成顏芬，杜克群，吳億晗，楊青波，段 毅，胥海婷，韓曉琴，傅超美，何 瑤*，章津銘*

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

2.貴州益佰制藥股份有限公司，貴州 貴陽 550000

桃紅四物湯（Taohong Siwu Decoction，TSD）出自清·柴得華的《婦科冰鑒》，處方由生地三錢（酒洗）、當(dāng)歸四錢（酒洗）、白芍錢五分（酒炒）、川芎一錢、桃仁十四粒（去皮尖研泥）、紅花一錢（酒洗）6 味藥組成，主治血虛血瘀證，臨床常見于痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等多種婦科疾病，收錄于國家中醫(yī)藥管理局會(huì)同國家藥品監(jiān)督管理局制定的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[1]。古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑是中醫(yī)經(jīng)典方劑的精品制劑，要求基于尊古思想和復(fù)方合煎的制備模式，既保持原汁原味的合煎特點(diǎn)，又能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量與療效的一致性[2]。但隨著人民群眾的飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣以及疾病譜等的變化，僅利用固定經(jīng)方所制得制劑已不能滿足目前臨床出現(xiàn)的各類病癥治療，提出臨床應(yīng)用在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，常需充分發(fā)揮中醫(yī)辨證論治、遣方用藥特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)個(gè)性化治療[3]。而中藥配方顆粒是對傳統(tǒng)中藥飲片的有益補(bǔ)充，運(yùn)用現(xiàn)代制劑技術(shù)將中藥飲片按照提取、濃縮、干燥、制粒等步驟制得，可供臨床配方直接使用，具有臨床調(diào)劑方便、患者使用方便、質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)，深得患者接受[4]。目前，多項(xiàng)研究[5-8]進(jìn)一步對比分析傳統(tǒng)湯劑單煎與合煎的物質(zhì)基礎(chǔ)成分和藥效學(xué)質(zhì)量的異同性，考察復(fù)方合煎和藥味單煎混合湯劑在化學(xué)成分、藥效以及臨床應(yīng)用上的差異相關(guān)性?；诖?，提出“復(fù)方合煎”的古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑和“藥味單煎混合”的中藥配方顆粒在化學(xué)成分與核心藥效是否一致，又能否在古代經(jīng)典名方基礎(chǔ)上隨證加減單味藥配方顆粒，以實(shí)現(xiàn)臨床用藥的個(gè)性化治療，是現(xiàn)階段經(jīng)典名方未來發(fā)展值得深入研究的基礎(chǔ)性問題。

課題組前期已通過對本草考證、飲片炮制工藝的考察與進(jìn)一步優(yōu)化，同時(shí)已建立TSD 基準(zhǔn)樣品HPLC 化學(xué)指紋圖譜方法[9]，采用多成分波長切換法測定了TSD 基準(zhǔn)樣品中芍藥苷、羥基紅花黃色素A、芍藥內(nèi)酯苷等9 種指標(biāo)成分的含量，為TSD 基準(zhǔn)樣品及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。然而，現(xiàn)有的研究僅從成分差異角度對比分析TSD 配方顆粒與傳統(tǒng)水煎劑中芍藥苷、苦杏仁苷及阿魏酸3種化學(xué)成分含量差異[10]，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、藥效研究甚至臨床研究仍不夠清楚，不能有效全面地闡明TSD 單味藥配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑及其制劑之間的相關(guān)性。目前，多采用LC-ΜS/ΜS 技術(shù)鑒定并歸屬中藥復(fù)方中的化學(xué)成分，并結(jié)合HPLC 同時(shí)測定樣品中多種主要化學(xué)成分含量的手段是全面表征，獲得研究對象全面的化學(xué)成分信息，并對關(guān)鍵質(zhì)量信息進(jìn)行量化掌握，明確中藥復(fù)方的化學(xué)特征[8]。因此，本研究結(jié)合UPLC-Q-Exactive Orbitrap/ΜS 對TSD 單煎與合煎樣品成分進(jìn)行鑒定，并歸屬各化學(xué)成分來源；根據(jù)前期課題組建立的TSD 多指標(biāo)成分含量測定法，對TSD 合煎與單煎樣品進(jìn)行定量測定，以期較全面地表征TSD 基準(zhǔn)樣品化學(xué)組成，對比研究合煎和單煎混合所制得凍干粉的9 種化學(xué)組成含量差異；并根據(jù)TSD“調(diào)經(jīng)止痛”的核心功效，建立急性大鼠痛經(jīng)模型，對比評價(jià)合煎和單煎混合所得凍干粉的藥效差異，為該方單味藥配方顆粒臨床替代傳統(tǒng)湯劑及其復(fù)方制劑的可行性提供參考，也進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)在古代經(jīng)典名方基礎(chǔ)上隨證加減單味藥配方顆粒的臨床個(gè)性化治療與用藥手段提供基礎(chǔ)性研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

