莊金龍，劉 莉，鐘淵福，隋艷波，林庚海，胡桂華，許惠蓮*

1.廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院，福建 漳州 363000

2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040

心力衰竭是由于任何心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或泵血功能受損的一種復(fù)雜臨床綜合征，是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段，已成為21世紀(jì)我國乃至全球重要的公共衛(wèi)生問題[1]。研究表明，神經(jīng)內(nèi)分泌介導(dǎo)的心肌重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的病理生理機制，而心肌細胞凋亡是其重要的病理基礎(chǔ)[2]。近20年來，盡管心力衰竭的治療策略已從過去“強心、利尿、擴血管”以改善血流動力學(xué)狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿缃褚浴耙种粕窠?jīng)內(nèi)分泌異常激活”為主的長期、修復(fù)性治療，但心力衰竭患者的再住院率和死亡率仍居高不下且預(yù)后差，因此現(xiàn)階段心力衰竭的治療迫切需要尋找新靶點及新思路。

中藥治療心力衰竭歷史悠久，大部分都是在古籍名方基礎(chǔ)上根據(jù)臨證經(jīng)驗化裁為各家經(jīng)驗方，臨床療效良好，但有自身的局限性，缺乏現(xiàn)代循證醫(yī)學(xué)證據(jù)和客觀實驗室評估指標(biāo)。盡管如此，由于中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多通路的特點，在治療心力衰竭方面具有單種化學(xué)藥無法比擬的優(yōu)勢，復(fù)方中成藥現(xiàn)已被《中國心力衰竭診斷和治療指南（2018）》推薦使用[1]，且國內(nèi)心血管病權(quán)威專家們制定了《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識》[3]、《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》[4]。但目前中藥復(fù)方治療心力衰竭的作用機制尚未完全清楚，大部分機制研究是從改善臨床癥狀、血流動力學(xué)及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等方面入手，缺乏從心力衰竭的病理生理機制上的深入研究。參芪利心湯是在中醫(yī)治療心力衰竭古籍名方“苓桂術(shù)甘湯、養(yǎng)心湯”基礎(chǔ)上加減，并加用活血、溫陽等藥物化裁而來，其前期的臨床及基礎(chǔ)研究表明，既可以改善心力衰竭患者的臨床癥狀、提高活動耐量、改善心功能指標(biāo)[5-6]，也可以改善阿霉素致心力衰竭大鼠的血流動力學(xué)并降低細胞炎性因子[7-8]，但其干預(yù)心力衰竭的作用機制尚不明確。本研究通過建立阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠模型，觀察參芪利心湯對心力衰竭大鼠的心肌結(jié)構(gòu)、心功能、心肌能量代謝、心肌細胞凋亡率、心肌細胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達的影響，旨在探討參芪利心湯干預(yù)心力衰竭的具體作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠105 只，6～7 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物合格證號SCXK（滬）2017-0005。動物分籠飼養(yǎng)于廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院動物實驗中心，自由進食飲水，光照12 h，溫度（22±3）℃、濕度（50±8）%。動物實驗經(jīng)廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號909DWLL201901）。

1.2 藥材

參芪利心湯由人參20 g、黃芪20 g、桂枝10 g、淫羊藿20 g、葶藶子15 g、丹參15 g、茯苓20 g、白術(shù)15 g、仙鶴草30 g、益母草15 g 和甘草10 g組方而成，以上飲片購自廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院門診中藥房，經(jīng)廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉慶春教授鑒定分別為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Μey.的干燥根和根莖、豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Ege.var.mongholicus(Ege.)Hsiao 的干燥根、樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥嫩枝、小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuΜaxim.的干燥葉、十字花科植物播娘嵩Descurainia sophia(L.) Webb.ex Prantl.的干燥成熟種子、唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖、多孔菌科真菌茯苓Faria cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核、菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖、薔薇科植物龍芽草Agrimonia pilosaLedeb.的干燥地上部分、唇形科植物益母草Leonurus japonicusHoutt.的干燥地上部分、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。

