江穎倩，彭夢(mèng)超，吳建國(guó)，吳巖斌，吳錦忠

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

金線蓮是福建特色中草藥，來(lái)源于蘭科金線蘭屬植物金線蘭Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.的全草，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕、解毒等功效[1-2]。金線蓮多糖為金線蓮中主要的活性成分，含量占金線蓮藥材生藥量的10%左右[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金線蓮多糖具有保肝、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等活性[4-7]。長(zhǎng)片金線蘭A.longilobusH.Jiang et H.Z.Tian 也是金線蘭屬植物，其植物形態(tài)和金線蘭、臺(tái)灣銀線蘭A.formosanusHayata 等金線蘭屬植物較為相似[8-9]，本課題組在前期金線蓮野生資源調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)片金線蘭在云南等地一直被當(dāng)作金線蓮使用。目前關(guān)于長(zhǎng)片金線蘭多糖的結(jié)構(gòu)特征和藥理活性尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在分析長(zhǎng)片金線蘭多糖的結(jié)構(gòu)特征并探討長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用，以期為金線蓮藥用新資源的發(fā)掘提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性ICR 小鼠48 只，5 周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。動(dòng)物于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，晝夜循環(huán)正常，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用規(guī)定，符合3R 原則。

1.2 藥材

長(zhǎng)片金線蘭購(gòu)自福建漳州，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳巖斌副研究員鑒定為蘭科金線蘭屬植物長(zhǎng)片金線蘭A.longilobusH.Jiang et H.Z.Tian 的全草。

1.3 藥品與試劑

苯酚（批號(hào)T20100331）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸（TFA，批號(hào)L1401046）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PΜP，批號(hào)i1902099）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；醋酸銨（批號(hào)20170420）購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)D0806AS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；鼠李糖對(duì)照品（批號(hào)14102217，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自士鋒生物科技有限公司；木糖對(duì)照品（批號(hào)111508-200404，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品葡萄糖醛酸（批號(hào)K14J7S9017）、半乳糖醛酸（批號(hào)S29J8I40844）、半乳糖（批號(hào)Z20O7H23186）、阿拉伯糖（批號(hào)Z29O7H23894）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；聯(lián)苯雙酯滴丸（批號(hào)170706）購(gòu)自北京協(xié)和藥廠；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào) 20190905）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190903）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190812）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190829）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190912）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190820）、丙二醛（malondialdehyde，ΜDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190912）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；色譜級(jí)乙腈購(gòu)自德國(guó)Μerck 公司；其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；DAWN HELEOS II 型18 角度激光光散射儀（美國(guó)Wyatt公司）；RI-101 型示差檢測(cè)器（日本Shodex 公司）；UV-1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu 公司）；Nicolet is5 傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；1260 高效液相色譜儀（HPLC，美國(guó)Agilent 公司）；DΜ4000 B LED 生物顯微鏡、RΜ2125 型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）。

2 方法

2.1 長(zhǎng)片金線蘭多糖的制備

長(zhǎng)片金線蘭全草干燥至恒定質(zhì)量，粉碎后加入30 倍量80%乙醇回流提取2 h，藥渣加入15 倍量蒸餾水，90 ℃提取3 次，2 h/次；合并水提液，濾過(guò)，濾液濃縮至一定體積，加入無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，4 ℃靜置12 h，離心，棄去上清液，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌后以蒸餾水溶解，透析，冷凍干燥，備用。

2.2 長(zhǎng)片金線蘭多糖中總糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[10]測(cè)定長(zhǎng)片金線蘭多糖中總糖的含量，以葡萄糖為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取葡萄糖對(duì)照品10 mg 于100 mL 量瓶中，加蒸餾水定容，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的溶液，即得對(duì)照品溶液。精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 對(duì)照品溶液，加蒸餾水補(bǔ)足1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，混合搖勻，再精密加入5 mL 硫酸，搖勻，沸水浴加熱20 min，取出，至冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，測(cè)定490 nm處的吸光度（A）值，以A為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 樣品含量測(cè)定 精密稱取長(zhǎng)片金線蘭多糖5 mg 于100 mL 量瓶中，加蒸餾水定容，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)目下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測(cè)定A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出供試品的無(wú)水葡萄糖的量，計(jì)算，即得。

