李思穎，李佳川*，宋 琴，于 露，汪窩牛，王 優(yōu)

1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610072

近年來(lái)，隨著人口老齡化以及肥胖癥人群日益增多，我國(guó)糖尿病患者發(fā)病率不斷增加且伴有年輕化趨勢(shì)，以學(xué)習(xí)記憶能力下降和認(rèn)知功能損害為主的糖尿病認(rèn)知功能障礙（diabetic cognitive impairment，DCI）在糖尿病患者中普遍流行，特別是老年患者更為頻發(fā)，已經(jīng)嚴(yán)重影響到人類生命健康?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，DCI 的主要病理基礎(chǔ)為高血糖、高血脂、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受損、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、糖基化終末產(chǎn)物（advanced gycation end products，AGEs）生成增加、β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積、神經(jīng)元存活信號(hào)傳導(dǎo)通路障礙、膽堿能通路受損等[1-2]。從中醫(yī)角度看，糖尿病是由血糖水平升高等因素引起的絡(luò)脈損傷疾病，又稱糖絡(luò)病，其中血糖升高是因、絡(luò)脈損傷為果，一旦傷“絡(luò)”則并發(fā)癥叢生，若損傷腦絡(luò)則誘發(fā)認(rèn)知功能損傷，故防治以控糖為主，并全程重視絡(luò)脈調(diào)暢[3]。目前尚無(wú)治療DCI 的特效藥物，西醫(yī)治療DCI 主要以服用降血糖、改善IR 和抗阿爾茨海默癥藥物為主，但療效并不顯著，而中醫(yī)藥講究辨證施治、糖絡(luò)同治，其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的特征在糖尿病及其并發(fā)癥的防治中具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

本課題組前期對(duì)酒蒸黃連-石菖蒲組分配伍規(guī)律[4-5]及其防治DCI 相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究顯示[6-7]，酒蒸黃連-石菖蒲能夠顯著改善糖脂代謝紊亂、IR 和認(rèn)知功能損傷，且酒蒸黃連無(wú)論是降糖效果還是對(duì)糖脂代謝的調(diào)控作用均優(yōu)于黃連生品，該組方配伍是治療DCI 最好的用藥體現(xiàn)，既體現(xiàn)了中藥組分配伍現(xiàn)代研究新模式，又突顯中醫(yī)藥隨證炮制的用藥特色。目前對(duì)于酒蒸黃連-石菖蒲組分治療DCI 具體作用機(jī)制的相關(guān)研究甚少。因此，為進(jìn)一步揭示酒蒸黃連-石菖蒲組分配伍機(jī)制，本研究在文獻(xiàn)回顧基礎(chǔ)上，運(yùn)用現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法[8]，通過(guò)構(gòu)建“關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-核心通路”交互網(wǎng)絡(luò)，深入探討酒蒸黃連-石菖蒲防治DCI 的潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制，并進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，以期揭示酒蒸黃連-石菖蒲抗DCI 的作用機(jī)制，為指導(dǎo)中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)的認(rèn)知障礙臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wister 大鼠，7 周齡，體質(zhì)量270～300 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2015-030。動(dòng)物于西南民族大學(xué)藥學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，每12 小時(shí)晝夜間斷性照明。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)201810）。

1.2 藥材

黃連（批號(hào)161020）、石菖蒲（批號(hào)161101）購(gòu)自四川德仁堂中藥飲片有限公司，經(jīng)西南民族大學(xué)藥學(xué)院李佳川副教授鑒定分別為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖、天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

鹽酸二甲雙胍片（0.25 g/片，批號(hào)G0120160302）購(gòu)自北京中惠藥業(yè)有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批號(hào)5756）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；血糖測(cè)定試劑盒（批號(hào)1209091）購(gòu)自四川邁克科技有限責(zé)任公司；胰島素酶聯(lián)免疫分析測(cè)定試劑盒（批號(hào)201608）購(gòu)自美國(guó)R&D 公司；乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）試劑盒（批號(hào)20170513）、乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AchE）試劑盒（批號(hào)20170513）和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（choline acetyl transferase，ChAT）試劑盒（批號(hào)20170513）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；AchE 兔多克隆抗體（批號(hào) 17975-1-AP）、ChAT 兔多克隆抗體（批號(hào)24418-1-AP）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體（批號(hào) 16806-1-AP）、IL-6 抗體（批號(hào)21865-1-AP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（批號(hào)17590-1-AP）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；Aβ42兔多克隆抗體（批號(hào)ab68896）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，Akt）抗體（批號(hào)11054）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）抗體（批號(hào)11002）、GSK3β 抗體（批號(hào)40989）、Akt 抗體（批號(hào)21054）購(gòu)自美國(guó)SAB 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)bs0295G-HRP）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；磷酸化胰島素受體底物（phosphorylated insulin receptor substrate，p-IRS）抗體（批號(hào)2385S）、IRS 抗體（批號(hào)2382S）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗體（批號(hào)4228S）、PI3K 抗體（批號(hào)4292S）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)5174S）購(gòu)自美國(guó)CST 公司。

