南 楠，許永崧，李美景，龔慕辛*，郭中原，徐 睿，駱思源，王智民

1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069

2.中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京 100069

3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院內(nèi)分泌代謝與免疫性疾病中心，北京 101149

4.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京 101149

5.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700

6.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

偏頭痛（migraine）作為反復(fù)或周期性發(fā)作的一側(cè)或兩側(cè)搏動性頭痛，常伴有惡心、嘔吐、畏光等自主神經(jīng)癥狀，是一種高致殘和高負擔的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，現(xiàn)有的治療方法對癥狀的改善有一定的作用，但存在有效率低、副作用大、復(fù)發(fā)率高等問題，因此，需要尋找更有效、更經(jīng)濟、耐受性更好的治療方法。吳茱萸湯（Wuzhuyu Decoction）首載于漢代張仲景《傷寒論》，以吳茱萸、人參、生姜、大棗4 味藥組成，主治“干嘔吐涎沫，頭痛者”，是后世醫(yī)家治療肝胃虛寒、濁陰上逆型偏頭痛的代表方劑。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸湯可以有效減少頭痛發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時間且安全性好[1-2]，但其有效成分和作用機制尚不完全清楚。

本課題組前期對吳茱萸湯中改善偏頭痛的有效成分[3]和吳茱萸湯外翻腸囊吸收的可檢測原型成分與藥效間的相關(guān)性[4]進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬黃素-3-O-β-D-葡萄糖苷（limocitrin-3-O-β-D-glucoside，Lcs）、人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1，Rg1）、人參皂苷Re（ginsenoside Re，Re）、人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，Rb1）、吳茱萸苦素（rutaevin，Rv）、檸檬苦素（limonin，Li）、吳茱萸堿（evodiamine，Ev）、6-姜辣素（6-gingerol，6-Gi）和吳茱萸次堿（rutecarpine，Ru）對偏頭痛藥效指標具有不同程度的影響，但2 種譜效相關(guān)實驗得到的部分成分的作用趨向相反，如Rb1在吳茱萸湯中含量越高對藥效越好，但在外翻腸囊吸收譜效相關(guān)研究中卻顯示Rb1進入腸囊越少對藥效越有利。考慮外翻腸囊吸收屬于離體實驗，可能導(dǎo)致結(jié)果與實際情況不同，因此，本研究進一步采用單向在體腸灌流方法，對吳茱萸湯中上述成分腸吸收量與藥效間的相關(guān)性進行探究。

除上述成分外，吳茱萸湯作為水煎劑仍含有其他復(fù)雜成分，成分間可能在體內(nèi)過程中存在協(xié)同或拮抗作用，并影響療效。這些成分治療偏頭痛的作用機制和成分間的相互影響尚未明確，因此，本實驗采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對吳茱萸湯中包括上述成分在內(nèi)的活性成分和作用靶點等進行推測，為明確吳茱萸湯治療偏頭痛的藥效成分和機制研究提供新的思路和視角。

1 材料

1.1 儀器與材料

BT100-1L 蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；Agilent 1100系列高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent公司）；ΜG-2200 氮吹儀（EYELA 公司）；ALPHA 1-2 PLUS冷凍干燥機（Christ 公司，德國）。

1.2 藥品與試劑

利血平注射液（規(guī)格 1 mg︰1 mL，批號1509071，廣東邦民藥業(yè)有限公司），琥珀酸舒馬曲坦片（以琥珀酸舒馬曲坦計 100 mg/片，批號4G6919T，天津華金藥業(yè)有限公司），一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和考馬斯亮藍試劑盒（南京建成生物工程研究所）。Ev（批號110801-200908，質(zhì)量分數(shù)99.7%）、Ru（批號110801-201207，質(zhì)量分數(shù)99.4%）、Li（批號110801-201205，質(zhì)量分數(shù) 88.5%）、Rg1（批號110703-201128，質(zhì)量分數(shù) 93.4%）、Re（批號110754-201123，質(zhì)量分數(shù) 89.1%）、Rb1（批號110704-201223，質(zhì)量分數(shù) 95.9%）、6-Gi（批號111833-201102，質(zhì)量分數(shù)98.6%），以上對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；Lcs（自制，質(zhì)量分數(shù)≥95%）；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）（批號BCBP2642V，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA，批號BCBP2642V，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、多巴胺（dopamine，DA，批號H8502-5G，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE，批號H7752-250ΜG，質(zhì)量分數(shù)≥97%），內(nèi)標物 3,4-二羥基芐胺（3,4-dihydroxy-benzylamine，3,4-DHBA，批號16290-26-9，質(zhì)量分數(shù)98%），以上對照品及內(nèi)標物均購自Sigma 公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購自ThermoFisher 公司。

1.3 動物

SPF 級SD 雄性大鼠，7～8 周齡，體質(zhì)量280～320 g，合格證號為SCXK（京）2016-0011；SPF 級ICR 小鼠，雌雄各半，7～8 周齡，體質(zhì)量28～32 g，合格證號為SCXK（京）2012-0001，均購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)在室溫（25±2）℃、濕度（50±10）%、自由攝食和飲水并暴露于12 h 的光/暗交替環(huán)境中。動物實驗經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準（倫理編號 AEEI-2014-128），實驗結(jié)束采用頸椎脫臼法處死動物。