2.3 長(zhǎng)片金線蘭多糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)報(bào)道方法[11]，采用凝膠排阻色譜聯(lián)用多角度激光光散射和示差折光儀法（SEC-ΜALLSRI）測(cè)定長(zhǎng)片金線蘭多糖的相對(duì)分子質(zhì)量。取長(zhǎng)片金線蘭多糖5 mg，用流動(dòng)相配制成終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 的供試品溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)，備用。色譜條件：TSK Gel G5000 PWXL 色譜柱（300 mm×7.5 mm，10 μm）串聯(lián)TSK Gel G3000 PWXL色譜柱（300 mm×7.5 mm，6 μm）；流動(dòng)相為0.1 mol/L NaCl 溶液；色譜柱柱溫為35 ℃；體積流量為0.35 mL/min；進(jìn)樣量為1 mL；采用Astra 6.1 軟件采集及處理數(shù)據(jù)。

2.4 單糖組成分析

2.4.1 單糖混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖各5 mg，分別加水定容至2 mL。精密量取各對(duì)照品溶液200 μL，混勻，即得混合單糖對(duì)照品溶液。

2.4.2 多糖水解和衍生化產(chǎn)物的制備 精密稱取長(zhǎng)片金線蘭多糖10 mg 于具塞試管中，加入1 mL 蒸餾水溶解，再加入1 mL 3 mol/L 三氟乙酸，混勻，封口后于110 ℃水解2 h；冷卻至室溫，用3 mol/L NaOH 溶液中和至pH 7.0，蒸餾水定容至5 mL，得到長(zhǎng)片金線蘭多糖水解液。精密吸取混合單糖對(duì)照品溶液和長(zhǎng)片金線蘭多糖水解液各200 μL，分別加入0.3 mol/L NaOH 溶液200 μL、0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PΜP）甲醇溶液200 μL，于70 ℃水浴反應(yīng)100 min；取出后冷卻至室溫，加入200 μL 0.3 mol/L HCl 溶液中和，再加入200 μL 蒸餾水，混合均勻后，加入1 mL 氯仿渦旋萃取3 次，收集水層溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)，用于HPLC 分析，并繪制各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算單糖含量。

2.4.3 色譜條件 參照文獻(xiàn)報(bào)道的色譜條件[12]，采用Inertsil ODS-SP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1 mol/L 醋酸銨溶液（B），梯度洗脫：0～20 min，17%～19% A；20～60 min，19% A；二極管陣列檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；柱溫為30 ℃；體積流量為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。

2.4.4 光譜分析

（1）紫外光譜分析：取多糖樣品5 mg 于100 mL量瓶中，加水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的多糖溶液，以蒸餾水為空白對(duì)照，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～400 nm 處進(jìn)行光譜掃描。

（2）紅外光譜分析：稱取多糖樣品1～2 mg，與100 mg 干燥溴化鉀粉末研磨壓片，采用紅外光譜儀在4000～400 cm-1處掃描。

2.5 長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)肝損傷小鼠的保護(hù)作用

2.5.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯（150 mg/kg）組以及長(zhǎng)片金線蘭多糖低、中、高劑量（100、200、400 mg/kg）[4]組，每組8 只。各給藥組ig 相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig 等體積0.9%氯化鈉溶液，1 次/d，連續(xù)9 d。

2.5.2 血清生化指標(biāo)的測(cè)定 末次給藥后2 h，除對(duì)照組外，其余各組ip 0.125% CCl4花生油溶液（10 mL/kg）致小鼠急性肝損傷。禁食不禁水16 h，眼球取血，3000 r/min 離心10 min，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組小鼠血清中ALT、AST 及LDH活性。

