李思穎，李佳川*，宋 琴，于 露，汪窩牛，王 優(yōu)

1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610041

2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科，四川 成都 610072

近年來，隨著人口老齡化以及肥胖癥人群日益增多，我國糖尿病患者發(fā)病率不斷增加且伴有年輕化趨勢，以學習記憶能力下降和認知功能損害為主的糖尿病認知功能障礙（diabetic cognitive impairment，DCI）在糖尿病患者中普遍流行，特別是老年患者更為頻發(fā)，已經嚴重影響到人類生命健康。現(xiàn)代醫(yī)學認為，DCI 的主要病理基礎為高血糖、高血脂、氧化應激、炎性反應、胰島素信號轉導途徑受損、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、糖基化終末產物（advanced gycation end products，AGEs）生成增加、β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積、神經元存活信號傳導通路障礙、膽堿能通路受損等[1-2]。從中醫(yī)角度看，糖尿病是由血糖水平升高等因素引起的絡脈損傷疾病，又稱糖絡病，其中血糖升高是因、絡脈損傷為果，一旦傷“絡”則并發(fā)癥叢生，若損傷腦絡則誘發(fā)認知功能損傷，故防治以控糖為主，并全程重視絡脈調暢[3]。目前尚無治療DCI 的特效藥物，西醫(yī)治療DCI 主要以服用降血糖、改善IR 和抗阿爾茨海默癥藥物為主，但療效并不顯著，而中醫(yī)藥講究辨證施治、糖絡同治，其多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的特征在糖尿病及其并發(fā)癥的防治中具有重要的意義和應用價值。

本課題組前期對酒蒸黃連-石菖蒲組分配伍規(guī)律[4-5]及其防治DCI 相關實驗研究顯示[6-7]，酒蒸黃連-石菖蒲能夠顯著改善糖脂代謝紊亂、IR 和認知功能損傷，且酒蒸黃連無論是降糖效果還是對糖脂代謝的調控作用均優(yōu)于黃連生品，該組方配伍是治療DCI 最好的用藥體現(xiàn)，既體現(xiàn)了中藥組分配伍現(xiàn)代研究新模式，又突顯中醫(yī)藥隨證炮制的用藥特色。目前對于酒蒸黃連-石菖蒲組分治療DCI 具體作用機制的相關研究甚少。因此，為進一步揭示酒蒸黃連-石菖蒲組分配伍機制，本研究在文獻回顧基礎上，運用現(xiàn)代網絡藥理學的分析方法[8]，通過構建“關鍵成分-潛在靶點-核心通路”交互網絡，深入探討酒蒸黃連-石菖蒲防治DCI 的潛在作用靶點及機制，并進行相關驗證性實驗，以期揭示酒蒸黃連-石菖蒲抗DCI 的作用機制，為指導中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)的認知障礙臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性Wister 大鼠，7 周齡，體質量270～300 g，由四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，動物許可證號SCXK（川）2015-030。動物于西南民族大學藥學院SPF 級動物實驗室適應性飼養(yǎng)1周，溫度（24±2）℃，相對濕度（55±5）%，每12 小時晝夜間斷性照明。動物實驗經西南大學藥學院實驗動物倫理委員會批準（批準號201810）。

1.2 藥材

黃連（批號161020）、石菖蒲（批號161101）購自四川德仁堂中藥飲片有限公司，經西南民族大學藥學院李佳川副教授鑒定分別為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖、天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

鹽酸二甲雙胍片（0.25 g/片，批號G0120160302）購自北京中惠藥業(yè)有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批號5756）購自美國Sigma公司；血糖測定試劑盒（批號1209091）購自四川邁克科技有限責任公司；胰島素酶聯(lián)免疫分析測定試劑盒（批號201608）購自美國R&D 公司；乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）試劑盒（批號20170513）、乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AchE）試劑盒（批號20170513）和乙酰膽堿轉移酶（choline acetyl transferase，ChAT）試劑盒（批號20170513）購自南京建成生物工程研究所；AchE 兔多克隆抗體（批號 17975-1-AP）、ChAT 兔多克隆抗體（批號24418-1-AP）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體（批號 16806-1-AP）、IL-6 抗體（批號21865-1-AP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（批號17590-1-AP）購自美國Proteintech 公司；Aβ42兔多克隆抗體（批號ab68896）購自英國Abcam 公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，Akt）抗體（批號11054）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）抗體（批號11002）、GSK3β 抗體（批號40989）、Akt 抗體（批號21054）購自美國SAB 公司；HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體（批號bs0295G-HRP）購自北京博奧森生物技術有限公司；磷酸化胰島素受體底物（phosphorylated insulin receptor substrate，p-IRS）抗體（批號2385S）、IRS 抗體（批號2382S）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗體（批號4228S）、PI3K 抗體（批號4292S）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號5174S）購自美國CST 公司。