1.3 藥品與試劑

馬來酸依那普利片（10 mg/片，批號18010301）購自揚子江藥業(yè)集團江蘇制藥股份有限公司；注射用鹽酸多柔比星（10 mg/支，批號18033311）購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；蘇木素染液（批號20170035）、伊紅染液（批號20180017）購自北京益利精細化學(xué)品有限公司；N端 B 型利鈉肽（N-terminal B-type natriuretic peptide，NT-proBNP）ELISA 試劑盒（批號 ER0309）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）ELISA 試劑盒（批號ER1637）購自武漢菲恩生物科技有限公司；Annexin V-碘化丙啶（PI）試劑盒、Trizol 試劑盒、qRT-PCR 試劑盒、裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、ECL 超敏發(fā)光液（批號分別為 AV0120126、PR01259、LK-0103A、PWB-78503、PWB-563、PWB-020、PWB-03132）購自上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；PCR 引物由上海艾博思生物科技有限公司合成；PVDF 轉(zhuǎn)移膜（批號IPVH00010）購自美國Μillipore公司；X 光片顯影液及定影液購自美國Kodak 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號A0208）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體、重組Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、重組β-actin 抗體、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體、p53 抗體購自英國Abcam 公司。

1.4 儀器

IE33 型心臟彩色多普勒超聲儀（荷蘭Philips公司）；ΜDF-U53V 型醫(yī)用超低溫冰箱（日本三洋公司）；ST5020 型多功能染色封片一體機、RΜ2245型切片機、DW4-B 型生物顯微鏡（德國Leica 公司）；JEΜ-1220 型透射電鏡（TEΜ，日本Hitachi 公司）；TDZ4-WS 型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；BD FACSCalibur 流式細胞儀（美國BD Bioscience 公司）；ΜX3000P 型qRT-PCR 儀（美國Agilent 公司）；PowerPacTΜHC 電泳儀、170-3940 型半干轉(zhuǎn)印槽、XR＋凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；VE-180 型垂直電泳槽（中國天能科技公司）；XBT-1 型柯達醫(yī)用X 線膠片（美國Kodak 公司）；Gel-Pro analyzer 型分析軟件（美國Μedia Cybernetics 公司）。

2 方法

2.1 參芪利心湯的制備

取組方量人參、黃芪、淫羊藿、桂枝、葶藶子、丹參、茯苓、白術(shù)、仙鶴草、益母草和甘草飲片，加入10 倍量蒸餾水浸泡1 h，煎煮1 h，紗布濾過，濾渣再加8 倍量蒸餾水繼續(xù)煎煮1 h，濾過，合并2次濾液，分別濃縮成含生藥量0.998、1.995、3.990 g/mL 的溶液，經(jīng)高效液相色譜儀測定主要含黃芪甲苷278.21 μg/g、丹參酮IIA1.58 mg/g、淫羊藿苷326.32 μg/g[9]，分裝滅菌后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 心力衰竭大鼠模型的制備、分組與給藥

參考文獻方法[10-11]，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，采用隨機數(shù)字表法選取15 只作為對照組，其余大鼠按照前3 周3 mg/kg、后3 周2 mg/kg 的劑量ip 阿霉素溶液（0.8 mg/mL），對照組ip 等體積0.9%氯化鈉溶液，1 次/周，連續(xù)6 周；6 周后采用心臟彩色多普勒超聲儀檢測大鼠心功能指標(biāo)，左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜45%即表明心力衰竭大鼠模型制備成功。根據(jù)本課題組前期研究[7-8]，將造模成功的心力衰竭大鼠隨機分為模型組、依那普利（2.1 mg/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組以及參芪利心湯低、中、高劑量（9.975、19.950、39.900 g/kg，分別相當(dāng)于臨床1/2 倍劑量、等效劑量、2 倍劑量）組，每組16 只；各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig 等體積蒸餾水，1 次/d，連續(xù)4 周。每日觀察并記錄大鼠精神狀態(tài)、飲食量、活動度、尿量、糞便、毛發(fā)等一般情況及死亡情況。

2.3 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心功能的影響

給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，脫毛、稱定體質(zhì)量，ip 20%烏拉坦（1.5 g/kg）麻醉，仰臥固定、胸前脫毛后，采用心臟彩色多普勒超聲儀檢測大鼠 LVEF、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）及每搏心輸出量（stroke volume，SV），連續(xù)測定3 個心動周期，取平均值。