1.4 儀器

SN-3001 型酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司）；ChemiDoc 蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移裝置、Image Quant 300 型凝膠分析成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BA400 型數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2 方法

2.1 酒蒸黃連生物堿組分與石菖蒲揮發(fā)油組分的制備

稱取適量黃連藥材，加入20%黃酒浸潤(rùn)2 h，加熱蒸煮8 h，得到酒蒸黃連炮制藥材[9]；取炮制好的酒蒸黃連藥材，用75%乙醇回流提取3 次，1.5 h/次，合并提取液并旋蒸回收乙醇，用蒸餾水稀釋成含生藥量1 g/mL 的溶液，并用D-101 大孔樹(shù)脂分離純化，60 ℃減壓真空干燥，經(jīng)HPLC 檢測(cè)，得到總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.47%的酒蒸黃連生物堿組分[6]。

稱取適量干燥石菖蒲藥材，粉碎后過(guò)篩，加入10 倍量蒸餾水，采用水蒸氣蒸餾法加熱回流8 h，將收集到的揮發(fā)油組分用無(wú)水Na2SO4脫水，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-ΜS）對(duì)淺黃色揮發(fā)油組分進(jìn)行分析，得到提取率為1.67%的石菖蒲揮發(fā)油組分[6]。

根據(jù)本課題組前期研究[5]，得到酒蒸黃連-石菖蒲組分的最佳配比為酒蒸黃連總生物堿54.7 mg、石菖蒲揮發(fā)油4.17 mg（以原藥材計(jì)，酒蒸黃連0.835 g、石菖蒲2.5 g），即配比為0.33∶1。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 酒蒸黃連-石菖蒲活性成分及作用靶點(diǎn)的收集 在文獻(xiàn)資料和已有的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)上[10-11]，借助TCΜSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmspw.com/tcmsp.php）和TCΜ 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）對(duì)“黃連”“石菖蒲”所含化學(xué)成分進(jìn)行查詢，參考TCΜSP數(shù)據(jù)庫(kù)的最新使用指南，以口服生物利用度≥20%且類藥性≥0.10 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出黃連和石菖蒲的活性成分，并結(jié)合本課題組前期對(duì)酒蒸黃連生物堿各組分的HPLC 分析及石菖蒲揮發(fā)油組分的GC-ΜS分析結(jié)果[6]，對(duì)活性成分進(jìn)行補(bǔ)充。利用活性成分的CAS 號(hào)，在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索各成分的簡(jiǎn)化分子線性格式SΜILES，并保存。將活性成分的SΜILES 式輸入到 SwissTargetPrediction 平臺(tái)（http://www.swisstargetprediction.ch/），得到活性成分的作用靶點(diǎn)。

2.2.2 疾病靶點(diǎn)的獲取 以“糖尿病腦病”“糖尿病認(rèn)知功能障礙”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）中檢索與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，并對(duì)所得靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，得到DCI 的疾病靶點(diǎn)。

2.2.3 藥物與疾病共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)上傳至Venny 2.1 平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，取二者的交集，即為藥物與疾病的共有靶點(diǎn)。為了更好地說(shuō)明藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系及核心作用靶點(diǎn)的挖掘，將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），獲取蛋白互作信息，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。

2.2.4 富集分析 為了闡明各活性成分的作用靶點(diǎn)在信號(hào)通路中的作用以及明確藥物的作用機(jī)制，利用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)藥物與疾病的共有靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，從富集結(jié)果中選取P＜0.05 的通路，并采用 OmicShare Tools 在線平臺(tái)（https://www.omicshare.com/tools/）和FunRich 3.1.3軟件將富集結(jié)果可視化，進(jìn)而預(yù)測(cè)酒蒸黃連-石菖蒲治療DCI 可能的作用機(jī)制。