2.5.3 肝臟組織中生化指標(biāo)的測(cè)定 小鼠脫頸椎處死，迅速摘除肝臟，取部分肝臟組織于研磨器中，加入0.9%氯化鈉溶液，在冰浴中研磨，制備成10%肝組織勻漿，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組小鼠肝臟組織SOD、CAT 活性和GSH、ΜDA 含量。

2.5.4 肝組織病理學(xué)檢查 取肝臟部分左葉于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色后，于顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理變化。

2.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 長(zhǎng)片金線蘭多糖中總糖的含量

以A值為縱坐標(biāo)（Y），葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程Y＝4.507 9X＋0.159 6，R2＝0.999 5，線性范圍為0.01～0.10 mg/mL，測(cè)得長(zhǎng)片金線蘭多糖中總糖含量為88.79%。

3.2 長(zhǎng)片金線蘭多糖的相對(duì)分子質(zhì)量

長(zhǎng)片金線蘭多糖SEC-ΜALLS-RI 圖譜見(jiàn)圖1，采用ΜALLS 和RI 檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定，通過(guò)計(jì)算可以直接得到樣品中每個(gè)點(diǎn)的絕對(duì)分子質(zhì)量，通過(guò)Astra 6.1 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，得到多糖重均相對(duì)分子質(zhì)量為4.254×105，多分散系數(shù)為2.61。

圖1 長(zhǎng)片金線蘭多糖SEC-MALLS-RI 色譜圖Fig.1 SEC-MALLS-RI chromatograms of polysaccharides from A.longilobus

3.3 長(zhǎng)片金線蘭多糖的單糖組成特征

長(zhǎng)片金線蘭多糖的單糖組成及混合單糖對(duì)照品的HPLC 圖譜見(jiàn)圖2。長(zhǎng)片金線蘭多糖為雜多糖，主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖7 種單糖組成，其物質(zhì)的量比為甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖＝1∶0.11∶0.19∶11.15∶0.87∶0.36∶0.18，其中以葡萄糖量最高，其次為甘露糖和半乳糖。

圖2 單糖對(duì)照品 (A) 和長(zhǎng)片金線蘭多糖水解產(chǎn)物 (B)PMP 衍生物的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC of PMP derivatives of monosaccharide reference (A) and hydrolysis products of polysaccharides from A.longilobus (B)

3.4 長(zhǎng)片金線蘭多糖紫外和紅外光譜分析

如圖3所示，長(zhǎng)片金線蘭多糖在紫外光區(qū)200～400 nm，A值呈下降趨勢(shì)。長(zhǎng)片金線蘭多糖在260、280 nm 波長(zhǎng)處無(wú)明顯特征吸收峰，可見(jiàn)長(zhǎng)片金線蘭多糖中基本不含蛋白質(zhì)和核酸，與金線蘭多糖的紫外光譜特征相似[4]。

圖3 長(zhǎng)片金線蘭多糖紫外光譜圖Fig.3 UV spectrum of polysaccharides from A.longilobus

如圖4所示，長(zhǎng)片金線蘭多糖在4000～400 cm-1具有多糖類物質(zhì)的一般特征峰，其中3420、2924 cm-1分別為O-H 和C-H 吸收振動(dòng)峰[4,13]；1624 cm-1處的吸收峰可能是多糖樣品中少量的束縛水引起的吸收[4,13]；1407、1250 cm-1處的吸收峰是由C-H 鍵的振動(dòng)引起的；1144、1092、1036 cm-1為吡喃糖特征吸收峰[13]，892 cm-1為α-糖苷鍵的吸收峰[4]。

圖4 長(zhǎng)片金線蘭多糖紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of polysaccharides from A.longilobus

3.5 長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和LDH 活性的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 和LDH 活性均顯著升高（P＜0.01），表明CCl4致小鼠急性肝損傷模型成功建立；與模型組比較，長(zhǎng)片金線蘭多糖各劑量組小鼠血清中ALT、AST 和LDH 活性均顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖5 長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和LDH 活性的影響 (±s,n=8)Fig.5 Effect of polysaccharides from A.longilobus on ALT,AST and LDH activities in serum of mice with liver injury(±s,n=8)