2.4 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌組織病理變化的影響

大鼠腹主動脈采血5 mL 于EDTA 抗凝管中，靜置1 h，3000 r/min 離心10 min，取血漿，于-20 ℃保存。采血后立即處死大鼠，剪開胸腔并快速取出心臟，以預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗血污，于冰上剪除心包膜、血管及心房組織等，留取左室心肌組織，濾紙拭干，快速剪取左室心尖部心肌組織，于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片（厚4 μm），每個標(biāo)本取4 張切片，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色、中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理變化并拍照。

2.5 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

取各組大鼠的左室心尖部心肌組織，于2.5%戊二醛溶液中固定，以預(yù)冷的PBS 溶液漂洗3 次，于1%鋨酸中固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后，每個標(biāo)本取5 張切片，于TEΜ 下觀察各組大鼠心肌細胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

2.6 參芪利心湯對心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP和心肌組織ATP 含量的影響

取“2.4”項下血漿，按ELISA 試劑盒說明書檢測各組大鼠血漿NT-proBNP 含量；取左室心肌組織，經(jīng)預(yù)冷裂解、研磨勻漿、離心，提取組織蛋白并制備組織勻漿，按照ELISA 試劑盒說明書檢測各組大鼠心肌組織ATP 含量。

2.7 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

取各組大鼠左室心尖部心肌組織，以預(yù)冷的PBS 溶液清洗殘留血污，用機械法制備單細胞懸液。將心肌組織放置于200 目不銹鋼網(wǎng)上，下置平皿，先用眼科剪將組織剪碎，輕柔搓洗組織，邊搓邊用預(yù)冷的PBS 溶液沖洗，逐漸將組織搓完，然后將平皿中的混懸液過300 目濾網(wǎng)去除細胞塊，收集細胞懸液；2000 r/min，離心5 min，棄上清，收集細胞；重懸于4 ℃預(yù)冷的PBS 溶液中，2000 r/min 離心5 min，洗滌細胞2 次，并調(diào)整細胞密度為1×105/mL。吸棄PBS 溶液后將細胞重懸于300 μL Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻，室溫避光孵育15 min；上機前5 min 再加入5 μL PI 染色，補加200 μL Binding Buffer，采用流式細胞儀檢測各組大鼠心肌細胞凋亡率。

2.8 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）mRNA 表達的影響

取各組大鼠左室心尖部心肌組織，按照試劑盒說明書提取組織總RNA 并合成 cDNA，進行qRT-PCR 分析，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

2.9 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 和p53 蛋白表達的影響

取各組大鼠左室心尖部心肌組織，加入500 μL預(yù)冷的裂解液，研磨、勻漿、冰上裂解、離心，提取組織蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶，37 ℃封閉1 h；分別加入重組Bcl-2 抗體、重組Bax 抗體、Caspase-3 抗體、p53 抗體（1∶2000）和重組β-actin抗體（1∶10 000），4 ℃孵育過夜，用TBST 洗滌4次，10 min/次；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（1∶2000），37 ℃孵育2 h，用TBST 洗滌4 次，10 min/次；加入ECL 超敏發(fā)光液，于暗室內(nèi)曝光、顯影、定影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并用Gel-Pro Analyzer 軟件進行分析。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，兩組間比較滿足正態(tài)分布及方差齊性的用LSD-t檢驗，不滿足正態(tài)分布及方差齊性的用秩和檢驗，多組間比較用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心功能的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS 和SV 均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，參芪利心湯中、高劑量組和依那普利組大鼠LVEF、LVFS 和SV 均顯著升高（P＜0.01）。

圖1 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心功能的影響 (±s,n=13)Fig.1 Effect of Shenqi Lixin Decoction on cardiac function in rats with heart failure (±s,n=13)

3.2 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌組織病理變化的影響

如圖2所示，對照組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)清楚，排列整齊、緊密，無變性、壞死，間質(zhì)無水腫及充血，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，嚴(yán)重腫脹，變性、壞死，肌纖維明顯腫脹、斷裂，間質(zhì)明顯水腫，伴炎性細胞浸潤。參芪利心湯低劑量組大鼠心肌細胞排列紊亂、疏松，部分腫脹、壞死，肌纖維腫脹，間質(zhì)水腫，少許炎性細胞浸潤。參芪利心湯中劑量組大鼠心肌細胞排列稍紊亂、無明顯水腫，肌纖維紊亂、結(jié)構(gòu)不清，間質(zhì)輕度水腫。依那普利組和參芪利心湯高劑量組大鼠心肌細胞排列相對較齊，細胞核增大、部分丟失，肌纖維輕度腫脹、未見斷裂，間質(zhì)稍水腫。