2.2.5 “藥物-關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物活性成分及作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)；利用Cytoscape 3.8.1 軟件中的Μerge 工具將“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)與PPI 網(wǎng)絡(luò)合并，得到“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算度值、中心介度和緊密度的中位數(shù)，選取同時(shí)大于等于這3 個(gè)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，進(jìn)一步構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”核心網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，將KEGG 富集結(jié)果中P值較顯著的關(guān)鍵信號(hào)通路映射到“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”核心網(wǎng)絡(luò)中，得到“藥物-關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.3.1 DCI 模型的建立[6]、分組與給藥 隨機(jī)選取10 只大鼠作為對(duì)照組，其余大鼠禁食18 h，于次日ip STZ 溶液（40 mg/kg），對(duì)照組ip 等體積0.1 mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，72 h 后檢測(cè)造模組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），將FBG≥11.1 mmol/L 的造模大鼠按血糖及體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、二甲雙胍（250 mg/kg）組和酒蒸黃連-石菖蒲高、低劑量（180、80 mg/kg）組，每組10 只。二甲雙胍溶于蒸餾水配制為2.5%的溶液，酒蒸黃連-石菖蒲組分溶于蒸餾水分別配制成質(zhì)量濃度為18、8 mg/mL 的溶液，各給藥組ig 相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組ig 等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)24 周。稱取豬油、膽固醇、豬膽酸鈉和蔗糖（2∶1∶0.05∶2），采用嚴(yán)平等[12]方法制成高脂高糖乳液。實(shí)驗(yàn)期間除對(duì)照組外，其余各組大鼠連續(xù)24 周喂食高脂高糖乳液（10 mL/kg），且從第20 周開(kāi)始，連續(xù)4 周scD-半乳糖（50 mg/kg）[6]。

2.3.2 各組大鼠FBG 及血清胰島素的測(cè)定 分別于給藥前以及給藥后第24 周，大鼠禁食不禁水8 h，給予藥物1 h 后，尾尖取血，測(cè)定給藥前后FBG，計(jì)算末次給藥前后的血糖變化率。

大鼠ip 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，股動(dòng)脈取血，分離血清，測(cè)定大鼠血清胰島素（insulin，Ins）含量，并根據(jù)末次給藥后FBG 和Ins 值計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model of insulin resistance，HOΜA-IR）和胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，IAI）。

2.3.3 各組大鼠海馬組織Aβ42、AchE 和ChAT 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 大鼠處死后迅速取海馬組織，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗，拭干表面水分，于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。取部分海馬組織，于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫水后，采用免疫組織化學(xué)SABC 染色法進(jìn)一步處理[13]，于顯微鏡下觀察Aβ42、AchE 和ChAT 蛋白表達(dá)情況。陽(yáng)性表達(dá)為淺黃或棕黃色，一般在胞質(zhì)、細(xì)胞膜或細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)顯色，陰性表達(dá)則為藍(lán)色。

2.3.4 各組大鼠海馬組織Ach 含量以及AchE、ChAT 活性的檢測(cè) 取各組大鼠海馬組織，加入預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液勻漿，3000 r/min 離心10 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定海馬組織Ach 含量以及AchE、ChAT 活性。

2.3.5 各組大鼠海馬組織p-IRS、IRS、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β、IL-1β、IL-6和TNF-α 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取各組大鼠海馬組織，按照文獻(xiàn)方法[14]測(cè)定大鼠海馬組織中與糖代謝主要途徑相關(guān)的IRS、PI3K、Akt、GSK3β 的蛋白表達(dá)及磷酸化水平，同時(shí)測(cè)定與炎性反應(yīng)相關(guān)的IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)情況。

2.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)采用單因數(shù)方差分析進(jìn)行組間比較。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果

3.1.1 藥物活性成分的篩選及作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 共得到21 種活性成分，其中酒蒸黃連16 種、石菖蒲5 種。通過(guò)SwissTargetPrediction 平臺(tái)對(duì)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，去重篩選后共獲得525 個(gè)作用靶點(diǎn)。

3.1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與DCI 疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，計(jì)算相關(guān)性分?jǐn)?shù)的中位數(shù)為4.55，故選取相關(guān)性分?jǐn)?shù)≥4.55 的靶點(diǎn)，去重后得到3034 個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

3.1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物作用靶點(diǎn)和DCI 靶點(diǎn)取交集，得到藥物與疾病共有靶點(diǎn)303 個(gè)，提示這303個(gè)共有靶點(diǎn)可能是酒蒸黃連-石菖蒲治療DCI的候選靶點(diǎn)。PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖1所示，節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)大小代表度值大小，每條邊代表蛋白互作關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)圖顯示各個(gè)靶點(diǎn)間的關(guān)系密切，表明藥物治療疾病的作用機(jī)制復(fù)雜多樣，是多個(gè)靶點(diǎn)之間的協(xié)同作用，并非靠單一靶點(diǎn)來(lái)防治疾病。借助Cytoscape 3.8.1 軟件的ΜCODE 功能進(jìn)行聚類分析，得到5 個(gè)聚類網(wǎng)絡(luò)，其中紅色聚類網(wǎng)絡(luò)分值最高，提示它可能是該網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)的聚類。

圖1 藥物和疾病交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.1 PPI network of drug and disease intersection targets

3.1.4 候選靶點(diǎn)通路分析 對(duì)303 個(gè)候選靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析，得到P＜0.05 的信號(hào)通路共179條，主要涉及神經(jīng)、血管、炎癥、氧化應(yīng)激、胰島素分泌、糖脂代謝等方面。選擇富集結(jié)果中P值較為顯著的20 條通路進(jìn)行展示（圖2），其中與DCI疾病進(jìn)程密切相關(guān)的通路主要為AGE-AGE 受體（receptor of AGE，RAGE）信號(hào)通路、胰島素抵抗、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、2 型糖尿病、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，ΜAPK）信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、阿爾茨海默癥、膽堿能通路、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、胰高血糖素信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、胰島素分泌和膽固醇代謝。