3.6 長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)肝損傷小鼠肝臟組織中SOD、CAT 活性和GSH、MDA 含量的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組肝臟組織SOD、CAT 活性及GSH 含量顯著降低（P＜0.01），ΜDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，長(zhǎng)片金線蘭多糖各劑量組肝組織中SOD、CAT 活性和GSH 含量顯著升高（P＜0.05、0.01），ΜDA 含量顯著降低（P＜0.01）。

圖6 長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)肝損傷小鼠肝臟組織中SOD、CAT 活性和GSH、MDA 含量的影響 (±s,n=8)Fig.6 Effect of polysaccharides from A.longilobus on SOD,CAT activities and GSH,MDA content in liver of mice with liver injury (±s,n=8)

3.7 長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)肝損傷小鼠肝臟組織病理變化的影響

如圖7所示，對(duì)照組小鼠肝板排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈圓形，核居中，無(wú)壞死、變性和炎性浸潤(rùn)等現(xiàn)象；模型組肝索排列紊亂，細(xì)胞腫脹變形，胞質(zhì)空亮，肝組織可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、部分細(xì)胞核固縮、消失；與模型組比較，長(zhǎng)片金線蘭多糖各劑量組上述病理變化得到不同程度地改善，肝細(xì)胞腫脹變形、壞死程度明顯減輕，表明長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)CCl4致急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用。

圖7 長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)肝損傷小鼠肝臟組織病理變化的影響Fig.7 Effect of polysaccharides from A.longilobus on pathological changes of liver in mice with liver injury mice

4 討論

CCl4誘導(dǎo)的肝損傷動(dòng)物模型已經(jīng)廣泛用于保肝藥物的篩選[14-16]。本研究首次探究了長(zhǎng)片金線蘭多糖對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。研究表明，CCl4主要通過(guò)其自由基代謝物引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。血清ALT、AST 和LDH活性是評(píng)價(jià)肝功能損傷常用的標(biāo)志物，血清中ALT、AST 和LDH 活性明顯升高，提示肝細(xì)胞破壞、細(xì)胞膜通透性增加、線粒體損傷[17-18]。SOD 和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠清除機(jī)體產(chǎn)生的自由基，抑制體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的進(jìn)程[19]。GSH 是一種非酶抗氧化劑，在抵御活性氧引起的細(xì)胞損傷方面具有重要的作用，GSH 耗竭可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，引起肝細(xì)胞損傷[20]。ΜDA 是肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的主要代謝產(chǎn)物之一，其水平可以反映肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激的程度[17]。

本研究分析長(zhǎng)片金線蘭多糖結(jié)構(gòu)特征并探討其抗肝損傷活性，結(jié)果顯示，長(zhǎng)片金線蘭多糖相對(duì)分子質(zhì)量為4.254×105，為主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖等單糖組成的雜多糖。長(zhǎng)片金線蘭多糖能夠降低肝損傷小鼠血清中AST、ALT 和LDH 活性，提高肝組織中SOD、CAT 活性和GSH 含量，降低肝組織中ΜDA 含量，表明長(zhǎng)片金線蘭多糖能夠有效改善CCl4致急性肝損傷小鼠的肝功能，提高細(xì)胞清除自由基的能力，減輕細(xì)胞膜在自由基等攻擊下的氧化損傷程度。

綜上所述，長(zhǎng)片金線蘭多糖和金線蘭多糖均具有保肝作用，而且長(zhǎng)片金線蘭多糖的主要單糖組成和金線蘭多糖的單糖組成相同，但是長(zhǎng)片金線蘭多糖和金線蘭多糖的糖苷鍵類型及連接順序、高級(jí)構(gòu)象等結(jié)構(gòu)特征是否相同還尚不清楚。此外，關(guān)于長(zhǎng)片金線蘭其他類型的化學(xué)成分研究報(bào)道較少，是否與金線蘭中的化學(xué)成分相似還有待進(jìn)一步的研究。因此，長(zhǎng)片金線蘭能否作為金線蘭的替代品，作為金線蓮使用，尚有待于進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突