房正華，馬寶林，宋湖平，代景偉，孫曉歐

1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，福建 廈門 361022

2.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，福建 廈門 361022

3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，江蘇 蘇州 215000

顱腦外傷是指由外力造成的腦組織損傷，屬于神經(jīng)外科常見多發(fā)病，其發(fā)病率和致殘率位居各種創(chuàng)傷性損傷之首，給社會和家庭造成沉重負(fù)擔(dān)。顱腦外傷包括原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷，外力機(jī)械性沖擊瞬間引起原發(fā)性腦損傷，機(jī)體啟動一系列生化過程，進(jìn)一步損傷腦組織，導(dǎo)致“損傷-炎癥-損傷”的惡性循環(huán)，涉及炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等多個分子機(jī)制和信號通路[1]。因此，研究顱腦損傷發(fā)病機(jī)制及治療方法對于改善患者預(yù)后及提高生存率具有重要意義。

淫羊藿是我國傳統(tǒng)中藥材，其主要活性成分為淫羊藿苷，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁、抗骨質(zhì)疏松等活性[2-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿苷可維持神經(jīng)元細(xì)胞的正常形態(tài)和功能，促進(jìn)神經(jīng)突出生長，減輕神經(jīng)元損傷，在阿爾茨海默癥、抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中發(fā)揮重要作用[5-6]。微小RNA（microRNA，miRNA）參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程，在腦損傷炎癥過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[7]。淫羊藿苷可通過調(diào)節(jié)miRNA 在軟骨損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，但其在顱腦損傷中是否可通過調(diào)節(jié)miRNA 發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用值得進(jìn)一步研究[8]。miR-233-3p是miRNA 家族成員之一，與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程[9]。目前尚未見miR-233-3p參與顱腦損傷后引起的炎癥及神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程的相關(guān)報道。本研究通過建立顱腦外傷大鼠模型，探討淫羊藿苷是否通過miR-233-3p對顱腦外傷引起的神經(jīng)損傷發(fā)揮保護(hù)作用，為臨床治療顱腦外傷提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠85只，7周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號SCXK（滬）2017-0005。動物于溫度24～26 ℃、相對濕度55%～70%、光照12 h 明/暗交替的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食飲水。動物實驗經(jīng)廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核通過（批準(zhǔn)號XΜULL20190061）。

1.2 細(xì)胞

人皮質(zhì)神經(jīng)元購自美國ATCC。

1.3 藥品與試劑

淫羊藿苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號171123）購自南京澤郎生物科技有限公司；miR-223-3p拮抗劑（miR-223-3p antagomir）及其陰性對照（NC）由廣州銳博生物科技有限公司合成；miR-223-3p擬似物（miR-223-3p mimic）、miR-223-3p抑制劑（miR-223-3p inhibitor）及其NC 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；TUNEL 試劑盒（批號GS008）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）ELISA 試劑盒（批號ab213909）、IL-1β ELISA 試劑盒（批號ab235646）、兔抗大鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）單抗（批號ab264468）、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）單抗（批號ab238972）、B 淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）多抗（批號ab194583）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）單抗（批號ab182733）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號ab6721）購自英國Abcam公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號GΜ-040502A）購自美國Genomeditech 公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 儀器

腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；InfiniteF50 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；RΜ2050石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司）；qRT-PCR 分析系統(tǒng)（美國ABI 公司）；Μini-Protean4 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模與分組

隨機(jī)選取70 只大鼠，ip 1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，俯臥固定。選擇顱頂外力打擊位置，對該部位備皮消毒，沿矢狀正中線無菌切開頭皮，采用改良Feeney 方法[10]，使用40 g 擊錘從25 cm高處自由落下，撞擊控制桿，經(jīng)骨窗直接打擊大鼠腦部，造成局部腦挫裂傷，碘伏消毒，縫合包扎傷口。撞擊后大鼠出現(xiàn)數(shù)秒鐘呼吸暫停、四肢抽搐，且麻醉消失后未出現(xiàn)癱瘓，視為造模成功。剔除撞擊過程中死亡大鼠，另取大鼠補充造模，最終造模成功大鼠60 只，隨機(jī)分為模型組、淫羊藿苷（30 mg/kg）組、淫羊藿苷（30 mg/kg）＋NC 組和淫羊藿苷（30 mg/kg）＋miR-223-3p antagomir組，每組15 只。另取15 只大鼠，切開頭皮，但不撞擊，其余操作同造模大鼠，設(shè)為對照組。