1.4 儀器

SN-3001 型酶標儀（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；ChemiDoc 蛋白質印跡轉移裝置、Image Quant 300 型凝膠分析成像儀（美國Bio-Rad公司）；BA400 型數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）。

2 方法

2.1 酒蒸黃連生物堿組分與石菖蒲揮發(fā)油組分的制備

稱取適量黃連藥材，加入20%黃酒浸潤2 h，加熱蒸煮8 h，得到酒蒸黃連炮制藥材[9]；取炮制好的酒蒸黃連藥材，用75%乙醇回流提取3 次，1.5 h/次，合并提取液并旋蒸回收乙醇，用蒸餾水稀釋成含生藥量1 g/mL 的溶液，并用D-101 大孔樹脂分離純化，60 ℃減壓真空干燥，經HPLC 檢測，得到總生物堿質量分數(shù)為65.47%的酒蒸黃連生物堿組分[6]。

稱取適量干燥石菖蒲藥材，粉碎后過篩，加入10 倍量蒸餾水，采用水蒸氣蒸餾法加熱回流8 h，將收集到的揮發(fā)油組分用無水Na2SO4脫水，并采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-ΜS）對淺黃色揮發(fā)油組分進行分析，得到提取率為1.67%的石菖蒲揮發(fā)油組分[6]。

根據本課題組前期研究[5]，得到酒蒸黃連-石菖蒲組分的最佳配比為酒蒸黃連總生物堿54.7 mg、石菖蒲揮發(fā)油4.17 mg（以原藥材計，酒蒸黃連0.835 g、石菖蒲2.5 g），即配比為0.33∶1。

2.2 網絡藥理學分析

2.2.1 酒蒸黃連-石菖蒲活性成分及作用靶點的收集 在文獻資料和已有的藥效物質基礎上[10-11]，借助TCΜSP 數(shù)據庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）和TCΜ 數(shù)據庫（http://tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）對“黃連”“石菖蒲”所含化學成分進行查詢，參考TCΜSP數(shù)據庫的最新使用指南，以口服生物利用度≥20%且類藥性≥0.10 為標準，篩選出黃連和石菖蒲的活性成分，并結合本課題組前期對酒蒸黃連生物堿各組分的HPLC 分析及石菖蒲揮發(fā)油組分的GC-ΜS分析結果[6]，對活性成分進行補充。利用活性成分的CAS 號，在PubChem 數(shù)據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索各成分的簡化分子線性格式SΜILES，并保存。將活性成分的SΜILES 式輸入到 SwissTargetPrediction 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/），得到活性成分的作用靶點。

2.2.2 疾病靶點的獲取 以“糖尿病腦病”“糖尿病認知功能障礙”為關鍵詞，在GeneCards 數(shù)據庫（https://www.genecards.org/）中檢索與疾病相關的靶點，并對所得靶點進行篩選，得到DCI 的疾病靶點。

2.2.3 藥物與疾病共有靶點蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建 將上述藥物靶點與疾病靶點上傳至Venny 2.1 平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，取二者的交集，即為藥物與疾病的共有靶點。為了更好地說明藥物靶點與疾病靶點間的相互作用關系及核心作用靶點的挖掘，將共有靶點導入STRING 數(shù)據庫（https://string-db.org/），獲取蛋白互作信息，將數(shù)據導入Cytoscape 3.8.1 軟件繪制PPI 網絡圖，并對PPI 網絡進行拓撲學分析。

2.2.4 富集分析 為了闡明各活性成分的作用靶點在信號通路中的作用以及明確藥物的作用機制，利用DAVID 6.8 數(shù)據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對藥物與疾病的共有靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，從富集結果中選取P＜0.05 的通路，并采用 OmicShare Tools 在線平臺（https://www.omicshare.com/tools/）和FunRich 3.1.3軟件將富集結果可視化，進而預測酒蒸黃連-石菖蒲治療DCI 可能的作用機制。

2.2.5 “藥物-關鍵成分-潛在靶點-核心通路”網絡的構建 將藥物活性成分及作用靶點導入Cytoscape 3.8.1 軟件，構建“成分-靶點”網絡；利用Cytoscape 3.8.1 軟件中的Μerge 工具將“成分-靶點”網絡與PPI 網絡合并，得到“成分-靶點-疾病”網絡，計算度值、中心介度和緊密度的中位數(shù)，選取同時大于等于這3 個拓撲學參數(shù)中位數(shù)的節(jié)點，進一步構建“藥物-成分-靶點-疾病”核心網絡。同時，將KEGG 富集結果中P值較顯著的關鍵信號通路映射到“藥物-成分-靶點-疾病”核心網絡中，得到“藥物-關鍵成分-潛在靶點-核心通路”網絡。