圖2 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌組織病理變化的影響(HE,×400)Fig.2 Effect of Shenqi Lixin Decoction on pathological changes of myocardial tissue in rats with heart failure(HE,× 400)

3.3 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖3所示，對照組大鼠心肌細胞線粒體雖大小不一，但結(jié)構(gòu)完整、無腫脹，內(nèi)嵴清晰，肌纖維排列整齊，明暗帶清楚；模型組大鼠心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)不完整、腫脹、溶解、可見空泡樣變，內(nèi)嵴溶解、斷裂，肌纖維水腫、嚴(yán)重溶解；參芪利心湯低劑量組大鼠心肌細胞線粒體部分腫脹、溶解、空泡樣變，內(nèi)嵴溶解，部分肌纖維溶解；參芪利心湯中劑量組大鼠心肌細胞線粒排列紊亂，部分腫脹、極少溶解，未見空泡，小部分內(nèi)嵴溶解，肌纖維部分溶解，較模型組減輕；參芪利心湯高劑量組和依那普利組大鼠心肌細胞線粒體部分腫脹，但結(jié)構(gòu)尚完整、未見溶解，與模型組比較，大部分內(nèi)嵴清晰、少溶解，肌纖維少溶解。

圖3 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響(×5000)Fig.3 Effect of Shenqi Lixin Decoction on cardiomyocyte ultrastructure in rats with heart failure (× 5000)

3.4 參芪利心湯對心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP和心肌組織ATP 含量的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血漿NT-proBNP 含量顯著升高，心肌組織ATP 含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，參芪利心湯中、高劑量組和依那普利組大鼠血漿NT-proBNP 含量顯著降低，心肌組織ATP 含量顯著升高（P＜0.01）。

圖4 參芪利心湯對心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP和心肌組織ATP含量的影響 (±s,n=13)Fig.4 Effect of Shenqi Lixin Decoction on NT-proBNP content in plasma and ATP content in myocardial tissue in rats with heart failure (±s,n=13)

3.5 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，參芪利心湯中、高劑量組和依那普利組大鼠心肌細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.01）。

3.6 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 和PGC-1α mRNA 表達的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織Bcl-2和PGC-1αmRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.01），Bax和Caspase-3mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，參芪利心湯中、高劑量組和依那普利組大鼠心肌組織Bcl-2和PGC-1αmRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01），Bax和Caspase-3mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.01）。

圖6 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 和PGC-1α mRNA 表達的影響 (±s,n=6)Fig.6 Effect of Shenqi Lixin Decoction on Bcl-2,Bax,Caspase-3 and PGC-1α mRNA expressions in myocardial tissues of rats with heart failure (±s,n=6)

3.7 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 和p53 蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），Bax、Caspase-3 和p53 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，參芪利心湯中、高劑量組和依那普利組大鼠心肌組織Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），Bax、Caspase-3 和p53 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），表明參芪利心湯可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白，抑制心肌細胞凋亡。

圖7 參芪利心湯對心力衰竭大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 和p53 蛋白表達的影響 (±s,n=6)Fig.7 Effect of Shenqi Lixin Decoction on Bcl-2,Bax,Caspase-3 and p53 protein expressions in myocardial tissues of rats with heart failure (±s,n=6)