2.2 給藥

2.2.1miR-223-3p antagomir及其NC給藥方式 大鼠麻醉后，消毒頭皮，固定于腦立體定位儀，根據(jù)腦立體定向圖譜顱腦中線縱向切口，前囟前方約1.0 mm、右側(cè)約1.5 mm 處鉆孔，深度約2.5 mm，使用微量注射器將5 μLmiR-223-3p antagomir或其NC（1 nmol/L）注入側(cè)腦室，5 min 內(nèi)注射完畢，留針10 min 后拔出。骨蠟封孔，縫合切口。

2.2.2 給藥 淫羊藿苷溶于雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液。造模前7 d 至造模后3 d 各給藥組大鼠ig 淫羊藿苷，對照組和模型組ig 雙蒸水，1 次/d。淫羊藿苷組造模后30 min 側(cè)icv 0.9%氯化鈉溶液；淫羊藿苷＋NC 組造模后30 min 側(cè)icvmiR-223-3p antagomirNC；淫羊藿苷＋miR-223-3pantagomir組造模后 30 min 側(cè) icvmiR-223-3p antagomir；對照組和模型組ig 造模后30 min 側(cè)icv 0.9%氯化鈉溶液。

2.3 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity scores，mNSS）的影響

末次給藥2 h 后，按照mNSS 評分標(biāo)準(zhǔn)[11]評價各組大鼠神經(jīng)功能，觀察大鼠運動（包括肌肉狀態(tài)及異常動作）、感覺（包括視覺、觸覺、深感覺及平衡覺）和反射狀態(tài)。mNSS 評分為0～18 分，神經(jīng)功能正常為0 分；分值越高，表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

2.4 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織含水量的影響

mNSS 評分結(jié)束后，各組隨機(jī)選取5 只大鼠，麻醉后處死，斷頭取腦，取骨窗邊緣挫裂傷灶中心腦組織約200 mg，電子天平稱定濕質(zhì)量，放入干燥箱中，110 ℃干燥24 h，稱定干質(zhì)量，計算腦組織含水量。

含水量＝(濕質(zhì)量－干質(zhì)量)/干質(zhì)量

2.5 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織IL-18 和IL-1β 水平的影響

取腦組織100 mg，按1∶10 比例加入0.9%氯化鈉溶液，制備10%腦組織勻漿，10 000 r/min 離心15 min，收集上清，按照ELISA 試劑盒說明書檢測腦組織勻漿中IL-18 和IL-1β 水平。

2.6 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織病理變化的影響

各組隨機(jī)選取5 只大鼠，麻醉大鼠，開胸暴露心臟，進(jìn)行左心室-升主動脈灌注，先用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌注，至右心耳流出液體變清澈時，改用4%多聚甲醛灌注，大鼠表現(xiàn)四肢僵硬時停止灌注，斷頭取腦，以挫裂傷灶為中心，冠狀取材（0.5 cm厚腦組織），于4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，二甲苯透明，制作石蠟切片（厚4 μm），蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)組織病理變化。

2.7 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的影響

取腦組織切片，常規(guī)脫蠟、水化，雙蒸水沖洗，加入蛋白酶K 于37 ℃孵育30 min，以PBS 溶液沖洗；加入TUNEL 反應(yīng)液于37 ℃反應(yīng)60 min，以PBS 溶液沖洗；加入Counter-AP 于37 ℃孵育30 min，以PBS 溶液沖洗；加入BCIP/NBT 于37 ℃顯色，自來水沖洗；加入FastRed 于37 ℃顯色，晾干后封片，于顯微鏡下取5 個互不重疊視野，觀察棕褐色TUNEL 陽性細(xì)胞，計算凋亡率。