1.4 吳茱萸湯的制備

吳茱萸、人參、生姜、大棗飲片收集自不同產(chǎn)地（表1），均由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥資源教研室羅容教授鑒定為蕓香科植物Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.的干燥近成熟果實、五加科植物人參Panax ginsengC.A.Μey.的干燥根和根莖、姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖、鼠李科植物棗Ziziphus jujubaΜill.的干燥成熟果實，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。各藥材按照文獻方法[3]加水煎煮，共獲得10 種吳茱萸湯，質(zhì)控指標見表2，藥液減壓干燥成干膏，使用前復(fù)溶。

表1 10 種吳茱萸湯飲片組成Table 1 Medicinal slices in 10 kinds of Wuzhuyu Decoction

表2 10 種吳茱萸湯中9 種成分含量Table 2 Conents of nine ingredients in 10 kinds of Wuzhuyu Decoction

2 方法

2.1 大鼠單向在體腸灌流實驗

2.1.1 色譜條件 Kromasil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），洗脫梯度如表3所示，柱溫30 ℃，檢測波長203 nm，體積流量1 mL/min。

表3 HPLC 含量測定梯度洗脫程序Table 3 HPLC gradient elution procedure for content determination

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取適量各對照品，以甲醇配制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，取混合對照品溶液 100 μL，加入 K 氏緩沖液（Kreb-Ringer，KR）100 μL，混勻后氮氣吹干，100 μL 甲醇復(fù)溶，離心取上清，20 μL 進樣分析。

2.1.3 供試品溶液的制備 取相當于生藥量3.5 g 吳茱萸湯干膏，加入20 mL 甲醇超聲30 min，濾過蒸干，色譜甲醇復(fù)溶并定容至5 mL，10 μL 進樣分析。

2.1.4 標準曲線的制備及線性關(guān)系考察 取各對照品溶液，以甲醇配制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，用0.45 μm 濾膜濾過，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣20 μL。線性關(guān)系考察同文獻結(jié)果[3]。

2.1.5 準確度、精密度、穩(wěn)定性及回收率考察 參考文獻方法[4]對HPLC 測定方法的準確度與精密度及樣品的穩(wěn)定性、提取回收率進行考察。準確度RSD 均小于15%，日內(nèi)精密度及日間精密度RSD均小于10%，穩(wěn)定性試驗結(jié)果偏差在±5%以內(nèi)，結(jié)果均符合生物樣品分析要求。

2.1.6 在體腸灌流樣品的制備 參照文獻方法[5]配制KR 緩沖液。稱取“1.4”項中吳茱萸湯煎液的干燥粉末，用KR 緩沖液配制相應(yīng)生藥濃度的在體腸灌流吸收實驗樣品溶液，為防止沉淀堵塞腸管，預(yù)先進行離心（3000 r/min 離心10 min），取上清液進行灌流。

2.1.7 單向在體腸灌流模型的制備及吸收樣品處理參考文獻方法[4]制備大鼠在體腸灌流模型并進行灌流液樣品的取樣。吸收樣品溶液的制備：將各樣品冷凍干燥后，每200 μL 樣品加甲醇500 μL，渦旋混合30 s，超聲30 min，3000 r/min 離心5 min，取上層清液。上清液用氮氣吹干，每200 μL 樣品殘渣加甲醇100 μL，渦旋混合30 s，超聲5 min。樣品用針頭過濾器濾過，吸取10 μL 注入HPLC 儀，按照“2.1.1”項色譜條件進行分析。單向在體腸灌流單位面積累積吸收量（M）計算方法公式如下。

M＝V×[Cin－Cout×(Vout/Vin)]×15/(a×b)

M為藥物的累積吸收量，Cin為供試液濃度，Cout為收集液樣品濃度，Vout為收集液體積，Vin為供試液體積，a 和b 為腸段長度（cm）和周長（cm）

實驗中檢測的是藥液中的原型成分，計算出的是經(jīng)過腸道后藥液中消失成分的量，將其看作被吸收的量，實際上不僅包含被吸收的成分，也可能包含經(jīng)腸道代謝的成分。為了簡便描述，本研究均稱作吸收量。

2.2 小鼠偏頭痛實驗

2.2.1 小鼠偏頭痛模型的制備、分組及給藥 將小鼠分為14 組，每組12 只，包括對照組、假手術(shù)組、模型組、陽性藥（舒馬曲坦，5.83 mg/kg）組及10組吳茱萸湯治療組。給藥體積均為20 mL/kg。吳茱萸湯組采取預(yù)防加治療的給藥模式，實驗開始第1天按0.2 mL/10 g 體質(zhì)量ig 給予相應(yīng)吳茱萸湯1次/d，對照組、假手術(shù)組、模型組每天ig 給予等劑量蒸餾水，陽性藥組僅進行治療給藥，從第6 天起ig 舒馬普坦。參考文獻方法[3]制備小鼠偏頭痛模型：第6～13 天，各給藥組小鼠sc 0.172 mg/kg 利血平1次/d，假手術(shù)組和對照組sc 等量生理鹽水；第14天小鼠用3%水合氯醛（450 mg/kg）麻醉，剪開頭部皮膚，在前囟下2 mm、矢狀縫右側(cè)2 mm 處鉆一孔，剪尾取自體血液，自鉆孔處注射2 μL 自體血液于大腦皮層，深度1 mm，手術(shù)結(jié)束后用骨蠟止血，青霉素抗炎，縫合創(chuàng)面，假手術(shù)組只鉆孔不埋血塊，對照組不做處理。第15～21 天各組繼續(xù)ig 給藥。第21 天，各組小鼠麻醉、處死，取心臟混合血液及全腦。