2.3 動物實驗驗證

2.3.1 DCI 模型的建立[6]、分組與給藥 隨機選取10 只大鼠作為對照組，其余大鼠禁食18 h，于次日ip STZ 溶液（40 mg/kg），對照組ip 等體積0.1 mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，72 h 后檢測造模組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），將FBG≥11.1 mmol/L 的造模大鼠按血糖及體質量隨機分為對照組、模型組、二甲雙胍（250 mg/kg）組和酒蒸黃連-石菖蒲高、低劑量（180、80 mg/kg）組，每組10 只。二甲雙胍溶于蒸餾水配制為2.5%的溶液，酒蒸黃連-石菖蒲組分溶于蒸餾水分別配制成質量濃度為18、8 mg/mL 的溶液，各給藥組ig 相應藥物（10 mL/kg），對照組ig 等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)24 周。稱取豬油、膽固醇、豬膽酸鈉和蔗糖（2∶1∶0.05∶2），采用嚴平等[12]方法制成高脂高糖乳液。實驗期間除對照組外，其余各組大鼠連續(xù)24 周喂食高脂高糖乳液（10 mL/kg），且從第20 周開始，連續(xù)4 周scD-半乳糖（50 mg/kg）[6]。

2.3.2 各組大鼠FBG 及血清胰島素的測定 分別于給藥前以及給藥后第24 周，大鼠禁食不禁水8 h，給予藥物1 h 后，尾尖取血，測定給藥前后FBG，計算末次給藥前后的血糖變化率。

大鼠ip 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，股動脈取血，分離血清，測定大鼠血清胰島素（insulin，Ins）含量，并根據末次給藥后FBG 和Ins 值計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model of insulin resistance，HOΜA-IR）和胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，IAI）。

2.3.3 各組大鼠海馬組織Aβ42、AchE 和ChAT 蛋白表達的檢測 大鼠處死后迅速取海馬組織，用預冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗，拭干表面水分，于液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩Ｈ〔糠趾ｑR組織，于4%多聚甲醛中固定，經石蠟包埋、切片、脫水后，采用免疫組織化學SABC 染色法進一步處理[13]，于顯微鏡下觀察Aβ42、AchE 和ChAT 蛋白表達情況。陽性表達為淺黃或棕黃色，一般在胞質、細胞膜或細胞間質內顯色，陰性表達則為藍色。

2.3.4 各組大鼠海馬組織Ach 含量以及AchE、ChAT 活性的檢測 取各組大鼠海馬組織，加入預冷的0.9%氯化鈉溶液勻漿，3000 r/min 離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書測定海馬組織Ach 含量以及AchE、ChAT 活性。

2.3.5 各組大鼠海馬組織p-IRS、IRS、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β、IL-1β、IL-6和TNF-α 蛋白表達的檢測 取各組大鼠海馬組織，按照文獻方法[14]測定大鼠海馬組織中與糖代謝主要途徑相關的IRS、PI3K、Akt、GSK3β 的蛋白表達及磷酸化水平，同時測定與炎性反應相關的IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達情況。

2.3.6 數(shù)據統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，結果以±s表示，數(shù)據采用單因數(shù)方差分析進行組間比較。

3 結果

3.1 網絡藥理分析結果

3.1.1 藥物活性成分的篩選及作用靶點的預測 共得到21 種活性成分，其中酒蒸黃連16 種、石菖蒲5 種。通過SwissTargetPrediction 平臺對活性成分進行靶點預測，去重篩選后共獲得525 個作用靶點。

3.1.2 疾病相關靶點的預測 利用GeneCards 數(shù)據庫檢索與DCI 疾病相關的靶點，計算相關性分數(shù)的中位數(shù)為4.55，故選取相關性分數(shù)≥4.55 的靶點，去重后得到3034 個疾病相關靶點。

3.1.3 PPI 網絡的構建 將藥物作用靶點和DCI 靶點取交集，得到藥物與疾病共有靶點303 個，提示這303個共有靶點可能是酒蒸黃連-石菖蒲治療DCI的候選靶點。PPI 網絡如圖1所示，節(jié)點代表靶點，節(jié)點大小代表度值大小，每條邊代表蛋白互作關系，網絡圖顯示各個靶點間的關系密切，表明藥物治療疾病的作用機制復雜多樣，是多個靶點之間的協(xié)同作用，并非靠單一靶點來防治疾病。借助Cytoscape 3.8.1 軟件的ΜCODE 功能進行聚類分析，得到5 個聚類網絡，其中紅色聚類網絡分值最高，提示它可能是該網絡中關鍵靶點的聚類。