凋亡率＝TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)

2.8 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織miR-223-3p和NLRP3 mRNA 表達(dá)的影響

處死各組剩余大鼠，斷頭取腦，取挫裂傷灶中心腦皮質(zhì)70 mg，按照試劑盒說明書提取總RNA 并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 分析。將U6作為miR-223-3p內(nèi)參，將β-actin作為NLRP3內(nèi)參。引物序列：miR-223-3p上游引物5’-ACGTAGCTAGCGCCATGGTC-3’，下游引物5’-CATCGGCTAGCGATGCATCG-3’；U6上游引物5’-AGGCTAGCGCATCGCGATGC-3’，下游引物5’-ATTAGCCCAGCTAGCGCCGA-3’；NLRP3上游引物5’-CGATCGGACATCGATAGAT-3’，下游引物5’-TCGATCAGCGATGCACATG-3’；β-actin上游引物5’-ATCCGATCGAGCAGATCACGT-3’，下游引物5’-TCAGGACTGACGCATGCATCG-3’。

2.9 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響

取挫裂傷灶中心腦皮質(zhì)70 mg，冰上研磨勻漿，加入裂解液，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白煮沸變性，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h；加入NLRP3 抗體（1∶1000）、Caspase-1 抗體（1∶500）、Bcl-2 抗體（1∶500）、Bax 抗體（1∶800）和β-actin 抗體（1∶800），4 ℃孵育過夜，TBST 溶液洗滌；加入HRP 標(biāo)記的IgG抗體（1∶2000），室溫孵育1 h，TBST 溶液洗滌，加入ECL 發(fā)光液顯色，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.10 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-223-3p 靶基因

運用TargetScan 等軟件在線預(yù)測miR-223-3p與NLRP3互補序列，將NLRP3 的3’-UTR 序列插入報告載體中，構(gòu)建野生型NLRP3 wt和突變型NLRP3 mut，使用LipofectamineTΜ2000，分別將miR-223-3p mimic、miR-223-3p inhibitor及NC 與NLRP3 wt、NLRP3 mut共轉(zhuǎn)染至人皮質(zhì)神經(jīng)元，使用試劑盒測定熒光值。

2.11 統(tǒng)計學(xué)方法

分析數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠mNSS 的影響

如圖1所示，與模型組比較，淫羊藿苷組大鼠mNSS 顯著降低（P＜0.05）；與淫羊藿苷組、淫羊藿苷＋NC 組比較，淫羊藿苷＋miR-223-3p antagomir組大鼠mNSS 顯著升高（P＜0.05）。

圖1 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠mNSS 的影響 (±s,n=12)Fig.1 Effect of icariin on mNSS of rats with craniocerebral trauma (±s,n=12)

3.2 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織含水量的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組腦組織含水量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組腦組織含水量顯著降低（P＜0.05）；與淫羊藿苷組、淫羊藿苷＋NC 組比較，淫羊藿苷＋miR-223-3p antagomir組腦組織含水量顯著升高（P＜0.05）。

圖2 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織含水量的影響(±s,n=5)Fig.2 Effect of icariin on brain water content of rats with craniocerebral trauma (±s,n=5)

3.3 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織IL-18 和IL-1β 水平的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組腦組織IL-18 和IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組腦組織IL-18 和IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）；與淫羊藿苷組、淫羊藿苷＋NC組比較，淫羊藿苷＋miR-223-3p antagomir組腦組織IL-18 和IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）。

表1 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織IL-18 和IL-1β 水平的影響 (±s,n=5)Table 1 Effect of icariin on IL-18 and IL-1β levels in brain tissue of rats with craniocerebral trauma (±s,n=5)

表1 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織IL-18 和IL-1β 水平的影響 (±s,n=5)Table 1 Effect of icariin on IL-18 and IL-1β levels in brain tissue of rats with craniocerebral trauma (±s,n=5)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與淫羊藿苷組比較：△P＜0.05；與淫羊藿苷＋NC 組比較：■P＜0.05*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs model group;△P ＜0.05 vs icariin group;■P ＜0.05 vs icariin+NC group