2.2.2 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及NO 含量、NOS 活力的測定方法 參考文獻方法[3]將腦組織勻漿、離心，測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；按照試劑盒說明書進行腦組織及血清中NO 含量、NOS 活力的測定。

2.3 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 在體腸灌流吸收量與藥效指標相關(guān)分析方法

采用Μinitab 17.0（17.1.0.0）中的偏最小二乘回歸方法（partial least squares regression，PLSR），將各成分總吸收量分別與藥效指標進行相關(guān)分析，根據(jù)回歸系數(shù)大小辨識在體腸灌流吸收成分中影響藥效指標的主要成分。使用Μatlab 12.0 R2012b（8.0.0.783）編寫的程序計算熵值，作為各藥效指標在綜合藥效中的權(quán)重。對同一成分與各藥效指標的回歸系數(shù)、各藥效指標熵值權(quán)重的乘積求和，作為該成分對綜合藥效的作用趨勢。

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.5.1 吳茱萸湯活性成分的篩選 由于中藥成分復(fù)雜，吳茱萸湯中除上述已測定成分外，尚有大量未測定成分，故本研究利用TCΜSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫[6]和TCΜIP（http://www.tcmip.cn/TCΜIP/index.php/Home/）數(shù)據(jù)庫[7]對吳茱萸湯4 種中藥的化學(xué)成分進行收集匯總和篩選，去除重復(fù)成分。

2.5.2 潛在活性成分作用靶點的預(yù)測 為了獲得吳茱萸湯潛在活性成分的作用靶點，除利用TCΜSP、TCΜIP 數(shù)據(jù)庫檢索外，還采用SwissTargetPrediction[8]（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）和Similarity Ensemble Approach（SEA）[9]（http://sea.bkslab.org/）對上述成分的作用靶點進行預(yù)測，建立吳茱萸湯潛在活性成分作用靶點數(shù)據(jù)庫。

2.5.3 偏頭痛疾病治療相關(guān)靶點的收集 在TTD[10]（http://db.idrblab.net/ttd/）和 DisGeNET（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫中，檢索獲得偏頭痛疾病治療相關(guān)靶點信息。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫將獲得的所有靶點標準化，繪制吳茱萸湯潛在活性成分作用靶點與偏頭痛疾病治療靶點的韋恩圖，獲得交集靶點用于后續(xù)分析。

2.5.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Stringv11.0[11]（https://string-db.org/）構(gòu)建吳茱萸湯和偏頭痛交集靶點的PPI 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學(xué)分析，按照拓撲參數(shù)平均最短路徑（average shortest path length）、接近中心性（closeness centrality）、度（degree）、介數(shù)中心性（betweenness centrality）的平均值為標準，篩選獲得關(guān)鍵靶點。

2.5.5 基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 利用DAVID 對獲得的交集靶點進行GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析，其中以P＜0.05 為篩選條件，認為結(jié)果具有顯著性。通過上述分析，以深入了解吳茱萸湯治療偏頭痛涉及的生物過程和信號通路。

2.5.6 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)藥物（drug）、成分（ingredient）、靶點基因名稱（gene name）之間以及靶點與信號通路之間的相互作用，建立信息網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscapev 3.8.0（www.cytoscape.org）對此網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，同時，構(gòu)建靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，明確信號通路與靶點之間的相關(guān)關(guān)系。

2.5.7 成分-靶點分子對接驗證 選擇“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點和成分，利用Discovery Studio 2020 軟件進行分子對接，驗證關(guān)鍵靶點與成分之間的結(jié)合活性。從Pubchem（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中下載活性成分的3D 結(jié)構(gòu)的SDF 文件，PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org）下載靶點蛋白的3D 結(jié)構(gòu)的PDB 文件。通過虛擬篩選中的精準分子對接程序CDOCKER 模塊進行計算，將原配體對接到各自的活性口袋中，計算初始復(fù)合物中原配體的分子構(gòu)象與對接后的分子構(gòu)象的均方根偏差（root mean square deviation，RΜSD），以RΜSD≤2.0 證明對接所得分子構(gòu)象可以在一定程度上還原配體與受體的結(jié)合模式。將吳茱萸湯活性成分對接進入先前定義好的活性口袋中，以對接能作為對接分值的打分指標，對接能的負值越大，說明受體與活性成分的對接親和力越大，活性也越高[12]，按照原配體與受體對接分值的80%作為閾值，對活性成分和原配體與靶點的結(jié)合能力大小進行預(yù)測和排序，選擇對接打分值高于閾值且作用模式與原配體-受體作用模式近似的化合物作為靶標的潛在抑制劑[13]。

3 結(jié)果

3.1 單向在體腸灌流吸收譜效相關(guān)結(jié)果

3.1.1 單向在體腸灌流吸收譜 實驗結(jié)果顯示不同吳茱萸湯中9 種成分在腸灌流過程中均可被吸收，結(jié)果見表4。各組吳茱萸湯中由于成分配比不同，導(dǎo)致同一種成分的吸收量相差較大，這也使中藥復(fù)方的研究更加的復(fù)雜化。