圖1 藥物和疾病交集靶點的PPI 網絡Fig.1 PPI network of drug and disease intersection targets

3.1.4 候選靶點通路分析 對303 個候選靶點進行KEGG 通路分析，得到P＜0.05 的信號通路共179條，主要涉及神經、血管、炎癥、氧化應激、胰島素分泌、糖脂代謝等方面。選擇富集結果中P值較為顯著的20 條通路進行展示（圖2），其中與DCI疾病進程密切相關的通路主要為AGE-AGE 受體（receptor of AGE，RAGE）信號通路、胰島素抵抗、神經營養(yǎng)素信號通路、PI3K-Akt 信號通路、2 型糖尿病、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，ΜAPK）信號通路、TNF 信號通路、胰島素信號通路、阿爾茨海默癥、膽堿能通路、長時程增強、胰高血糖素信號通路、核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、胰島素分泌和膽固醇代謝。

圖2 KEGG 通路富集分析 (前20)Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis (top 20)

3.1.5 “藥物-關鍵成分-潛在靶點-核心通路”網絡的構建 網絡中常用度值作為衡量節(jié)點重要性的關鍵指標，節(jié)點度值越大、連接的化合物或靶點越多，表明該節(jié)點越重要，則其代表的化合物或靶點越有可能在藥物治療疾病過程中發(fā)揮關鍵作用?！八幬?關鍵成分-潛在靶點-核心通路”網絡如圖3所示，包含234 個節(jié)點、2924 條邊，其中高于度值中位數(shù)的活性成分有16 個，排序靠前的成分為小檗堿、黃連堿、小檗浸堿、巴馬汀、表小檗堿、非洲防己堿、藥根堿和β-細辛醚，且在TCΜSP 查詢中，這幾種成分的血腦屏障透過率均大于0，良好的血腦屏障透過率為其提供了治療腦部疾病的可能性，其中血腦屏障透過率最高的成分是β-細辛醚，與石菖蒲開竅醒腦的功效吻合，提示以上成分可能在酒蒸黃連-石菖蒲治療DCI 過程中發(fā)揮重要作用。高于度值中位數(shù)的靶點有84 個，結合PPI 聚類網絡，提示AKT1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARG）、INSR、胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGFIR）、GSK3B、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、微管相關蛋白 tau（microtubule-associated protein tau，ΜAPT）、TNF、前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、ACHE 等靶點可能是酒蒸黃連-石菖蒲防治DCI 的關鍵作用靶點，這些靶點主要參與機體的糖脂代謝、氧化應激、炎性反應、血管病變、神經元細胞調控、AGEs 增生、胰島素信號傳導及IR等過程，與糖尿病及其認知功能障礙密切相關。與藥物關鍵成分、潛在靶點關聯(lián)程度較高的通路為PI3K-Akt 信號通路、胰島素抵抗及胰島素轉導相關途徑、AGE-RAGE 信號通路、TNF 炎癥通路、膽堿能通路。在預測的潛在靶點中，與PI3K-Akt 信號通路密切相關的是AKT1 和GSK3B，與胰島素抵抗及胰島素轉導相關途徑密切相關的是AKT1、GSK3B、INSR 和IGFIR，與AGE-RAGE 信號通路密切相關的是GSK3B、APP 和ΜAPT，與TNF 炎癥通路相關的是TNF 和PTGS2，與膽堿能通路密切相關的是ACHE，提示上述靶點和通路可能是酒蒸黃連-石菖蒲組分抗DCI的潛在作用靶點和核心途徑?！八幬?關鍵成分-潛在靶點-核心通路”網絡揭示了多個靶點可以對應同一種成分，一個靶點也可以對應多種不同的成分，且藥物作用靶點分布于多條信號通路中，表明酒蒸黃連-石菖蒲組分中多個成分可作用于多個靶點并通過多條通路協(xié)同發(fā)揮治療作用，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路及整體性的特點。

圖3 “藥物-關鍵成分-潛在靶點-核心通路”網絡Fig.3 “Drug-key components-potential targets-core pathway” network

3.2 動物實驗驗證結果

3.2.1 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠FBG 的影響 大鼠ip STZ 72 h 后，均出現(xiàn)多飲、多食、多尿的典型高血糖癥狀，連續(xù)喂食高脂高糖乳液后，模型組大鼠出現(xiàn)日益消瘦、體質量下降、皮毛稀疏、大便便溏等情況，且Μorris 水迷宮實驗顯示模型組大鼠逃避潛伏期較對照組明顯延長[6]，上述均表明DCI 模型建立成功；給予藥物后，上述癥狀均有所改善。如表1所示，與對照組相比，模型組大鼠ip 小劑量STZ 后FBG 明顯增高（P＜0.01），隨著高脂高糖飼料不斷攝入，大鼠FBG 略有升高后開始穩(wěn)定，并保持高血糖狀態(tài)。酒蒸黃連-石菖蒲顯著降低DCI 大鼠FBG（P＜0.05、0.01），降糖率最高達到38.49%。