圖2 KEGG 通路富集分析 (前20)Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis (top 20)

3.1.5 “藥物-關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 網(wǎng)絡(luò)中常用度值作為衡量節(jié)點(diǎn)重要性的關(guān)鍵指標(biāo)，節(jié)點(diǎn)度值越大、連接的化合物或靶點(diǎn)越多，表明該節(jié)點(diǎn)越重要，則其代表的化合物或靶點(diǎn)越有可能在藥物治療疾病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用?！八幬?關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)如圖3所示，包含234 個(gè)節(jié)點(diǎn)、2924 條邊，其中高于度值中位數(shù)的活性成分有16 個(gè)，排序靠前的成分為小檗堿、黃連堿、小檗浸堿、巴馬汀、表小檗堿、非洲防己堿、藥根堿和β-細(xì)辛醚，且在TCΜSP 查詢中，這幾種成分的血腦屏障透過(guò)率均大于0，良好的血腦屏障透過(guò)率為其提供了治療腦部疾病的可能性，其中血腦屏障透過(guò)率最高的成分是β-細(xì)辛醚，與石菖蒲開(kāi)竅醒腦的功效吻合，提示以上成分可能在酒蒸黃連-石菖蒲治療DCI 過(guò)程中發(fā)揮重要作用。高于度值中位數(shù)的靶點(diǎn)有84 個(gè)，結(jié)合PPI 聚類網(wǎng)絡(luò)，提示AKT1、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARG）、INSR、胰島素樣生長(zhǎng)因子1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGFIR）、GSK3B、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、微管相關(guān)蛋白 tau（microtubule-associated protein tau，ΜAPT）、TNF、前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、ACHE 等靶點(diǎn)可能是酒蒸黃連-石菖蒲防治DCI 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)主要參與機(jī)體的糖脂代謝、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、血管病變、神經(jīng)元細(xì)胞調(diào)控、AGEs 增生、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)及IR等過(guò)程，與糖尿病及其認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。與藥物關(guān)鍵成分、潛在靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)程度較高的通路為PI3K-Akt 信號(hào)通路、胰島素抵抗及胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)途徑、AGE-RAGE 信號(hào)通路、TNF 炎癥通路、膽堿能通路。在預(yù)測(cè)的潛在靶點(diǎn)中，與PI3K-Akt 信號(hào)通路密切相關(guān)的是AKT1 和GSK3B，與胰島素抵抗及胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)途徑密切相關(guān)的是AKT1、GSK3B、INSR 和IGFIR，與AGE-RAGE 信號(hào)通路密切相關(guān)的是GSK3B、APP 和ΜAPT，與TNF 炎癥通路相關(guān)的是TNF 和PTGS2，與膽堿能通路密切相關(guān)的是ACHE，提示上述靶點(diǎn)和通路可能是酒蒸黃連-石菖蒲組分抗DCI的潛在作用靶點(diǎn)和核心途徑?！八幬?關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)揭示了多個(gè)靶點(diǎn)可以對(duì)應(yīng)同一種成分，一個(gè)靶點(diǎn)也可以對(duì)應(yīng)多種不同的成分，且藥物作用靶點(diǎn)分布于多條信號(hào)通路中，表明酒蒸黃連-石菖蒲組分中多個(gè)成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)并通過(guò)多條通路協(xié)同發(fā)揮治療作用，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路及整體性的特點(diǎn)。

圖3 “藥物-關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 “Drug-key components-potential targets-core pathway” network

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

3.2.1 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠FBG 的影響 大鼠ip STZ 72 h 后，均出現(xiàn)多飲、多食、多尿的典型高血糖癥狀，連續(xù)喂食高脂高糖乳液后，模型組大鼠出現(xiàn)日益消瘦、體質(zhì)量下降、皮毛稀疏、大便便溏等情況，且Μorris 水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示模型組大鼠逃避潛伏期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)[6]，上述均表明DCI 模型建立成功；給予藥物后，上述癥狀均有所改善。如表1所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠ip 小劑量STZ 后FBG 明顯增高（P＜0.01），隨著高脂高糖飼料不斷攝入，大鼠FBG 略有升高后開(kāi)始穩(wěn)定，并保持高血糖狀態(tài)。酒蒸黃連-石菖蒲顯著降低DCI 大鼠FBG（P＜0.05、0.01），降糖率最高達(dá)到38.49%。

表1 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠FBG 的影響 (±s,n=10)Table 1 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on FBG in DCI rats (±s,n=10)

