì)胞凋亡[6]，進(jìn)而破壞視網(wǎng)膜色素上皮的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致疾病發(fā)生和發(fā)展。一般常染色體隱性遺傳發(fā)病早，病情進(jìn)展快。視功能損害較為嚴(yán)重。王曉光等[7]研究表明，ABCA4基因突變出現(xiàn)在CORD患者及其同胞妹妹基因檢測中，二者雖致病基因一致，但眼底表現(xiàn)存在差異，因此，僅通過基因檢測難以做出準(zhǔn)確診斷，需與臨床表型相結(jié)合分析才能確定診斷。本研究中，ABCA4重疊出現(xiàn)的頻次最高，且是由不同突變位點(diǎn)導(dǎo)致不同疾病的發(fā)生，臨床表現(xiàn)也出現(xiàn)多樣化。

PROM1基因定位于4p15.32，在視網(wǎng)膜中的確切生理作用尚不清楚，PROM1相關(guān)的臨床表型主要包括STGD，CORD等。PROM1蛋白定位于光感受器外段[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)PROM1-/-小鼠表現(xiàn)出Rdh12和ABCA4的顯著下調(diào)，并推測PROM1缺乏的下游事件是A2E/脂褐素的累積，并加重ABCA4基因突變的效應(yīng)[10]。研究發(fā)現(xiàn)PROM1相關(guān)的形態(tài)表型均與CORD相關(guān)[11]。本研究中ARRP家系的PROM1基因突變位點(diǎn)為c.27_28del(p.L9fs)c.2309C>A(p.P770H)和c.2788-52C>A(NA)，成員尚未見錐桿細(xì)胞營養(yǎng)不良，可能與疾病發(fā)展階段相關(guān)，需要長期隨訪。CORD家系的PROM1基因突變位點(diǎn)為c.544dupC(p.Q182fs)和c.2373+5G>T(NA)。

CLN3基因首先被報(bào)道為神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥的致病基因，基因定位于染色體16p12.1～p11.2[12]，編碼的蛋白是一個(gè)完整的膜蛋白，眼內(nèi)CLN3主要定位于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的內(nèi)段、視網(wǎng)膜內(nèi)部細(xì)胞和Müller細(xì)胞中，與高爾基體和突觸蛋白的運(yùn)輸相關(guān)[13]，為凋亡抑制基因。其突變常與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，眼病患者表現(xiàn)為CORD，其視桿細(xì)胞功能降低明顯，而視錐細(xì)胞功能多變[13]。最早關(guān)于CLN3的研究是Batten病，這是一種感光細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡引起的常染色體隱性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，病理表現(xiàn)為腦神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡及內(nèi)源性神經(jīng)酰胺水平升高[14]，患者的CLN3有近1kb的基因缺失，臨床表現(xiàn)為精神、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)退行性疾病迅速進(jìn)展，癲癇發(fā)作、發(fā)育不良、小頭畸形，共濟(jì)失調(diào)和感光細(xì)胞退化而導(dǎo)致的視力喪失。2014年，Wang等[15]報(bào)導(dǎo)CLN3可引起ARRP和CORD,但未見全身癥狀。本研究中ARRP患者CLN3基因突變位點(diǎn)為c.416G>A(p.G154D)，而CORD患者基因突變位點(diǎn)為c.1012C>T(p.R338C)c.107_124del(p.36_42del)，未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常，伴隨疾病的發(fā)展，是否會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常需要長期隨訪觀察。

CRB1基因定位于1q31.3，要在光感受器內(nèi)段以及大腦中表達(dá)，主要參與光感受器形態(tài)形成，突變可能抑制視網(wǎng)膜的發(fā)育，導(dǎo)致光感受器信號傳導(dǎo)的丟失[16]。CRB1突變的臨床表型主要有RP和Leber先天性黑朦[17]，本研究在CORD中也發(fā)現(xiàn)2例CRB1基因突變，突變位點(diǎn)分別為c.T514C(p.C172R)和c.2378G>A(p.R793Q)。

NRL基因定位于14q11.2，編碼合成堿性亮氨酸拉鏈蛋白，屬于DNA結(jié)合蛋白的亮氨酸拉鏈家族。對視桿細(xì)胞的發(fā)育和分化具有重要作用。表達(dá)于成熟視網(wǎng)膜中。在模仿人類視網(wǎng)膜的發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)NRL敲除會(huì)導(dǎo)致視桿細(xì)胞的完全缺失[18]，并且NRL也是RP基因治療的靶點(diǎn)之一[19]。

綜上所述，目標(biāo)區(qū)域測序的基因診斷方法是檢測HRD的強(qiáng)大工具,結(jié)合臨床表型才能更準(zhǔn)確的做出臨床診斷。在ARRP和CORD兩種疾病中，存在表型異質(zhì)性和致病基因的重疊，同一基因不同位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致不同疾病或同一疾病但不同臨床表型。因此，對ARRP和CORD的診斷需要依據(jù)基因檢測結(jié)果和更多更深入的臨床研究。遺傳性眼病表型復(fù)雜，明確基因型和臨床表型關(guān)系有利于輔助基因治療的研究。