表1 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠FBG 的影響 (±s,n=10)Table 1 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on FBG in DCI rats (±s,n=10)

表1 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠FBG 的影響 (±s,n=10)Table 1 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on FBG in DCI rats (±s,n=10)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下表同##P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05 **P ＜0.01 vs model group,same as below tables

組別 劑量/(mg·kg-1) FBG/(mmol·L-1) 血糖變化率/%給藥前 給藥后24 周對照 — 6.53±0.42 6.28±0.51-3.83模型 — 27.83±3.25## 26.66±3.01##-4.92二甲雙胍 250 27.97±4.02 13.62±2.12**-45.94酒蒸黃連-石菖蒲 180 28.06±3.48 17.66±3.28**-38.49 80 28.91±3.77 21.54±2.02*-25.49

3.2.2 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠血清Ins 及相關抵抗指數(shù)的影響 如表2所示，與對照組相比，模型組血清Ins 含量明顯降低（P＜0.01），HOΜA-IR顯著升高（P＜0.01），IAI 顯著下降（P＜0.01），表明2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗模型制備成功。與模型組相比，給藥24 周后，酒蒸黃連-石菖蒲高劑量組大鼠HOΜA-IR 顯著降低（P＜0.01），IAI 顯著升高（P＜0.01），但對血清Ins 含量無顯著影響，表明酒蒸黃連-石菖蒲能夠有效改善2 型糖尿病大鼠IR，使胰島β 細胞功能恢復正常，提高機體對胰島素的敏感性。

表2 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠血清Ins 及相關抵抗指數(shù)的影響 (±s,n=10)Table 2 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on serum Ins and related resistance index in DCI rats (±s,n=10)

表2 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠血清Ins 及相關抵抗指數(shù)的影響 (±s,n=10)Table 2 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on serum Ins and related resistance index in DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) Ins/(mU·L-1) HOΜA-IR IAI/(×10-2)對照 — 9.054±0.103 2.527±0.374 1.759±0.113模型 — 7.806±0.276## 9.231±1.411## 0.487±0.072##二甲雙胍 250 8.467±0.182 5.246±0.984** 0.847±0.115**酒蒸黃連-石菖蒲 180 7.941±0.297 6.233±0.872** 0.713±0.081**80 7.874±0.223 7.578±1.117 0.590±0.107

3.2.3 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中Aβ42蛋白表達的影響 Aβ 在腦內大量聚集產生神經毒性而損傷腦組織，影響學習記憶能力，在認知障礙的病程進展中發(fā)揮主要作用。如圖4和表3所示，與對照組相比，模型組海馬組織中Aβ42蛋白陽性表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，酒蒸黃連-石菖蒲組海馬組織Aβ42蛋白陽性表達顯著降低（P＜0.05），表明酒蒸黃連-石菖蒲可減少Aβ 的生成，從而保護神經元并改善認知功能損傷。

圖4 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中Aβ42 蛋白表達的影響 (×400)Fig.4 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Aβ42 protein expression in hippocampus of DCI rats (× 400)

表3 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中Aβ42 蛋白表達的影響 (±s,n=10)Table 3 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Aβ42 protein expression in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表3 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中Aβ42 蛋白表達的影響 (±s,n=10)Table 3 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Aβ42 protein expression in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) A 值對照 — 0.182 8±0.006 1模型 — 0.248 7±0.008 6##二甲雙胍 250 0.199 0±0.007 8*酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.202 9±0.006 0*80 0.209 1±0.007 5*

3.2.4 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織膽堿能通路相關生化指標的影響 如表4、圖5和表5所示，與對照組相比，模型組海馬組織中Ach 含量顯著降低（P＜0.01），ChAT 活性及蛋白表達均顯著下降（P＜0.01），AchE 活性及蛋白表達明顯升高（P＜0.01），表明高糖高脂狀態(tài)使AchE 和ChAT 2個關鍵酶受到影響，導致Ach 合成受到抑制，進一步引發(fā)認知功能損傷。與模型組相比，酒蒸黃連-石菖蒲各劑量組Ach 含量顯著升高（P＜0.05、0.01），ChAT 活性及蛋白表達均顯著升高（P＜0.05、0.01），AchE 活性明顯降低（P＜0.05、0.01）；酒蒸黃連-石菖蒲高劑量組AchE 蛋白表達明顯降低（P＜0.01），表明酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠腦組織中的Ach 合成有一定促進作用，可通過增強膽堿能信號通路來改善認知功能障礙。