表1 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠FBG 的影響 (±s,n=10)Table 1 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on FBG in DCI rats (±s,n=10)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下表同##P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05 **P ＜0.01 vs model group,same as below tables

組別 劑量/(mg·kg-1) FBG/(mmol·L-1) 血糖變化率/%給藥前 給藥后24 周對(duì)照 — 6.53±0.42 6.28±0.51-3.83模型 — 27.83±3.25## 26.66±3.01##-4.92二甲雙胍 250 27.97±4.02 13.62±2.12**-45.94酒蒸黃連-石菖蒲 180 28.06±3.48 17.66±3.28**-38.49 80 28.91±3.77 21.54±2.02*-25.49

3.2.2 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠血清Ins 及相關(guān)抵抗指數(shù)的影響 如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組血清Ins 含量明顯降低（P＜0.01），HOΜA-IR顯著升高（P＜0.01），IAI 顯著下降（P＜0.01），表明2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗模型制備成功。與模型組相比，給藥24 周后，酒蒸黃連-石菖蒲高劑量組大鼠HOΜA-IR 顯著降低（P＜0.01），IAI 顯著升高（P＜0.01），但對(duì)血清Ins 含量無(wú)顯著影響，表明酒蒸黃連-石菖蒲能夠有效改善2 型糖尿病大鼠IR，使胰島β 細(xì)胞功能恢復(fù)正常，提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性。

表2 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠血清Ins 及相關(guān)抵抗指數(shù)的影響 (±s,n=10)Table 2 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on serum Ins and related resistance index in DCI rats (±s,n=10)

表2 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠血清Ins 及相關(guān)抵抗指數(shù)的影響 (±s,n=10)Table 2 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on serum Ins and related resistance index in DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) Ins/(mU·L-1) HOΜA-IR IAI/(×10-2)對(duì)照 — 9.054±0.103 2.527±0.374 1.759±0.113模型 — 7.806±0.276## 9.231±1.411## 0.487±0.072##二甲雙胍 250 8.467±0.182 5.246±0.984** 0.847±0.115**酒蒸黃連-石菖蒲 180 7.941±0.297 6.233±0.872** 0.713±0.081**80 7.874±0.223 7.578±1.117 0.590±0.107

3.2.3 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中Aβ42蛋白表達(dá)的影響 Aβ 在腦內(nèi)大量聚集產(chǎn)生神經(jīng)毒性而損傷腦組織，影響學(xué)習(xí)記憶能力，在認(rèn)知障礙的病程進(jìn)展中發(fā)揮主要作用。如圖4和表3所示，與對(duì)照組相比，模型組海馬組織中Aβ42蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，酒蒸黃連-石菖蒲組海馬組織Aβ42蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著降低（P＜0.05），表明酒蒸黃連-石菖蒲可減少Aβ 的生成，從而保護(hù)神經(jīng)元并改善認(rèn)知功能損傷。

圖4 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中Aβ42 蛋白表達(dá)的影響 (×400)Fig.4 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Aβ42 protein expression in hippocampus of DCI rats (× 400)

表3 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中Aβ42 蛋白表達(dá)的影響 (±s,n=10)Table 3 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Aβ42 protein expression in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表3 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中Aβ42 蛋白表達(dá)的影響 (±s,n=10)Table 3 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Aβ42 protein expression in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) A 值對(duì)照 — 0.182 8±0.006 1模型 — 0.248 7±0.008 6##二甲雙胍 250 0.199 0±0.007 8*酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.202 9±0.006 0*80 0.209 1±0.007 5*

3.2.4 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織膽堿能通路相關(guān)生化指標(biāo)的影響 如表4、圖5和表5所示，與對(duì)照組相比，模型組海馬組織中Ach 含量顯著降低（P＜0.01），ChAT 活性及蛋白表達(dá)均顯著下降（P＜0.01），AchE 活性及蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），表明高糖高脂狀態(tài)使AchE 和ChAT 2個(gè)關(guān)鍵酶受到影響，導(dǎo)致Ach 合成受到抑制，進(jìn)一步引發(fā)認(rèn)知功能損傷。與模型組相比，酒蒸黃連-石菖蒲各劑量組Ach 含量顯著升高（P＜0.05、0.01），ChAT 活性及蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05、0.01），AchE 活性明顯降低（P＜0.05、0.01）；酒蒸黃連-石菖蒲高劑量組AchE 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），表明酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠腦組織中的Ach 合成有一定促進(jìn)作用，可通過(guò)增強(qiáng)膽堿能信號(hào)通路來(lái)改善認(rèn)知功能障礙。

圖5 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中AchE 和ChAT 蛋白表達(dá)的影響 (×400)Fig.5 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on AchE and ChAT protein expressions in hippocampus of DCI rats (× 400)

