江穎倩，彭夢超，吳建國，吳巖斌，吳錦忠

福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122

金線蓮是福建特色中草藥，來源于蘭科金線蘭屬植物金線蘭Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.的全草，具有清熱涼血、祛風利濕、解毒等功效[1-2]。金線蓮多糖為金線蓮中主要的活性成分，含量占金線蓮藥材生藥量的10%左右[3]。現(xiàn)代藥理學研究表明，金線蓮多糖具有保肝、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗類風濕性關節(jié)炎等活性[4-7]。長片金線蘭A.longilobusH.Jiang et H.Z.Tian 也是金線蘭屬植物，其植物形態(tài)和金線蘭、臺灣銀線蘭A.formosanusHayata 等金線蘭屬植物較為相似[8-9]，本課題組在前期金線蓮野生資源調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)長片金線蘭在云南等地一直被當作金線蓮使用。目前關于長片金線蘭多糖的結構特征和藥理活性尚未見報道，本研究旨在分析長片金線蘭多糖的結構特征并探討長片金線蘭多糖對四氯化碳（CCl4）誘導的急性肝損傷小鼠的保護作用，以期為金線蓮藥用新資源的發(fā)掘提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性ICR 小鼠48 只，5 周齡，體質量18～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號SCXK（滬）2017-0005。動物于福建中醫(yī)藥大學藥學院適應性飼養(yǎng)1 周，溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%，晝夜循環(huán)正常，自由進食飲水。動物實驗遵循福建中醫(yī)藥大學藥學院實驗動物管理和使用規(guī)定，符合3R 原則。

1.2 藥材

長片金線蘭購自福建漳州，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院吳巖斌副研究員鑒定為蘭科金線蘭屬植物長片金線蘭A.longilobusH.Jiang et H.Z.Tian 的全草。

1.3 藥品與試劑

苯酚（批號T20100331）購自國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸（TFA，批號L1401046）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PΜP，批號i1902099）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；醋酸銨（批號20170420）購自天津市致遠化學試劑有限公司；葡萄糖對照品（批號D0806AS，質量分數(shù)＞98%）購自大連美侖生物技術有限公司；鼠李糖對照品（批號14102217，質量分數(shù)＞98%）購自士鋒生物科技有限公司；木糖對照品（批號111508-200404，質量分數(shù)＞98%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品葡萄糖醛酸（批號K14J7S9017）、半乳糖醛酸（批號S29J8I40844）、半乳糖（批號Z20O7H23186）、阿拉伯糖（批號Z29O7H23894）購自上海源葉生物科技有限公司，質量分數(shù)均大于98%；聯(lián)苯雙酯滴丸（批號170706）購自北京協(xié)和藥廠；丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒（批號 20190905）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒（批號20190903）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（批號20190812）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（批號20190829）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號20190912）、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒（批號20190820）、丙二醛（malondialdehyde，ΜDA）檢測試劑盒（批號20190912）購自南京建成生物工程研究所；色譜級乙腈購自德國Μerck 公司；其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；DAWN HELEOS II 型18 角度激光光散射儀（美國Wyatt公司）；RI-101 型示差檢測器（日本Shodex 公司）；UV-1800 紫外可見分光光度計（日本Shimadzu 公司）；Nicolet is5 傅里葉紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；1260 高效液相色譜儀（HPLC，美國Agilent 公司）；DΜ4000 B LED 生物顯微鏡、RΜ2125 型石蠟切片機（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 長片金線蘭多糖的制備

長片金線蘭全草干燥至恒定質量，粉碎后加入30 倍量80%乙醇回流提取2 h，藥渣加入15 倍量蒸餾水，90 ℃提取3 次，2 h/次；合并水提液，濾過，濾液濃縮至一定體積，加入無水乙醇至乙醇質量分數(shù)達到80%，4 ℃靜置12 h，離心，棄去上清液，沉淀用無水乙醇洗滌后以蒸餾水溶解，透析，冷凍干燥，備用。