圖5 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中AchE 和ChAT 蛋白表達的影響 (×400)Fig.5 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on AchE and ChAT protein expressions in hippocampus of DCI rats (× 400)

表4 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中Ach 含量以及AchE、ChAT 活性的影響 (±s,n=10)Table 4 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Ach content,AchE and ChAT activities in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表4 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中Ach 含量以及AchE、ChAT 活性的影響 (±s,n=10)Table 4 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on Ach content,AchE and ChAT activities in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) Ach/(μg·mg-1) AchE/(U·mg-1) ChAT/(U·g-1)對照 — 182.72±12.17 2.532±0.529 164.72±10.61模型 — 119.23±10.65## 5.297±0.664## 82.33±9.87##二甲雙胍 250 145.94±15.61* 3.746±0.351** 105.81±7.43*酒蒸黃連-石菖蒲 180 155.16±13.84** 3.225±0.421** 121.64±10.31**80 136.27±16.74* 4.071±0.472* 103.24±9.61*

表5 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中AchE 和ChAT 蛋白表達的影響 (±s,n=10)Table 5 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on AchE and ChAT protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表5 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中AchE 和ChAT 蛋白表達的影響 (±s,n=10)Table 5 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on AchE and ChAT protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) A 值AchE ChAT對照 — 0.167 9±0.009 0 0.214 3±0.002 0模型 — images/BZ_117_1043_1565_1045_1567.png0.231 5±0.010 8## 0.182 7±0.003 4##二甲雙胍 250 0.169 6±0.008 6** 0.209 1±0.002 6**酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.178 1±0.006 5** 0.208 6±0.001 9**80 0.213 5±0.010 6 0.210 0±0.001 3**

3.2.5 酒蒸黃連-石菖蒲對 DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt、GSK3β 蛋白表達及磷酸化水平的影響 如圖6和表6、7所示，與對照組相比，模型組海馬組織中IRS、PI3K、Akt、GSK3β 蛋白表達無明顯變化，但上述指標的磷酸化水平明顯下降（P＜0.01），提示受損的IRS/PI3K/Akt 胰島素信號傳導和GSK3β 的過度激活均參與2 型糖尿病誘導的認知障礙過程。與模型組相比，酒蒸黃連-石菖蒲各劑量組海馬組織中Akt 和GSK3β 的磷酸化水平均顯著升高（P＜0.01），酒蒸黃連-石菖蒲高劑量組IRS和PI3K的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05、0.01），提示藥物能通過增強GSK3β在Ser9 的磷酸化水平，進而抑制GSK3β 過度活化。以上結果表明，酒蒸黃連-石菖蒲組分一方面通過抑制GSK3β 活性來增加糖原合成，調節(jié)糖代謝；另一方面通過調節(jié)IRS/PI3K/Akt 信號通路來糾正腦內胰島素的抵抗，減少Aβ 的沉積，改善認知功能障礙。

表6 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 蛋白表達的影響 (±s,n=10)Table 6 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表6 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 蛋白表達的影響 (±s,n=10)Table 6 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) 蛋白相對表達量IRS/GAPDH PI3K/GAPDH Akt/GAPDH GSK3β/GAPDH對照 — 1.000 1.000 1.000 1.000模型 — 0.943±0.089 1.010±0.158 1.033±0.183 1.117±0.261二甲雙胍 250 0.925±0.098 1.038±0.230 1.032±0.362 1.067±0.253酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.906±0.118 0.990±0.113 0.964±0.127 1.121±0.309 80 0.960±0.160 0.969±0.027 1.096±0.283 1.054±0.137

圖6 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 蛋白表達及磷酸化水平的影響Fig.6 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β protein expressions and phosphorylation levels in hippocampus of DCI rats

3.2.6 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織炎性相關因子蛋白表達的影響 如圖7和表8所示，與對照組相比，模型組海馬組織中IL-1β、IL-6 及TNF-α 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），表明長期而持續(xù)的高脂高糖狀態(tài)容易造成大鼠腦組織的炎性反應，甚至出現(xiàn)其介導的氧化應激，進而造成神經元損傷，最終損害認知功能。與模型組相比，酒蒸黃連-石菖蒲組海馬組織中IL-1β、IL-6 及TNF-α蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01），表明酒蒸黃連-石菖蒲可以通過抑制炎性因子表達，保護神經元并改善認知障礙。