4 討論

心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展機制一直是國內(nèi)外心血管領(lǐng)域的研究熱點。目前研究認為心力衰竭是一種慢性、自發(fā)進展性疾病，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)異常激活導(dǎo)致心肌重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的病理生理機制；而心肌細胞凋亡是其重要的病理基礎(chǔ)，是心肌細胞丟失的主要原因，在心力衰竭的發(fā)病進程中起重要作用[2]。因此有效地干預(yù)心肌細胞凋亡，可以減少心肌重構(gòu)、延緩心力衰竭進展，從而改善心力衰竭的泵功能[12]。本課題組前期的臨床試驗和動物實驗表明參芪利心湯是改善心功能及血流動力學(xué)的有效方劑[5-8]，為了進一步考察參芪利心湯改善心功能與心肌細胞凋亡的相關(guān)性，本研究檢測了各組大鼠的心功能超聲指標(biāo)、血漿NT-proBNP 含量、心肌細胞凋亡率和相關(guān)凋亡基因及蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡率、血漿NT-proBNP 含量顯著升高，心功能指標(biāo)顯著降低，表明心力衰竭進程中存在嚴(yán)重的心肌細胞凋亡，引起心肌細胞大量丟失，導(dǎo)致心肌收縮功能障礙，進而引起心功能下降，這一結(jié)果符合心力衰竭的病理生理改變；經(jīng)參芪利心湯干預(yù)后，大鼠心肌細胞凋亡率、血漿NT-proBNP 含量降低，心功能指標(biāo)升高，以中、高劑量組變化顯著，表明參芪利心湯可以有效抑制心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡并改善心功能，且呈劑量相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，參芪利心湯可以有效抑制心肌細胞凋亡、減少心肌細胞丟失、逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，從而改善心功能，與文獻報道基本相符[11]。同時本研究發(fā)現(xiàn)，依那普利為臨床上最常用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）類藥物，可以顯著減少心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡并改善心功能，與文獻報道相符[13]，參芪利心湯中、高劑量組大鼠心肌細胞凋亡率、血漿NT-proBNP 含量及心功能各指標(biāo)與依那普利組相比無顯著差異，表明中、高劑量參芪利心湯抑制心肌細胞凋亡、改善心功能的作用與依那普利相當(dāng)。

心臟是一個高動力、高耗能、高代謝的人體重要器官，需要大量的能量來維持其正常的生理功能及代謝需求，而線粒體是人體能量代謝的主要細胞器，心臟中含有豐富的線粒體，約占心肌細胞體積的40%～60%。ATP 是細胞各項生命活動所需的最直接能量來源，正常成人心臟中60%～80%能量來源于心肌細胞線粒體脂肪酸β 氧化產(chǎn)生的ATP。研究發(fā)現(xiàn)，衰竭心臟的線粒體脂肪酸β 氧化能力顯著下降，心力衰竭患者的心臟ATP 含量與正常人相比下降30%～40%[14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織ATP 含量顯著降低，經(jīng)參芪利心湯干預(yù)后大鼠心肌組織ATP 含量升高，以中、高劑量組變化顯著。PGC-1α 是促進線粒體生物合成、增強呼吸功能和能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在機體的各種能量代謝過程中發(fā)揮重要作用[15]。PGC-1α 主要通過調(diào)節(jié)心肌線粒體的耦聯(lián)呼吸、促進心肌ATP 產(chǎn)生，進而調(diào)節(jié)心臟的收縮功能[16]。心肌組織中PGC-1α 表達相對豐富，新生兒的心肌組織中PGC-1α 過表達，伴有線粒體的激活、糖酵解到脂肪酸β 氧化的代謝轉(zhuǎn)換[17]；心肌組織中PGC-1α的缺失則會使線粒體生物合成及能量代謝障礙，導(dǎo)致心功能下降、心力衰竭和猝死[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織PGC-1αmRNA 表達水平顯著降低，經(jīng)參芪利心湯干預(yù)后大鼠心肌組織PGC-1αmRNA 表達水平顯著升高。本研究結(jié)果表明，心力衰竭時心肌組織中PGC-1α 表達下降，引起ATP 含量降低，進而導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，難以維持正常心肌活動的能量需求，與文獻報道一致[14,18]；參芪利心湯可以顯著上調(diào)心力衰竭大鼠心肌組織中PGC-1αmRNA 表達，升高ATP 含量，從而改善心肌線粒體能量代謝、減少細胞凋亡、改善心功能。參芪利心湯的上述作用與其方中君藥人參、黃芪密不可分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參富含人參皂苷Rg1，可以上調(diào)心肌細胞PGC-1α 表達，提高心肌組織ATP 含量，改善心肌能量代謝[19]；黃芪富含黃芪多糖，可以調(diào)控心肌組織PGC-1α 表達，提高ATP 與二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、ATP 與一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AΜP）比值，增加能量供應(yīng)，減少心肌凋亡[20]。