組別 劑量/(mg·kg-1) IL-18/(pg·mL-1) IL-1β/(pg·mL-1)對照 — 65.26±15.12 112.58±20.15模型 — 512.36±26.36* 735.84±32.56*淫羊藿苷 30 259.47±21.15# 326.87±26.81#淫羊藿苷＋NC 30 263.48±23.58 345.12±23.45淫羊藿苷＋miR-223-3p antagomir 30 405.91±25.49△■ 568.48±31.72△■

3.4 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織病理變化的影響

如圖3所示，對照組大鼠大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，未見損傷灶；模型組可見明顯損傷灶，神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生空泡化，細(xì)胞減少，結(jié)構(gòu)松散，紅細(xì)胞聚集；淫羊藿苷組和淫羊藿苷＋NC組損傷面積、神經(jīng)元空泡化及紅細(xì)胞數(shù)較模型組均減少；淫羊藿苷＋miR-223-3p antagomir組損傷灶較損傷組有所減小，但效果不及淫羊藿苷組和淫羊藿苷＋NC 組，仍可見空泡化細(xì)胞，紅細(xì)胞聚集。

圖3 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織病理變化的影響 (HE,×400)Fig.3 Effect of icariin on pathological changes of brain tissue of rats with craniocerebral trauma (HE,× 400)

3.5 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與淫羊藿苷組、淫羊藿苷＋NC 組比較，淫羊藿苷＋miR-223-3p antagomir組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著升高（P＜0.05）。

圖4 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的影響Fig.4 Effect of icariin on neuronal apoptosis of brain tissue of rats with craniocerebral trauma

3.6 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織miR-223-3p和NLRP3 mRNA 表達(dá)的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組腦組織miR-233-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），NLRP3mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組腦組織miR-233-3pmRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），NLRP3mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與淫羊藿苷組、淫羊藿苷＋NC 組比較，淫羊藿苷＋miR-223-3p antagomir組腦組織miR-233-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），NLRP3mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

圖5 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織 miR-223-3p 和NLRP3 mRNA 表達(dá)的影響 (±s,n=5)Fig.5 Effect of icariin on miR-223-3p and NLRP3 mRNA expressions in brain tissue of rats with craniocerebral trauma (±s,n=5)

3.7 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組腦組織NLRP3、Bax 和Caspase-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組腦組織NLRP3、Bax和Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組、淫羊藿苷＋NC 組比較，淫羊藿苷＋miR-223-3p antagomir組腦組織NLRP3、Bax 和Caspase-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖6 淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響 (±s,n=5)Fig.6 Effect of icariin on NLRP3,Bcl-2,Bax,Caspase-1 protein expressions in brain tissue of rats with craniocerebral trauma (±s,n=5)

3.8 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-233-3p 對NLRP3 的靶向性

如圖7所示，轉(zhuǎn)染miR-233-3p mimic后，NLRP3 wt相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miR-233-3p inhibitor后，NLRP3 wt相對熒光素酶活性顯著升高（P＜0.05）。

圖7 miR-233-3p 靶向調(diào)控NLRP3Fig.7 miR-233-3p target and regulate NLRP3

4 討論

本研究成功建立顱腦外傷大鼠模型，損傷部位準(zhǔn)確一致，與臨床腦組織局部創(chuàng)傷發(fā)生機(jī)制相似，能夠反映顱腦損傷相關(guān)生理病理機(jī)制。顱腦損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、自由基損傷以及神經(jīng)毒性均在損傷過程中發(fā)揮重要作用，其中炎性反應(yīng)在繼發(fā)性損傷中至關(guān)重要[12]。顱腦損傷后即引起局部炎性反應(yīng)，造成局部神經(jīng)組織變性壞死、血腦屏障破壞、神經(jīng)毒性增加等，加重患者病情，因此抑制炎性反應(yīng)引起的壞死性凋亡是治療顱腦損傷的重要環(huán)節(jié)[13]。