表7 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 磷酸化水平的影響 (±s,n=10)Table 7 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β phosphorylation levels in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表7 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織IRS、PI3K、Akt 和GSK3β 磷酸化水平的影響 (±s,n=10)Table 7 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IRS,PI3K,Akt,GSK3β phosphorylation levels in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) 蛋白相對表達量p-IRS/GAPDH p-PI3K/GAPDH p-Akt/GAPDH p-GSK3β/GAPDH對照 — 1.000 1.000 1.000 1.000模型 — 0.392±0.025## 0.252±0.017## 0.288±0.015## 0.261±0.016##二甲雙胍 250 1.518±0.129** 0.554±0.049** 1.148±0.016** 0.948±0.030**酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.573±0.066* 0.497±0.075** 0.491±0.047** 0.899±0.064**80 0.469±0.071 0.274±0.055 0.471±0.023** 0.801±0.087**

圖7 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6及TNF-α 蛋白表達的影響Fig.7 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IL-1β,IL-6 and TNF-α protein expressions in hippocampus of DCI rats

表8 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6 及TNF-α 蛋白表達的影響 (±s,n=10)Table 8 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IL-1β,IL-6 and TNF-α protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

表8 酒蒸黃連-石菖蒲對DCI 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6 及TNF-α 蛋白表達的影響 (±s,n=10)Table 8 Effect of wine steamed Coptidis Rhizoma-Acori Tatarinowii Rhizoma on IL-1β,IL-6 and TNF-α protein expressions in hippocampus of DCI rats (±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1) 蛋白相對表達量IL-1β/GAPDH IL-6/GAPDH TNF-α/GAPDH對照 — 1.000 1.000 1.000模型 — 1.258±0.032## 1.164±0.058## 1.988±0.058##二甲雙胍 250 0.911±0.054** 0.101±0.087 1.132±0.041**酒蒸黃連-石菖蒲 180 0.965±0.036* 0.979±0.027* 1.079±0.038**80 1.072±0.022* 0.989±0.036* 1.069±0.062**

4 討論

長期且持續(xù)的高血糖狀態(tài)使糖尿病患者體內多種組織和器官處于一種“中毒狀態(tài)”。中醫(yī)學認為，當人體氣陰兩虛、脾失健運時，升清降濁失司、氣機壅滯、內生濁邪、結滯脈絡、膠著不去則極易化熱致毒邪；若濁毒久日不清，蘊積在體內而產生多種損害臟腑的病理物質，或與瘀血、痰濁相纏，濁毒入絡毒損臟腑而引發(fā)多種并發(fā)癥[15]。這種“由濁致毒”的過程是糖尿病發(fā)生發(fā)展的關鍵，若不及時控制，濁毒瘀血進入腦部，Aβ、炎性因子、過量凝血酶和自由基等“毒邪”聚集致使神經元、腦絡、腦髓等結構受損，腦中氣血陰陽失衡，腦主神明功能失常，影響學習記憶能力和認知功能，最終導致癡呆。因此，DCI 的核心病機是“毒損腦絡”，治療的根本法則是“解毒通絡”[16]。黃連用于“止消渴”歷史悠久[9]，在現(xiàn)代藥理學研究中，其顯示出良好的降血糖、改善IR、調節(jié)糖脂代謝紊亂等作用，能夠有效減弱毒邪對“腦絡”的損害，起到“解毒”作用，且酒蒸黃連療效優(yōu)于生黃連。“毒損腦絡”病位在腦，而石菖蒲具有開竅豁痰、醒神益智等功效，可作為配伍組方中引藥入腦的藥物，且藥理學研究表明，石菖蒲不僅能夠抗衰老、抗氧化和調血脂，還具有益智護腦、提高學習記憶能力和改善認知功能的作用，減少神經元損傷和神經細胞凋亡，起到保護神經系統(tǒng)的作用[17]。由此可見，酒蒸黃連-石菖蒲組方配伍是治療DCI的特色方藥，不僅從多層次、多途徑綜合發(fā)揮療效，還與中醫(yī)“解毒通絡”的治療方法相符。

在“藥物-關鍵成分-潛在靶點-核心通路”網絡篩選出的活性成分中，藥理作用較強的小檗堿[18-19]、黃連堿[20]、表小檗堿[20]、巴馬汀[21]和β-細辛醚[22-23]等成分可能是酒蒸黃連-石菖蒲組分防治DCI 的潛在藥效物質，其中小檗堿、黃連堿、巴馬汀和表小檗堿屬黃連生物堿成分，β-細辛醚是石菖蒲的主要成分。以上成分均表現(xiàn)出較強的調節(jié)血糖、血脂水平，改善IR 及氧化應激，減少Aβ 沉積，抑制神經元細胞凋亡和神經元損傷，抗認知障礙的作用，這些藥理作用為酒蒸黃連-石菖蒲配伍治療DCI 提供了堅實的理論依據。在預測的潛在作用靶點中，