心肌細胞凋亡是心力衰竭進程中的重要病理環(huán)節(jié)，是心力衰竭從代償走向失代償?shù)年P(guān)鍵轉(zhuǎn)折點，受多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控。心肌線粒體不僅是生物合成及能量代謝的工廠，更是心肌細胞凋亡的調(diào)控中心，主要受Bcl-2 蛋白家族的調(diào)控，包括抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl 和促凋亡蛋白如Bax、Bad，其中Bcl-2 和Bax 是Bcl-2 蛋白家族中的最重要成員，Bcl-2 與Bax 比值決定細胞的生存或死亡[21-22]?？沟蛲龅鞍譈cl-2 主要駐留在線粒體外膜，可保持線粒體的完整性，控制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開放，抑制細胞色素C 的釋放；促凋亡蛋白Bax則主要駐留在細胞質(zhì)中，可降低線粒體膜電位，引起外膜通透性增加，導(dǎo)致大量細胞色素C 及部分凋亡前體如凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）釋放到細胞質(zhì)中，而細胞色素C 激活A(yù)paf-1，并與Caspase-9 形成凋亡體，進一步激活Caspase-3和Caspase-7，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織Bcl-2mRNA及蛋白表達水平顯著降低，Bax、Caspase-3mRNA及蛋白表達水平顯著升高，心肌細胞凋亡率顯著升高；經(jīng)中、高劑量參芪利心湯干預(yù)后，大鼠心肌組織Bcl-2mRNA 及蛋白表達水平顯著升高，Bax、Caspase-3mRNA 及蛋白表達水平顯著降低，心肌細胞凋亡率顯著降低。p53 是促細胞凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，其表達產(chǎn)物為p53 蛋白，參與心肌細胞凋亡，誘導(dǎo)并加速心力衰竭的進展[24]。心肌細胞DNA 受損后，激活的p53 蛋白誘導(dǎo)Bax 轉(zhuǎn)錄、上調(diào)Bax 蛋白表達，同時誘導(dǎo)Noxa 和Puma 轉(zhuǎn)錄，Noxa、Puma競爭性地與Bcl-2 結(jié)合，下調(diào)Bcl-2 表達[25]，導(dǎo)致Bcl-2 與Bax 比值降低，從而啟動線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，加速心力衰竭發(fā)展[26]。p53 抑制劑能夠減輕過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，從而改善心功能[27]。此外，p53 蛋白可破壞心肌受損線粒體自噬降解的能力，導(dǎo)致心肌線粒體功能障礙，促進心力衰竭發(fā)展[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織p53 蛋白表達水平顯著升高，Bax、Caspase-3 蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低，同時心肌細胞凋亡率顯著升高，表明p53 介導(dǎo)線粒體凋亡途徑，促進心肌細胞凋亡，與文獻報道相符[25-26]；與模型組相比，經(jīng)中、高劑量參芪利心湯干預(yù)后，大鼠心肌組織p53 蛋白表達水平顯著降低，Bax、Caspase-3 蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高，同時心肌細胞凋亡率顯著降低，表明心力衰竭進程中存在線粒體凋亡途徑介導(dǎo)的心肌細胞凋亡，參芪利心湯可以雙向調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡相關(guān)基因的表達，既能上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 表達，又能下調(diào)促凋亡基因Bax、Caspase-3、p53 表達，從線粒體凋亡途徑上干預(yù)心肌細胞凋亡、減少心肌細胞丟失，從而逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)、改善心功能，這可能是其改善心力衰竭的作用機制之一。參芪利心湯的上述作用可能與其方中含有人參、黃芪、丹參、淫羊藿等藥材有關(guān)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，參芪利心湯主要含人參皂苷、黃芪甲苷、丹參酮酸及淫羊藿苷等成分，其中人參皂苷可以通過抑制心力衰竭大鼠心肌細胞Caspase-3 蛋白表達，減少細胞凋亡，降低血清腦鈉素水平，從而改善心功能[29]；黃芪甲苷能夠保護線粒體功能，降低細胞色素C 釋放，阻斷線粒體凋亡途徑，抑制心肌細胞凋亡[30-31]；丹參酮IIA可以抑制心肌細胞Bax、p53 蛋白表達，從而減少心肌細胞凋亡[32]；淫羊藿苷可以通過下調(diào)心肌組織p53 和Caspase-3 蛋白表達，從而抑制心肌細胞凋亡[33]。

綜上所述，參芪利心湯能夠改善心力衰竭大鼠的心肌結(jié)構(gòu)、心肌組織能量代謝及心功能，并減少心肌細胞凋亡，其作用機制可能與調(diào)控PGC-1α 和線粒體凋亡途徑相關(guān)基因及蛋白的表達有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突