腦水腫和細(xì)胞凋亡是顱腦外傷主要病理表現(xiàn)，外力損傷腦部后導(dǎo)致腦水腫，引起血腦屏障通透性增加，產(chǎn)生大量自由基，不僅加重水腫癥狀，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，同時還可導(dǎo)致神經(jīng)興奮性增加，損傷神經(jīng)元細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，引起神經(jīng)缺損癥狀[14]。通過藥物抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)、防治神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、減少繼發(fā)性腦損傷，可有效改善患者預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷具有明顯的抗炎作用，注射淫羊藿苷可減輕豬牙周炎局部炎性反應(yīng)，促進(jìn)牙周組織再生[15]。淫羊藿苷在皮瓣缺血再灌注損傷動物模型中也具有明顯的抗炎作用，可提高皮瓣存活率，減輕皮瓣再損傷[16]。此外，淫羊藿苷還具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，可抑制帕金森小鼠中促炎因子產(chǎn)生，減輕神經(jīng)毒性[17]。IL-18、IL-1β 在腦損傷炎癥中發(fā)揮重要作用，抑制二者水平可明顯減輕缺血性腦卒中炎性反應(yīng)，改善神經(jīng)缺陷[18]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，淫羊藿苷組大鼠mNSS 降低，腦組織含水量降低，腦組織IL-18 和IL-1β 水平降低，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率降低，腦組織病理學(xué)改善明顯，提示淫羊藿苷可減輕顱腦外傷大鼠炎性反應(yīng)，改善繼發(fā)性腦損傷，還可抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

miRNA 是高度保守的小分子RNA，參與調(diào)控多種基因表達(dá)，其表達(dá)水平與組織、細(xì)胞的病理生理過程有關(guān)，其異常表達(dá)反映機(jī)體病理狀態(tài)，可作為疾病治療靶點。miR-223是一種重要miRNA，可通過多種途徑調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，在肺炎、結(jié)腸炎等炎癥性疾病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[19-20]。miR-223-3p在幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎中異常表達(dá)，誘導(dǎo)促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展[21]。腦損傷后，NLRP3 炎癥小體激活，Caspase-1 表達(dá)增加，促使IL-18、IL-1β 等促炎因子成熟和分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為抑凋亡基因Bcl-2 表達(dá)降低，促凋亡基因Bax 表達(dá)升高[22]。miR-223-3p可靶向調(diào)控NLRP3，減輕炎性反應(yīng)，減少神經(jīng)元細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[23]。淫羊藿苷可抑制NLRP3 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減輕骨關(guān)節(jié)炎癥狀[24]。本研究結(jié)果顯示，模型組腦組織miR-223-3pmRNA 表達(dá)水平低于對照組，而淫羊藿苷組miR-223-3pmRNA 表達(dá)水平升高，提示淫羊藿苷可能對miR-223-3p表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。為驗證淫羊藿苷是否通過miR-223-3p發(fā)揮作用，大鼠ig 淫羊藿苷同時注射miR-223-3p antagomir，發(fā)現(xiàn)miR-223-3pmRNA 表達(dá)水平低于淫羊藿苷組，表明淫羊藿苷可調(diào)節(jié)顱腦外傷大鼠腦組織miR-223-3p表達(dá)；NLRP3mRNA 表達(dá)與miR-223-3pmRNA 表達(dá)趨勢相反，雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，miR-223-3p可直接靶向調(diào)節(jié)NLRP3 表達(dá)；抑制miR-223-3p表達(dá)后，與淫羊藿苷組比較，淫羊藿苷＋antagomir組腦組織NLRP3、Bax 和Caspase-1 蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低，提示淫羊藿苷通過上調(diào)miR-223-3p表達(dá)，靶向抑制NLRP3 炎癥小體功能，從而抑制下游Caspase-1 蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

綜上所述，淫羊藿苷對顱腦外傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能通過調(diào)控miR-223-3p表達(dá)、抑制其靶蛋白NLRP3 表達(dá)、減輕炎性反應(yīng)、減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突