表4 10 種吳茱萸湯9 種成分單向腸灌流單位面積吸收量 (x± s,n=6)Table 4 Absorption per unit area of nine kinds of ingredients in 10 kinds of Wuzhuyu Decoction by single pass intestinal perfusion (x± s,n=6)

3.1.2 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及NO、NOS 的測定結(jié)果利血平耗竭偏頭痛小鼠模型藥效結(jié)果如表5所示，與對照組和假手術(shù)組相比，造模后小鼠5-HT、5-HIAA、NE、多巴胺的水平顯著降低（P＜0.01），腦中NO、NOS（NO-b、NOS-b）和血清中NOS（NOS-p）的水平顯著升高（P＜0.01）；血清中NO（NO-p）的水平顯著降低（P＜0.01）。吳茱萸湯組或陽性藥組小鼠除DA 外，各指標均得到一定改善。3.1.3 譜效相關(guān)分析結(jié)果 各藥效指標與在體腸灌流吸收量的PLSR 結(jié)果見表6。其中正數(shù)表示各成分在體吸收量與藥效指標呈正相關(guān)關(guān)系，負數(shù)反之。其中藥物成分在5-HT、5-HIAA、NE、DA 及血清NO 指標中的回歸系數(shù)為正，表示該成分對偏頭痛改善具有正向作用，為負表示呈負向作用；藥物成分在腦組織NO 及血清與腦組織NOS 指標中，回歸系數(shù)為正表示該成分在體吸收量對偏頭痛改善具有負向作用，為負表示具有正向作用。綜合趨勢可見，在各藥效指標中，成分在體吸收越多，療效越好的前3 位成分為Rv、Lcs、Ru，成分在體吸收越少，療效越好的前3 位成分為6-Gi、Ev、Rg1。

表5 各小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)的含量 (±s，n=12)Table 5 Contents of monoamine neurotransmitters and vasoactive substances in mice of each group (±s，n=12)

表5 各小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)的含量 (±s，n=12)Table 5 Contents of monoamine neurotransmitters and vasoactive substances in mice of each group (±s，n=12)

與對照組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01；與模型組比較：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01；NO-b、NOS-b 代表腦中NO、NOS 含量 NO-p、NOS-p 代表血清中NO、NOS 含量△P ＜0.05 △△P ＜0.01 vs control group;▲P ＜0.05 ▲▲P ＜0.01 vs model group;NO-b and NOS-b represent NO and NOS content in brain NO-p and NOS-p represent NO and NOS content in serum

組別 5-HT/(ng·g-1) 5-HIAA/(ng·g-1) DA/(ng·g-1) NE/(ng·g-1)假手術(shù) 643.110±107.014▲▲ 377.310±89.668▲ 386.223±128.718▲▲ 439.004±57.942▲▲對照 664.526±63.861 401.609±81.283▲▲ 391.039±94.181 442.259±46.713模型 337.785±84.504△△ 301.904±54.414△△ 242.075±158.621△△ 171.173±65.172△△陽性藥 417.810±92.491▲▲ 386.022±115.267▲ 259.308±104.721 188.654±25.649 WZYD-1 427.344±86.341▲ 424.598±62.161▲▲ 238.002±83.673 222.491±37.219▲▲WZYD-2 526.862±95.044▲▲ 488.519±107.66▲▲△△ 282.070±115.021 225.873±40.351▲▲WZYD-3 443.495±96.816▲ 392.581±65.142▲▲ 234.888±83.549 177.888±35.760 WZYD-4 443.097±63.413▲ 393.811±60.828▲▲ 244.404±126.079 196.890±43.600 WZYD-5 496.664±152.423▲▲ 504.176±77.892▲▲△△ 267.604±132.124 224.429±47.589▲▲WZYD-6 492.962±78.320▲ 432.545±71.805▲▲ 256.052±84.982 195.196±46.363 WZYD-7 433.650±107.179▲ 398.836±108.244▲▲ 338.159±141.715 191.963±33.028 WZYD-8 502.575±133.067▲▲ 459.894±54.514▲▲△ 301.118±129.806 240.470±55.478▲▲WZYD-9 486.512±72.174▲▲ 491.213±85.024▲▲△△ 298.839±104.626 239.249±53.514▲▲WZYD-10 496.519±123.627▲▲ 442.538±67.939▲▲ 305.776±107.064 215.693±82.047▲組別 NO-b/(μmol·g-1) NOS-b/(μmol·g-1) NO-p/(μmol·L-1) NOS-p/(μmol·L-1)假手術(shù) 0.204±0.090▲▲ 0.274±0.176▲▲ 6.541±3.020 41.382±3.429▲▲對照 0.206±0.094 0.257±0.220 8.992±5.197 39.895±4.912模型 0.425±0.184△△ 0.719±0.477△△ 3.705±3.098△△ 50.688±8.132△△陽性藥 0.252±0.137▲ 0.442±0.215▲▲ 3.770±3.163 42.934±5.046▲▲WZYD-1 0.264±0.111▲▲ 0.301±0.216▲▲ 47.712±28.203▲▲ 41.957±6.928▲WZYD-2 0.252±0.087▲▲ 0.357±0.237▲▲ 48.057±25.602▲▲ 43.453±5.200▲WZYD-3 0.334±0.218 0.301±0.212▲▲ 8.146±6.227 42.906±4.442▲▲WZYD-4 0.233±0.117▲▲ 0.295±0.194▲▲ 4.750±4.414 47.639±10.730 WZYD-5 0.264±0.082▲▲ 0.416±0.244▲▲ 17.935±6.520▲ 40.065±6.370▲▲WZYD-6 0.242±0.102▲▲ 0.255±0.181▲▲ 16.952±12.444▲ 39.848±2.443▲▲WZYD-7 0.343±0.159 0.320±0.218▲▲ 13.106±10.452 44.307±6.753▲WZYD-8 0.279±0.137▲▲ 0.361±0.436▲▲ 25.621±16.644▲▲ 45.440±7.591▲WZYD-9 0.215±0.103▲▲ 0.408±0.275▲▲ 20.727±16.112▲▲ 46.103±5.701 WZYD-10 0.274±0.169▲▲ 0.322±0.301▲▲ 16.545±11.290▲ 42.852±6.026▲▲