AKT1、GSK3B、PPARG、INSR、IGFIR、APP、ΜAPT、TNF、PTGS2、ACHE 這幾個靶點分布于酒蒸黃連和石菖蒲的活性成分中，涉及糖脂代謝、炎性反應、神經元細胞調控、AGEs 增生、胰島素信號傳導及IR 等過程，與糖尿病及其并發(fā)的認知功能障礙密切相關。

本研究預測的信號通路中，與酒蒸黃連-石菖蒲關鍵成分及潛在靶點關聯(lián)度最高的通路是PI3K-Akt 信號通路，其次是胰島素抵抗及胰島素轉導途徑、AGE-RAGE 信號通路、炎癥相關通路及膽堿能通路。PI3K-Akt 信號通路被胰島素激活后，一方面通過磷酸化GSK3β 增加糖原合成，促進機體對葡萄糖的攝取和利用，調控血糖水平來改善IR；另一方面能夠有效抑制神經元損傷和神經細胞凋亡，有利于學習、記憶能力的調控[24-25]，對糖尿病及其認知功能障礙起到預防和治療作用。胰島素轉導途徑損傷或發(fā)生IR，大腦中Ins 缺乏，不僅影響腦內葡萄糖代謝，還會造成學習記憶活動細胞和認知功能損害，最終導致神經元退行性病變并加速認知功能的下降[26]。AGE-RAGE 信號通路能夠增強神經毒性，不僅產生糖毒性，抑制Ins 分泌，加劇氧化應激和炎性反應，損傷神經細胞；還能促使Aβ生成，催化Tau 蛋白磷酸化，加速癡呆和DCI 的發(fā)生[27-28]。現(xiàn)代醫(yī)學認為，長期高血糖狀態(tài)引起的炎性反應不僅導致IR，還會促進IL-1β、IL-6 和TNF-α等促炎因子表達致使多種組織器官受損，如引發(fā)腦神經受損及病變，進而認知能力逐漸下降，最終引發(fā)認知功能障礙[29-30]。膽堿能通路是空間學習記憶的重要部位，其中神經遞質Ach 與學習記憶關系最為密切，腦內Ach 含量增加可促進神經元發(fā)育和神經再生，有效改善認知功能損傷、調節(jié)學習記憶能力等神經退行性疾病[31]。由以上推測，酒蒸黃連-石菖蒲組分可能通過調控PI3K-Akt 信號通路、AGE-RAGE 信號通路及相關炎癥通路，改善IR、胰島素途徑受損及膽堿能通路受損，調節(jié)機體Ins水平，增加糖原合成來降低血糖，減少Aβ 沉積，緩解神經元損傷，抑制神經細胞凋亡，最終達到治療DCI 的目的。

同時，為了驗證上述分析結果，通過建立大鼠DCI 復合模型進行實驗研究，結果表明，酒蒸黃連-石菖蒲組分對DCI 大鼠降糖效果顯著，能夠有效抑制大鼠血清HOΜA-IR、升高IAI，表明藥物通過調節(jié)糖代謝、提高機體對胰島素的反應性和敏感性等多個環(huán)節(jié)來改善IR。酒蒸黃連-石菖蒲能夠顯著增加DCI 大鼠海馬組織中Ach 含量、ChAT 活性及蛋白表達，降低AchE 含量及蛋白表達，表明藥物通過調控膽堿能通路，促進腦組織中Ach 合成來改善認知障礙。酒蒸黃連-石菖蒲能夠有效抑制DCI 大鼠腦內Aβ42蛋白表達，上調IRS、PI3K、Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平，通過IRS/PI3K/Akt 信號通路來改善腦中IR，調節(jié)糖代謝，增加糖原合成，減少Aβ聚集，保護神經元，修復認知功能損傷。同時，酒蒸黃連-石菖蒲組分能夠顯著抑制腦組織中炎性因子IL-1、IL-6 及TNF-α 蛋白表達水平，表明藥物通過緩解機體炎性反應，抑制炎性因子釋放，從而達到改善IR、保護神經元和調控認知功能的目的。

綜上所述，本研究基于“關鍵成分-潛在靶點-核心通路”網絡探究酒蒸黃連-石菖蒲對糖尿病及其認知功能障礙的作用機制，結合動物實驗發(fā)現(xiàn)酒蒸黃連-石菖蒲可以通過多種有效成分作用于多個靶點來改善IR，調控胰島素相關信號通路、PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE 信號通路、膽堿能通路等多種生物過程，同時抑制炎性反應和神經細胞凋亡，進而發(fā)揮整體治療DCI 的作用。本研究不僅為臨床運用酒蒸黃連-石菖蒲組分治療糖尿病及其并發(fā)的認知功能障礙提供了理論依據，也為中藥復方多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用治療復雜疾病的機制研究提供了方法參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突