2.2 長片金線蘭多糖中總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[10]測定長片金線蘭多糖中總糖的含量，以葡萄糖為對照品繪制標準曲線。

2.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取葡萄糖對照品10 mg 于100 mL 量瓶中，加蒸餾水定容，得到質量濃度為100 μg/mL 的溶液，即得對照品溶液。精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 對照品溶液，加蒸餾水補足1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，混合搖勻，再精密加入5 mL 硫酸，搖勻，沸水浴加熱20 min，取出，至冰浴中冷卻5 min，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，測定490 nm處的吸光度（A）值，以A為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。

2.2.2 樣品含量測定 精密稱取長片金線蘭多糖5 mg 于100 mL 量瓶中，加蒸餾水定容，照標準曲線制備項目下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測定A值，根據(jù)標準曲線得出供試品的無水葡萄糖的量，計算，即得。

2.3 長片金線蘭多糖相對分子質量的測定

參照文獻報道方法[11]，采用凝膠排阻色譜聯(lián)用多角度激光光散射和示差折光儀法（SEC-ΜALLSRI）測定長片金線蘭多糖的相對分子質量。取長片金線蘭多糖5 mg，用流動相配制成終質量濃度為2.5 mg/mL 的供試品溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，備用。色譜條件：TSK Gel G5000 PWXL 色譜柱（300 mm×7.5 mm，10 μm）串聯(lián)TSK Gel G3000 PWXL色譜柱（300 mm×7.5 mm，6 μm）；流動相為0.1 mol/L NaCl 溶液；色譜柱柱溫為35 ℃；體積流量為0.35 mL/min；進樣量為1 mL；采用Astra 6.1 軟件采集及處理數(shù)據(jù)。

2.4 單糖組成分析

2.4.1 單糖混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖各5 mg，分別加水定容至2 mL。精密量取各對照品溶液200 μL，混勻，即得混合單糖對照品溶液。

2.4.2 多糖水解和衍生化產(chǎn)物的制備 精密稱取長片金線蘭多糖10 mg 于具塞試管中，加入1 mL 蒸餾水溶解，再加入1 mL 3 mol/L 三氟乙酸，混勻，封口后于110 ℃水解2 h；冷卻至室溫，用3 mol/L NaOH 溶液中和至pH 7.0，蒸餾水定容至5 mL，得到長片金線蘭多糖水解液。精密吸取混合單糖對照品溶液和長片金線蘭多糖水解液各200 μL，分別加入0.3 mol/L NaOH 溶液200 μL、0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PΜP）甲醇溶液200 μL，于70 ℃水浴反應100 min；取出后冷卻至室溫，加入200 μL 0.3 mol/L HCl 溶液中和，再加入200 μL 蒸餾水，混合均勻后，加入1 mL 氯仿渦旋萃取3 次，收集水層溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，用于HPLC 分析，并繪制各單糖的標準曲線方程，計算單糖含量。

2.4.3 色譜條件 參照文獻報道的色譜條件[12]，采用Inertsil ODS-SP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈（A）-0.1 mol/L 醋酸銨溶液（B），梯度洗脫：0～20 min，17%～19% A；20～60 min，19% A；二極管陣列檢測器（DAD）檢測器；檢測波長為250 nm；柱溫為30 ℃；體積流量為1 mL/min；進樣量為20 μL。

2.4.4 光譜分析

（1）紫外光譜分析：取多糖樣品5 mg 于100 mL量瓶中，加水溶解，配制成質量濃度為0.5 mg/mL的多糖溶液，以蒸餾水為空白對照，采用紫外可見分光光度計在波長200～400 nm 處進行光譜掃描。

（2）紅外光譜分析：稱取多糖樣品1～2 mg，與100 mg 干燥溴化鉀粉末研磨壓片，采用紅外光譜儀在4000～400 cm-1處掃描。

2.5 長片金線蘭多糖對肝損傷小鼠的保護作用

2.5.1 動物分組、造模與給藥 小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯（150 mg/kg）組以及長片金線蘭多糖低、中、高劑量（100、200、400 mg/kg）[4]組，每組8 只。各給藥組ig 相應藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig 等體積0.9%氯化鈉溶液，1 次/d，連續(xù)9 d。