表6 藥效指標與在體腸灌流吸收量的PLSR 分析結(jié)果Table 6 Partial least-squares regression analysis of pharmacodynamic indexes and intestinal perfusion absorption in vivo

通過上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各成分對不同藥效指標存在不同的作用趨勢，表明這些成分對偏頭痛的治療均具有一定的療效，然而中藥水煎液成分復(fù)雜，除上述成分外仍有大量未進行研究的成分，并且這些成分的作用靶點尚不明確，若對所有靶點逐一驗證可行性較低，因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，利用數(shù)據(jù)庫和軟件檢索、計算、分析的方法，快速有效的篩選出藥物的有效成分和作用靶點。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

3.2.1 吳茱萸湯中抗偏頭痛潛在活性成分 共獲得112 種活性成分，其中吳茱萸中獨有成分39 種、人參獨有成分27 種、大棗獨有成分26 種、生姜獨有成分14 種、大棗和人參共有成分2 種、大棗和吳茱萸共有成分2 種、大棗、人參、生姜共有成分1 種，4 味藥物共有成分1 種，即β-谷甾醇（β-sitosterol）。在多項體內(nèi)外研究中已證明，β-谷甾醇具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜、抗焦慮等作用[14]。含有該成分的杜鵑花科植物Arbutus andrachneL.葉甲醇提取物也對小鼠疼痛模型表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛作用[15]。

3.2.2 吳茱萸湯治療偏頭痛的靶點 共得到了1517 個潛在活性成分作用靶點和278 個偏頭痛治療靶點。繪制韋恩圖共獲得112 個吳茱萸湯治療偏頭痛的作用靶點（圖1）。

圖1 吳茱萸湯潛在活性成分作用靶點與偏頭痛治療靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of potential targets of active ingredient in Wuzhuyu Decoction and targets of migraine therapy

3.2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓撲分析 通過STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建吳茱萸湯治療偏頭痛靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)，其中靶點碳酸酐酶14（Carbonic anhydrase 14，CA14）、蛋白酶體組裝伴侶1（Proteasome assembly chaperone 1，PSΜG1）與其他110 個靶點之間未獲得相互作用的證據(jù)，結(jié)果如圖2-A所示。將PPI 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytosape 軟件中，其中節(jié)點（nodes）110 個，邊（edges）882 條。按照平均最短路徑≤2.28，接近中心性≥0.45，度≥15.02，介數(shù)中心性≥0.012，篩選出31 個關(guān)鍵靶點，如圖2-B所示。如血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）可能與其他46 個靶點相關(guān)，淀粉樣β 蛋白A4 蛋白（amyloid-beta A4 protein，APP）可能與其他45 個靶點相關(guān)，這些與其他靶點關(guān)系密切，在整個調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是吳茱萸湯治療偏頭痛的關(guān)鍵靶點。

圖2 吳茱萸湯治療偏頭痛作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖 (A) 及關(guān)鍵靶點 (B)Fig.2 PPI network map (A) and key targets (B) of Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

3.2.4 GO 及KEGG 富集分析 為了確定112 個交集靶點抗偏頭痛的作用機制，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對這些靶點進行了GO 富集分析，以闡明相關(guān)的生物學(xué)過程（biological process，BP）、細胞組成（cellularcomponent，CC）和分子功能（Μolecular function，ΜF(xiàn)）。結(jié)果3 者分別富集到118、21、21個條目，利用bioinformatics 在線平臺（http://www.bioinformatics.com.cn）將各部分的前10 個條目繪制氣泡圖（圖3），氣泡越大，富集的靶點越多；氣泡顏色越紅，校正后P值越小，表示更高的可信度和重要性。其中BP 中富集最顯著的包括化學(xué)突觸傳遞、對藥物的反應(yīng)、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路、促進鈣離子釋放入胞漿、血管收縮等。CC 富集最顯著的包括細胞膜的整體部分、細胞質(zhì)膜、神經(jīng)樹突、膜筏、神經(jīng)突起等。ΜF(xiàn) 富集最顯著的包括血清素結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G 蛋白偶聯(lián)血清素受體活性、藥物結(jié)合、多巴胺結(jié)合等。結(jié)果顯示，吳茱萸湯治療偏頭痛主要涉及神經(jīng)元膜蛋白相關(guān)的配體-受體結(jié)合，從而影響神經(jīng)信號傳導(dǎo)，發(fā)揮有效的治療作用。