表4 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中Ach 含量以及AchE、ChAT 活性的影響 (±s,n=10)Table 4 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Ach content,AchE and ChAT activities in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表4 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中Ach 含量以及AchE、ChAT 活性的影響 (±s,n=10)Table 4 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Ach content,AchE and ChAT activities in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) Ach/(μg·mg-1) AchE/(U·mg-1) ChAT/(U·g-1)對(duì)照 — 182.72±12.17 2.532±0.529 164.72±10.61模型 — 119.23±10.65## 5.297±0.664## 82.33±9.87##二甲雙胍 250 145.94±15.61* 3.746±0.351** 105.81±7.43*酒蒸黃連-石菖蒲 180 155.16±13.84** 3.225±0.421** 121.64±10.31**80 136.27±16.74* 4.071±0.472* 103.24±9.61*

表5 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中AchE 和ChAT 蛋白表達(dá)的影響 (±s,n=10)Table 5 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on AchE and ChAT protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表5 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中AchE 和ChAT 蛋白表達(dá)的影響 (±s,n=10)Table 5 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on AchE and ChAT protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) A 值A(chǔ)chE ChAT對(duì)照 — 0.167 9±0.009 0 0.214 3±0.002 0模型 — images/BZ_117_1043_1565_1045_1567.png0.231 5±0.010 8## 0.182 7±0.003 4##二甲雙胍 250 0.169 6±0.008 6** 0.209 1±0.002 6**酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.178 1±0.006 5** 0.208 6±0.001 9**80 0.213 5±0.010 6 0.210 0±0.001 3**

3.2.5 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì) DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt、GSK3β 蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響 如圖6和表6、7所示，與對(duì)照組相比，模型組海馬組織中IRS、PI3K、Akt、GSK3β 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但上述指標(biāo)的磷酸化水平明顯下降（P＜0.01），提示受損的IRS/PI3K/Akt 胰島素信號(hào)傳導(dǎo)和GSK3β 的過(guò)度激活均參與2 型糖尿病誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙過(guò)程。與模型組相比，酒蒸黃連-石菖蒲各劑量組海馬組織中Akt 和GSK3β 的磷酸化水平均顯著升高（P＜0.01），酒蒸黃連-石菖蒲高劑量組IRS和PI3K的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05、0.01），提示藥物能通過(guò)增強(qiáng)GSK3β在Ser9 的磷酸化水平，進(jìn)而抑制GSK3β 過(guò)度活化。以上結(jié)果表明，酒蒸黃連-石菖蒲組分一方面通過(guò)抑制GSK3β 活性來(lái)增加糖原合成，調(diào)節(jié)糖代謝；另一方面通過(guò)調(diào)節(jié)IRS/PI3K/Akt 信號(hào)通路來(lái)糾正腦內(nèi)胰島素的抵抗，減少Aβ 的沉積，改善認(rèn)知功能障礙。

表6 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 蛋白表達(dá)的影響 (±s,n=10)Table 6 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表6 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 蛋白表達(dá)的影響 (±s,n=10)Table 6 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) 蛋白相對(duì)表達(dá)量IRS/GAPDH PI3K/GAPDH Akt/GAPDH GSK3β/GAPDH對(duì)照 — 1.000 1.000 1.000 1.000模型 — 0.943±0.089 1.010±0.158 1.033±0.183 1.117±0.261二甲雙胍 250 0.925±0.098 1.038±0.230 1.032±0.362 1.067±0.253酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.906±0.118 0.990±0.113 0.964±0.127 1.121±0.309 80 0.960±0.160 0.969±0.027 1.096±0.283 1.054±0.137

圖6 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響Fig.6 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β protein expressions and phosphorylation levels in hippocampus of DCI rats

3.2.6 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織炎性相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響 如圖7和表8所示，與對(duì)照組相比，模型組海馬組織中IL-1β、IL-6 及TNF-α 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），表明長(zhǎng)期而持續(xù)的高脂高糖狀態(tài)容易造成大鼠腦組織的炎性反應(yīng)，甚至出現(xiàn)其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，進(jìn)而造成神經(jīng)元損傷，最終損害認(rèn)知功能。與模型組相比，酒蒸黃連-石菖蒲組海馬組織中IL-1β、IL-6 及TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），表明酒蒸黃連-石菖蒲可以通過(guò)抑制炎性因子表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)元并改善認(rèn)知障礙。

表7 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 磷酸化水平的影響 (±s,n=10)Table 7 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β phosphorylation levels in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表7 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 磷酸化水平的影響 (±s,n=10)Table 7 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β phosphorylation levels in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) 蛋白相對(duì)表達(dá)量p-IRS/GAPDH p-PI3K/GAPDH p-Akt/GAPDH p-GSK3β/GAPDH對(duì)照 — 1.000 1.000 1.000 1.000模型 — 0.392±0.025## 0.252±0.017## 0.288±0.015## 0.261±0.016##二甲雙胍 250 1.518±0.129** 0.554±0.049** 1.148±0.016** 0.948±0.030**酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.573±0.066* 0.497±0.075** 0.491±0.047** 0.899±0.064**80 0.469±0.071 0.274±0.055 0.471±0.023** 0.801±0.087**