2.5.2 血清生化指標的測定 末次給藥后2 h，除對照組外，其余各組ip 0.125% CCl4花生油溶液（10 mL/kg）致小鼠急性肝損傷。禁食不禁水16 h，眼球取血，3000 r/min 離心10 min，分離血清，按試劑盒說明書測定各組小鼠血清中ALT、AST 及LDH活性。

2.5.3 肝臟組織中生化指標的測定 小鼠脫頸椎處死，迅速摘除肝臟，取部分肝臟組織于研磨器中，加入0.9%氯化鈉溶液，在冰浴中研磨，制備成10%肝組織勻漿，按試劑盒說明書測定各組小鼠肝臟組織SOD、CAT 活性和GSH、ΜDA 含量。

2.5.4 肝組織病理學檢查 取肝臟部分左葉于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色后，于顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理變化。

2.5.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 長片金線蘭多糖中總糖的含量

以A值為縱坐標（Y），葡萄糖濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得到回歸方程Y＝4.507 9X＋0.159 6，R2＝0.999 5，線性范圍為0.01～0.10 mg/mL，測得長片金線蘭多糖中總糖含量為88.79%。

3.2 長片金線蘭多糖的相對分子質量

長片金線蘭多糖SEC-ΜALLS-RI 圖譜見圖1，采用ΜALLS 和RI 檢測器同時測定，通過計算可以直接得到樣品中每個點的絕對分子質量，通過Astra 6.1 軟件對結果進行處理，得到多糖重均相對分子質量為4.254×105，多分散系數(shù)為2.61。

圖1 長片金線蘭多糖SEC-MALLS-RI 色譜圖Fig.1 SEC-MALLS-RI chromatograms of polysaccharides from A.longilobus

3.3 長片金線蘭多糖的單糖組成特征

長片金線蘭多糖的單糖組成及混合單糖對照品的HPLC 圖譜見圖2。長片金線蘭多糖為雜多糖，主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖7 種單糖組成，其物質的量比為甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖＝1∶0.11∶0.19∶11.15∶0.87∶0.36∶0.18，其中以葡萄糖量最高，其次為甘露糖和半乳糖。

圖2 單糖對照品 (A) 和長片金線蘭多糖水解產(chǎn)物 (B)PMP 衍生物的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC of PMP derivatives of monosaccharide reference (A) and hydrolysis products of polysaccharides from A.longilobus (B)

3.4 長片金線蘭多糖紫外和紅外光譜分析

如圖3所示，長片金線蘭多糖在紫外光區(qū)200～400 nm，A值呈下降趨勢。長片金線蘭多糖在260、280 nm 波長處無明顯特征吸收峰，可見長片金線蘭多糖中基本不含蛋白質和核酸，與金線蘭多糖的紫外光譜特征相似[4]。

圖3 長片金線蘭多糖紫外光譜圖Fig.3 UV spectrum of polysaccharides from A.longilobus

如圖4所示，長片金線蘭多糖在4000～400 cm-1具有多糖類物質的一般特征峰，其中3420、2924 cm-1分別為O-H 和C-H 吸收振動峰[4,13]；1624 cm-1處的吸收峰可能是多糖樣品中少量的束縛水引起的吸收[4,13]；1407、1250 cm-1處的吸收峰是由C-H 鍵的振動引起的；1144、1092、1036 cm-1為吡喃糖特征吸收峰[13]，892 cm-1為α-糖苷鍵的吸收峰[4]。

圖4 長片金線蘭多糖紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of polysaccharides from A.longilobus

3.5 長片金線蘭多糖對肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和LDH 活性的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 和LDH 活性均顯著升高（P＜0.01），表明CCl4致小鼠急性肝損傷模型成功建立；與模型組比較，長片金線蘭多糖各劑量組小鼠血清中ALT、AST 和LDH 活性均顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖5 長片金線蘭多糖對肝損傷小鼠血清中ALT、AST 和LDH 活性的影響 (±s,n=8)Fig.5 Effect of polysaccharides from A.longilobus on ALT,AST and LDH activities in serum of mice with liver injury(±s,n=8)