圖3 吳茱萸湯治療偏頭潛靶點GO 富集分析氣泡圖Fig.3 Bubble chart of GO enrichment analysis on potential target of Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫，對吳茱萸湯治療偏頭痛的靶點進行KEGG 通路富集，共富集到24 條信號通路，見圖4。圖中圓形代表靶點，箭頭代表信號通路，面積越大、顏色越深，代表該靶點參與的通路或通路涉及的靶點均越多，說明其在網(wǎng)絡(luò)中越重要。其中校正P＜0.01 的有14 條，如圖5所示，條形越長，代表該信號通路越重要，排名前3 的信號通路分別是神經(jīng)活性配體受體相互作用、5-HT 能突觸信號通路、鈣信號通路，均涉及神經(jīng)遞質(zhì)和突觸信號傳導(dǎo)，提示吳茱萸湯治療偏頭痛的作用機制可能是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)信號的傳導(dǎo)而發(fā)揮作用的。

圖4 吳茱萸湯治療偏頭痛靶點與信號通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of targets and signal pathways in Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

圖5 吳茱萸湯治療偏頭痛信號通路Fig.5 Signal pathways of Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

3.2.5 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 采用Cytoscape 構(gòu)建中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，共有220 個節(jié)點，1444 條邊，如圖6-A所示。同時，根據(jù)篩選獲得的關(guān)鍵靶點，反向?qū)ふ移浠钚猿煞?，從而?gòu)建吳茱萸湯治療偏頭痛的關(guān)鍵靶點和成分網(wǎng)絡(luò)圖，如圖6-B所示，其中81 種成分作用于2 個及以上靶點，提示這些成分的變化對偏頭痛的治療效果產(chǎn)生重要的影響。吳茱萸中的去甲吳茱萸酰胺、evodione、羥基吳茱萸堿和大棗中的左旋千金藤啶堿作用的靶點均有9 個，這些度值較高的成分有可能在吳茱萸湯緩解偏頭痛癥狀中發(fā)揮著相對重要的作用。

圖6 吳茱萸湯治療偏頭痛的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Network diagram of TCM-component-target of Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

上述節(jié)點中度值較高的靶點是多種成分共同作用的部分，被刺激產(chǎn)生作用的可能性大，在偏頭痛治療過程中具有重要意義。吳茱萸湯中有52 種成分共同作用于前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶 2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）靶點，且33 個靶點與該靶點相互作用，這個靶點是參與前列腺素合成、促進炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，抑制該酶活性可以有效抑制神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)。5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（solute carrier family 6 member 4，SLC6A4），可將5-HT 從突觸間隙運回突觸前，從而終止5-HT的作用，有40 種成分和25 個靶點作用于該靶點，抑制該靶點的作用可以有效預(yù)防偏頭痛的發(fā)作，這可能是吳茱萸湯治療和預(yù)防偏頭痛的另一機制，上述實驗研究結(jié)果也證實吳茱萸湯治療后腦干中5-HT 的含量明顯升高。瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1），該靶點參與炎癥疼痛和痛覺敏化的調(diào)節(jié)，具有誘導(dǎo)降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）釋放的作用，而CGRP 是促進血管擴張和三叉神經(jīng)痛覺敏化的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，是誘發(fā)偏頭痛發(fā)作的重要因素[16]。研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚、β-谷甾醇、槲皮素等成分可抑制TRPV1 表達而升高熱痛傷害閾值，這可能也是吳茱萸湯治療偏頭痛小鼠模型療效顯著的原因之一[17]。從上述分析結(jié)果中可看出中藥、成分、靶點之間構(gòu)成了復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，1 種化合物可對應(yīng)多個靶點，而1 個靶點可被多種成分影響，體現(xiàn)了吳茱萸湯多成分、多靶點的治療特色。

3.2.6 分子對接 選取關(guān)鍵靶點和成分網(wǎng)絡(luò)中度值值前3 的靶點，分別是PTGS2（PDBID：1PXX）、SLC6A4（PDBID：5I6X）、TRPV1（PDBID：3SUI），以及這些靶點對應(yīng)的吳茱萸湯活性成分52、40、26個，將這些成分對接到3 個靶點的活性口袋中，選擇CDOCKER 進行對接，其中3SUI 是TRPV1 與鈣調(diào)蛋白的復(fù)合體，沒有小分子化合物作為原配體，將其對接閾值設(shè)為0。3 個靶點獲得9、11、7 個打分值高于閾值的化合物（表5），打分值最高的結(jié)合模式圖見圖7。

圖7 潛在活性成分與靶點的相互作用及藥效團模型匹配圖Fig.7 Interaction between potential active ingredients and target and pharmacophore model matching diagram

表5 篩選得到的3 個靶點的潛在活性成分信息Table 5 Potential active ingredients of screened three targets

4 討論

臨床和基礎(chǔ)研究均證實吳茱萸湯治療偏頭痛療效確切，復(fù)方中不同成分及含量對藥效指標具有不同程度的影響，表明中藥中多種成分之間相互作用，協(xié)同或拮抗起效，本研究利用單向在體腸灌流法模擬吳茱萸湯在體內(nèi)吸收過程，利用PLSR 法對成分的吸收量和藥效指標之間進行回歸分析，結(jié)果表明不同成分對藥效指標有不同程度的影響，但這些成分的作用機制并不僅限于對上述藥效指標的影響，而且吳茱萸湯中的成分也遠遠多于上述成分。因此，在此基礎(chǔ)上，本研究又采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法[18]，從整體的角度探索藥物與疾病的關(guān)聯(lián)性，強調(diào)從藥物、靶點與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，這與中醫(yī)整體觀念、辨證論治的理論不謀而合，從而分析和預(yù)測吳茱萸湯抗偏頭痛治療的成分和作用機制，為中醫(yī)藥治療疾病的機制研究提供參考。