圖7 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6及TNF-α 蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IL-1β,IL-6 and TNF-α protein expressions in hippocampus of DCI rats

表8 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6 及TNF-α 蛋白表達(dá)的影響 (±s,n=10)Table 8 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IL-1β,IL-6 and TNF-α protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表8 酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)DCI 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6 及TNF-α 蛋白表達(dá)的影響 (±s,n=10)Table 8 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IL-1β,IL-6 and TNF-α protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) 蛋白相對(duì)表達(dá)量IL-1β/GAPDH IL-6/GAPDH TNF-α/GAPDH對(duì)照 — 1.000 1.000 1.000模型 — 1.258±0.032## 1.164±0.058## 1.988±0.058##二甲雙胍 250 0.911±0.054** 0.101±0.087 1.132±0.041**酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.965±0.036* 0.979±0.027* 1.079±0.038**80 1.072±0.022* 0.989±0.036* 1.069±0.062**

4 討論

長(zhǎng)期且持續(xù)的高血糖狀態(tài)使糖尿病患者體內(nèi)多種組織和器官處于一種“中毒狀態(tài)”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，當(dāng)人體氣陰兩虛、脾失健運(yùn)時(shí)，升清降濁失司、氣機(jī)壅滯、內(nèi)生濁邪、結(jié)滯脈絡(luò)、膠著不去則極易化熱致毒邪；若濁毒久日不清，蘊(yùn)積在體內(nèi)而產(chǎn)生多種損害臟腑的病理物質(zhì)，或與瘀血、痰濁相纏，濁毒入絡(luò)毒損臟腑而引發(fā)多種并發(fā)癥[15]。這種“由濁致毒”的過(guò)程是糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，若不及時(shí)控制，濁毒瘀血進(jìn)入腦部，Aβ、炎性因子、過(guò)量凝血酶和自由基等“毒邪”聚集致使神經(jīng)元、腦絡(luò)、腦髓等結(jié)構(gòu)受損，腦中氣血陰陽(yáng)失衡，腦主神明功能失常，影響學(xué)習(xí)記憶能力和認(rèn)知功能，最終導(dǎo)致癡呆。因此，DCI 的核心病機(jī)是“毒損腦絡(luò)”，治療的根本法則是“解毒通絡(luò)”[16]。黃連用于“止消渴”歷史悠久[9]，在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，其顯示出良好的降血糖、改善IR、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂等作用，能夠有效減弱毒邪對(duì)“腦絡(luò)”的損害，起到“解毒”作用，且酒蒸黃連療效優(yōu)于生黃連。“毒損腦絡(luò)”病位在腦，而石菖蒲具有開(kāi)竅豁痰、醒神益智等功效，可作為配伍組方中引藥入腦的藥物，且藥理學(xué)研究表明，石菖蒲不僅能夠抗衰老、抗氧化和調(diào)血脂，還具有益智護(hù)腦、提高學(xué)習(xí)記憶能力和改善認(rèn)知功能的作用，減少神經(jīng)元損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用[17]。由此可見(jiàn)，酒蒸黃連-石菖蒲組方配伍是治療DCI的特色方藥，不僅從多層次、多途徑綜合發(fā)揮療效，還與中醫(yī)“解毒通絡(luò)”的治療方法相符。

在“藥物-關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)篩選出的活性成分中，藥理作用較強(qiáng)的小檗堿[18-19]、黃連堿[20]、表小檗堿[20]、巴馬汀[21]和β-細(xì)辛醚[22-23]等成分可能是酒蒸黃連-石菖蒲組分防治DCI 的潛在藥效物質(zhì)，其中小檗堿、黃連堿、巴馬汀和表小檗堿屬黃連生物堿成分，β-細(xì)辛醚是石菖蒲的主要成分。以上成分均表現(xiàn)出較強(qiáng)的調(diào)節(jié)血糖、血脂水平，改善IR 及氧化應(yīng)激，減少Aβ 沉積，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元損傷，抗認(rèn)知障礙的作用，這些藥理作用為酒蒸黃連-石菖蒲配伍治療DCI 提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。在預(yù)測(cè)的潛在作用靶點(diǎn)中，

AKT1、GSK3B、PPARG、INSR、IGFIR、APP、ΜAPT、TNF、PTGS2、ACHE 這幾個(gè)靶點(diǎn)分布于酒蒸黃連和石菖蒲的活性成分中，涉及糖脂代謝、炎性反應(yīng)、神經(jīng)元細(xì)胞調(diào)控、AGEs 增生、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)及IR 等過(guò)程，與糖尿病及其并發(fā)的認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。