3.6 長片金線蘭多糖對肝損傷小鼠肝臟組織中SOD、CAT 活性和GSH、MDA 含量的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組肝臟組織SOD、CAT 活性及GSH 含量顯著降低（P＜0.01），ΜDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，長片金線蘭多糖各劑量組肝組織中SOD、CAT 活性和GSH 含量顯著升高（P＜0.05、0.01），ΜDA 含量顯著降低（P＜0.01）。

圖6 長片金線蘭多糖對肝損傷小鼠肝臟組織中SOD、CAT 活性和GSH、MDA 含量的影響 (±s,n=8)Fig.6 Effect of polysaccharides from A.longilobus on SOD,CAT activities and GSH,MDA content in liver of mice with liver injury (±s,n=8)

3.7 長片金線蘭多糖對肝損傷小鼠肝臟組織病理變化的影響

如圖7所示，對照組小鼠肝板排列整齊，結構完整，肝細胞呈圓形，核居中，無壞死、變性和炎性浸潤等現(xiàn)象；模型組肝索排列紊亂，細胞腫脹變形，胞質空亮，肝組織可見炎性細胞浸潤、部分細胞核固縮、消失；與模型組比較，長片金線蘭多糖各劑量組上述病理變化得到不同程度地改善，肝細胞腫脹變形、壞死程度明顯減輕，表明長片金線蘭多糖對CCl4致急性肝損傷有明顯的保護作用。

圖7 長片金線蘭多糖對肝損傷小鼠肝臟組織病理變化的影響Fig.7 Effect of polysaccharides from A.longilobus on pathological changes of liver in mice with liver injury mice

4 討論

CCl4誘導的肝損傷動物模型已經(jīng)廣泛用于保肝藥物的篩選[14-16]。本研究首次探究了長片金線蘭多糖對CCl4致急性肝損傷小鼠的保護作用。研究表明，CCl4主要通過其自由基代謝物引起的氧化應激反應而導致肝細胞損傷。血清ALT、AST 和LDH活性是評價肝功能損傷常用的標志物，血清中ALT、AST 和LDH 活性明顯升高，提示肝細胞破壞、細胞膜通透性增加、線粒體損傷[17-18]。SOD 和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠清除機體產(chǎn)生的自由基，抑制體內(nèi)脂質過氧化的進程[19]。GSH 是一種非酶抗氧化劑，在抵御活性氧引起的細胞損傷方面具有重要的作用，GSH 耗竭可導致脂質過氧化，引起肝細胞損傷[20]。ΜDA 是肝細胞脂質過氧化的主要代謝產(chǎn)物之一，其水平可以反映肝細胞脂質過氧化和氧化應激的程度[17]。

本研究分析長片金線蘭多糖結構特征并探討其抗肝損傷活性，結果顯示，長片金線蘭多糖相對分子質量為4.254×105，為主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖等單糖組成的雜多糖。長片金線蘭多糖能夠降低肝損傷小鼠血清中AST、ALT 和LDH 活性，提高肝組織中SOD、CAT 活性和GSH 含量，降低肝組織中ΜDA 含量，表明長片金線蘭多糖能夠有效改善CCl4致急性肝損傷小鼠的肝功能，提高細胞清除自由基的能力，減輕細胞膜在自由基等攻擊下的氧化損傷程度。

綜上所述，長片金線蘭多糖和金線蘭多糖均具有保肝作用，而且長片金線蘭多糖的主要單糖組成和金線蘭多糖的單糖組成相同，但是長片金線蘭多糖和金線蘭多糖的糖苷鍵類型及連接順序、高級構象等結構特征是否相同還尚不清楚。此外，關于長片金線蘭其他類型的化學成分研究報道較少，是否與金線蘭中的化學成分相似還有待進一步的研究。因此，長片金線蘭能否作為金線蘭的替代品，作為金線蓮使用，尚有待于進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突