偏頭痛的發(fā)作機制主要與三叉神經(jīng)系統(tǒng)痛覺敏化有關(guān)，同時伴有神經(jīng)源性炎癥、硬腦膜血管擴張。臨床上常用治療藥物一類是非甾體類抗炎藥，另一類是抑制血管擴張藥物，包括5-HT 受體激動劑和與CGRP 相關(guān)藥物。然而，上述藥物治療偏頭痛存在胃腸道潰瘍出血和發(fā)生心腦血管事件的風險，因此，眾多學(xué)者也將偏頭痛的治療藥物轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，中醫(yī)藥具有辨證論治和用藥安全性、耐受性好等特點，其在治療偏頭痛方面具有獨特的優(yōu)勢[19]。臨床[1]和基礎(chǔ)[20]研究均證明吳茱萸湯治療偏頭痛具有明顯的療效和安全性，藥效實驗結(jié)果也表明吳茱萸湯可以有效增加腦5-HT 和5-HIAA 的含量，并降低腦中NO 水平和NOS 活性的作用，從而發(fā)揮治療偏頭痛的作用。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，提示吳茱萸湯可能是通過抑制腦干中5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter，SERT）的作用，從而增加5-HT 和5-HIAA 含量，抑制NOS1 靶點的作用降低NO 的含量。5-HT、5-HIAA 與血管收縮、神經(jīng)突觸傳導(dǎo)關(guān)系密切，NO、NOS 與神經(jīng)源性炎癥、血管收縮關(guān)系密切[21]。綜上，吳茱萸湯可能是通過抑制神經(jīng)源性炎癥、調(diào)節(jié)血管收縮和影響神經(jīng)突觸傳導(dǎo)發(fā)揮治療偏頭痛的作用。

神經(jīng)源性炎癥是偏頭痛發(fā)作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是其病理生理基礎(chǔ)，除了NO 外，前列腺素參與各種炎癥反應(yīng)過程，PTGS2 [也稱環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）]是前列腺素合成的關(guān)鍵酶，其表達與炎癥的嚴重性密切相關(guān)[22]，研究發(fā)現(xiàn)偏頭痛動物模型大腦中COX-2 高表達[23]，同樣偏頭痛患者在發(fā)作期血漿COX-2 的表達也明顯高于發(fā)作間期和健康對照組[21]。非甾體類抗炎藥是廣泛用于治療偏頭痛的一類藥物，其作用機制就是通過改變COX-2 活性，抑制花生四烯酸合成前列腺素，從而抑制神經(jīng)源性炎癥和逆轉(zhuǎn)中樞敏化[24]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTGS2 與吳茱萸湯中的52 種活性成分相關(guān)聯(lián)，并影響5-HT 能突觸信號通路、逆行內(nèi)源性大麻素信號通路、利什曼病、卵巢類固醇生成信號通路、脂肪細胞脂解調(diào)節(jié)這5 條信號通路，PTGS2 在吳茱萸湯治療偏頭痛的過程中占據(jù)了重要的地位，實驗研究證實吳茱萸含量較高的2 種主要成分吳茱萸次堿、吳茱萸堿均可以有效抑制前列腺素的合成[25-26]，這2 種成分均對治療偏頭痛有效，吳茱萸堿在改善藥效學(xué)指標方面起了重要作用[3]。提示吳茱萸湯治療偏頭痛的關(guān)鍵機制之一是抑制神經(jīng)源性炎癥。另外，成年后女性的偏頭痛的發(fā)病率是男性的2～3 倍[27]，表明雌孕激素與偏頭痛的發(fā)作也有密切的關(guān)系，吳茱萸湯也可調(diào)節(jié)卵巢類固醇生成信號通路、脂肪細胞脂解，它們與偏頭痛的病理機制相關(guān)。