本研究預(yù)測(cè)的信號(hào)通路中，與酒蒸黃連-石菖蒲關(guān)鍵成分及潛在靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)度最高的通路是PI3K-Akt 信號(hào)通路，其次是胰島素抵抗及胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、AGE-RAGE 信號(hào)通路、炎癥相關(guān)通路及膽堿能通路。PI3K-Akt 信號(hào)通路被胰島素激活后，一方面通過(guò)磷酸化GSK3β 增加糖原合成，促進(jìn)機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝取和利用，調(diào)控血糖水平來(lái)改善IR；另一方面能夠有效抑制神經(jīng)元損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，有利于學(xué)習(xí)、記憶能力的調(diào)控[24-25]，對(duì)糖尿病及其認(rèn)知功能障礙起到預(yù)防和治療作用。胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑損傷或發(fā)生IR，大腦中Ins 缺乏，不僅影響腦內(nèi)葡萄糖代謝，還會(huì)造成學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)細(xì)胞和認(rèn)知功能損害，最終導(dǎo)致神經(jīng)元退行性病變并加速認(rèn)知功能的下降[26]。AGE-RAGE 信號(hào)通路能夠增強(qiáng)神經(jīng)毒性，不僅產(chǎn)生糖毒性，抑制Ins 分泌，加劇氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，損傷神經(jīng)細(xì)胞；還能促使Aβ生成，催化Tau 蛋白磷酸化，加速癡呆和DCI 的發(fā)生[27-28]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)引起的炎性反應(yīng)不僅導(dǎo)致IR，還會(huì)促進(jìn)IL-1β、IL-6 和TNF-α等促炎因子表達(dá)致使多種組織器官受損，如引發(fā)腦神經(jīng)受損及病變，進(jìn)而認(rèn)知能力逐漸下降，最終引發(fā)認(rèn)知功能障礙[29-30]。膽堿能通路是空間學(xué)習(xí)記憶的重要部位，其中神經(jīng)遞質(zhì)Ach 與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切，腦內(nèi)Ach 含量增加可促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生，有效改善認(rèn)知功能損傷、調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶能力等神經(jīng)退行性疾病[31]。由以上推測(cè)，酒蒸黃連-石菖蒲組分可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路及相關(guān)炎癥通路，改善IR、胰島素途徑受損及膽堿能通路受損，調(diào)節(jié)機(jī)體Ins水平，增加糖原合成來(lái)降低血糖，減少Aβ 沉積，緩解神經(jīng)元損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終達(dá)到治療DCI 的目的。

同時(shí)，為了驗(yàn)證上述分析結(jié)果，通過(guò)建立大鼠DCI 復(fù)合模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，酒蒸黃連-石菖蒲組分對(duì)DCI 大鼠降糖效果顯著，能夠有效抑制大鼠血清HOΜA-IR、升高IAI，表明藥物通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝、提高機(jī)體對(duì)胰島素的反應(yīng)性和敏感性等多個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)改善IR。酒蒸黃連-石菖蒲能夠顯著增加DCI 大鼠海馬組織中Ach 含量、ChAT 活性及蛋白表達(dá)，降低AchE 含量及蛋白表達(dá)，表明藥物通過(guò)調(diào)控膽堿能通路，促進(jìn)腦組織中Ach 合成來(lái)改善認(rèn)知障礙。酒蒸黃連-石菖蒲能夠有效抑制DCI 大鼠腦內(nèi)Aβ42蛋白表達(dá)，上調(diào)IRS、PI3K、Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平，通過(guò)IRS/PI3K/Akt 信號(hào)通路來(lái)改善腦中IR，調(diào)節(jié)糖代謝，增加糖原合成，減少Aβ聚集，保護(hù)神經(jīng)元，修復(fù)認(rèn)知功能損傷。同時(shí)，酒蒸黃連-石菖蒲組分能夠顯著抑制腦組織中炎性因子IL-1、IL-6 及TNF-α 蛋白表達(dá)水平，表明藥物通過(guò)緩解機(jī)體炎性反應(yīng)，抑制炎性因子釋放，從而達(dá)到改善IR、保護(hù)神經(jīng)元和調(diào)控認(rèn)知功能的目的。

綜上所述，本研究基于“關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)探究酒蒸黃連-石菖蒲對(duì)糖尿病及其認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酒蒸黃連-石菖蒲可以通過(guò)多種有效成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)改善IR，調(diào)控胰島素相關(guān)信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、膽堿能通路等多種生物過(guò)程，同時(shí)抑制炎性反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮整體治療DCI 的作用。本研究不僅為臨床運(yùn)用酒蒸黃連-石菖蒲組分治療糖尿病及其并發(fā)的認(rèn)知功能障礙提供了理論依據(jù)，也為中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用治療復(fù)雜疾病的機(jī)制研究提供了方法參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突