另一方面，偏頭痛與血管舒縮密切相關(guān)，5-HT能信號通路和腎素分泌相關(guān)信號通路均涉及血管舒縮功能。5-HT1B/1D 受體（HTR1B/1D）激動劑是偏頭痛治療的常用藥物，具有促進血管收縮和抑制CGRP 等神經(jīng)遞質(zhì)釋放的雙重作用[28]。吳茱萸酰胺乙、去甲吳茱萸酰胺、吳茱萸酰胺、巴婆堿、荷葉堿、aponorhyoscine、5-甲氧基-N,N-二甲基色胺、無刺棗因S7 可同時作用于HTR1B 和HTR1D 這2個靶點，在促進血管收縮的同時抑制三叉神經(jīng)系統(tǒng)上行疼痛傳導(dǎo)通路，從而阻斷痛覺敏化。同時，5-HT能信號通路涉及中樞神經(jīng)突觸信號傳導(dǎo)，偏頭痛患者腦干中5-HT 能神經(jīng)元功能受到抑制，使5-HT 分泌減少，導(dǎo)致下行痛覺易化/抑制功能失調(diào)，使三叉神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)活化。通過GO 和KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，吳茱萸湯治療偏頭痛的分子功能涉及血清素結(jié)合活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G 蛋白耦聯(lián)的血清素受體活性，并且通過調(diào)節(jié)神經(jīng)配體受體相互作用信號通路、5-HT 能神經(jīng)突觸信號通路、鈣離子信號通路發(fā)揮作用，表明吳茱萸湯治療偏頭痛的作用機制可能是通過調(diào)節(jié)5-HT 含量發(fā)揮作用的。其中5-HT 轉(zhuǎn)運體基因SLC6A4受到40 種成分的共同作用，該基因的表達產(chǎn)物SERT 位于突觸前膜上，具有將5-HT 轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)內(nèi)的作用，抑制該蛋白的活性，可以有效增加突觸間5-HT 的濃度，發(fā)揮下行痛覺調(diào)節(jié)作用。阿米替林是三環(huán)類抗抑郁藥，是最早發(fā)現(xiàn)具有預(yù)防偏頭痛作用的藥物之一，其作用機制主要是通過抑制SERT 而發(fā)揮治療作用的，是目前臨床中具有B 級證據(jù)的推薦預(yù)防偏頭痛用藥[29]。吳茱萸湯中多種成分共同作用于該靶點，本課題組前期研究也證實吳茱萸湯治療后腦干中5-HT 的濃度會明顯升高[3]，推測其可能通過抑制5-HT 重攝取而發(fā)揮治療作用。值得注意的是，KEGG 通路富集分析得到腎素分泌通路與偏頭痛的治療相關(guān)，腎素可催化血管緊張素合成，從而產(chǎn)生收縮血管的作用。實驗顯示腎素-血管緊張素系統(tǒng)參與與偏頭痛發(fā)病有關(guān)的神經(jīng)源性炎癥、內(nèi)皮功能障礙和傷害性傳導(dǎo)的神經(jīng)調(diào)節(jié)，使用腎素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等有助于治療偏頭痛，臨床中可用來預(yù)防偏頭痛的發(fā)作[30-31]。

在交集靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)中，VEGFA 與15 種成分、46 個靶點相互作用，是偏頭痛治療的一個核心樞紐靶點。研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛患者發(fā)作期循環(huán)血中VEGFA 的含量較對照組明顯降低[32]，VEGFA 對內(nèi)皮細胞具有保護作用，涉及血管生成、血管通透性改變等因素，其在偏頭痛發(fā)作過程中會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和心血管疾病風險的增加，同時血管通透性的改變也會引起血漿外滲，激活三叉神經(jīng)等感覺神經(jīng)元細胞，從而產(chǎn)生疼痛和痛覺敏化。

利用分子對接對3 個關(guān)鍵靶點和吳茱萸湯活性成分進行分子對接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個靶點與多個成分之間結(jié)合良好，說明吳茱萸湯中成分作用于這些靶點發(fā)揮治療偏頭痛的作用。研究發(fā)現(xiàn)，與PTGS2 結(jié)合較好的多個成分如6-羥基木犀草素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素等均屬于黃酮類化合物，大量研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分可通過COX 途徑，抑制COX-2的表達[33]。與SLC6A4 結(jié)合較好的成分包括喹諾酮堿和吲哚類生物堿，雖然網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿與SLC6A4 的關(guān)系，本課題組發(fā)現(xiàn)升高吳茱萸湯中吳茱萸堿的含量能有效增加腦干5-HT 含量并改善偏頭痛[34]，推測其發(fā)揮治療作用的成分有可能與其代謝產(chǎn)物有關(guān)。與TRPV1 結(jié)合的成分主要是吲哚類生物堿，其中吳茱萸堿能有效抑制TRPV1 的激活[35]，具有明顯的抑制神經(jīng)病理性疼痛的作用[36]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析中，人參中含量較大的皂苷類成分與關(guān)鍵靶點的作用較少，吳茱萸湯臨床應(yīng)用中人參用量比例較大（10～15 g）[37]，表明人參在吳茱萸湯治療疾病過程中發(fā)揮了重要的作用，大量研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷具有抑制COX-2 等炎癥因子表達的作用[38]，但是皂苷類成分具有腸道內(nèi)難以吸收、生物利用度低、腸內(nèi)滯留時間較長的特點，經(jīng)腸道菌群代謝后可產(chǎn)生大量的去糖基化代謝產(chǎn)物[39]，這些代謝物具有多種藥理作用，如抗炎、抗糖尿病、抗過敏以及神經(jīng)保護等[40]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸湯中人參皂苷Rb1的含量與治療偏頭痛療效呈正相關(guān)，與腦干中的分布呈負相關(guān)，因此推測人參中原型成分的作用靶點可能在腦外及腸道。這也提示網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究基于可吸收成分進行，對分析中藥難吸收的成分可能發(fā)揮的作用存在一定的局限性。

綜上所述，通過動物實驗和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究分析，發(fā)現(xiàn)吳茱萸湯治療偏頭痛可能是通過多種成分，作用于PTGS2、SLC6A4、TRPV1 等靶點，抑制神經(jīng)源性炎癥并調(diào)節(jié)5-HT 能信號通路實現(xiàn)的，表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能較好地體現(xiàn)中藥治療疾病的特色，也為未來中醫(yī)藥研究提供了方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突