UPLC-Q-Exactive Orbitrap/ΜS 質(zhì)譜儀和UltiΜate 3000 型高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher 公司。對照品沒食子酸（批號wkq18032304）、5-羥甲基糠醛（批號wkq19010805）、綠原酸（批號wkq18022809）、苦杏仁苷（批號wkq16072002）、芍藥內(nèi)酯苷（批號wkq18052205）、羥基紅花黃色素A（批號wkq18010407）、芍藥苷（批號wkq18032104）、阿魏酸（批號wkq16080209）、毛蕊花糖苷（批號wkq16062004）、苯甲酰芍藥苷（批號wkq19012812）均購于四川省維克奇生物科技有限公司；對照品洋川芎內(nèi)酯I（批號Y-085-170609）購于成都瑞芬思生物科技有限公司；各對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。水為純化水，甲醇、乙腈、甲酸、磷酸為色譜級，其他試劑均為分析純。前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Ca2+、內(nèi)皮素-1（endothelin 1，ET-1）和NO的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號202101）均購自上海篤瑪生物科技有限公司。苯甲酸雌二醇注射液（批次201017）和催產(chǎn)素注射液（批次200712）購自上海全宇生物科技（駐馬店）動(dòng)物藥業(yè)有限公司。塞來昔布膠囊（批號T97271）購自輝瑞制藥有限公司。

1.2 藥材

根據(jù)2020年11月國家藥監(jiān)局會(huì)同中醫(yī)藥管理最新公布的TSD 的考證劑量及炮制規(guī)格等關(guān)鍵信息[9]，6 味藥材均購于產(chǎn)自道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)相應(yīng)產(chǎn)地，并經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源專業(yè)裴瑾教授鑒定，地黃為玄參科地黃屬植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的干燥塊根，當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根，白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，紅花為菊科紅花屬植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花，桃仁為薔薇科櫻桃屬植物桃Prunus persica(L.) Batsch 的干燥成熟種子。各藥材均符合《中國藥典》2020年版一部相關(guān)項(xiàng)下的性狀規(guī)定，所需炮制飲片均由公司提供，且飲片各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)均符合藥典相關(guān)規(guī)定。

1.3 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用SD 雌性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由北京斯貝福有限公司提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中國國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例”和成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的議定書（批準(zhǔn)文號2014DL-023）規(guī)范執(zhí)行。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的配制

2.1.1 TSD 合煎凍干粉（HJ） 根據(jù)國家最新公布《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表（7 首方劑）》TSD 中的處方組成[11]以及劑量換算[12]，故稱取全方飲片3 倍劑量合計(jì)128.85 g，并根據(jù)前期課題組對相關(guān)炮制工藝考察結(jié)果，基于傳統(tǒng)水煎煮的遵古理論，處方飲片浸泡30 min 后煎煮2 次，一煎30 min，二煎20 min，分別過濾混合制得TSD 湯劑，減壓濃縮至200 mL，冷凍干燥成粉末，即得TSD HJ。

2.1.2 TSD 單煎混合凍干粉（DJ） 分別取處方6味飲片的3 倍劑量，按照“2.1.1”項(xiàng)煎煮工藝，分別得到各單味藥飲片單煎凍干粉。將上述所制備而成的6 種單味藥飲片單煎凍干粉完全混合均勻，即得TSD DJ。

2.1.3 供試品溶液 分別精密稱取TSD HJ、DJ 約0.2 g，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇至完全溶解，稱定質(zhì)量，超聲30 min 后，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得TSD HJ、DJ 的供試品溶液。

2.1.4 混合對照品溶液 取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I、苯甲酰芍藥苷對照品適量，精密稱定，置于10 個(gè)量瓶中，分別加甲醇配制成質(zhì)量濃度依次為1.412、2.048、1.100、1.892、1.524、1.415、1.604、1.165、1.836、0.880 g/L 的對照品儲備液。分別取上述9 種對照品儲備液適量，加入10 mL 量瓶中，制得沒食子酸、5-羥甲基糠醛、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 各成分質(zhì)量濃度分別為42.36、20.48、44.00、75.68、121.92、283.00、64.16、23.30、36.72 mg/L的混合對照品溶液。

2.2 UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 分析TSD HJ與DJ 之間的化學(xué)成分

2.2.1 色譜-質(zhì)譜條件 色譜柱為SunFire C18柱（150 mm×3.0 mm，3.5 μm，Waters，Μassachusetts，USA）；以0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～5 min，5%～13%乙腈；5～15 min，13%～27%乙腈；15～25 min，27%～54%乙腈；25～37 min，54%～99%乙腈；37～39 min，95%乙腈；39～39.1 min，95%～5%乙腈；39.1～40.1 min，5%乙腈；體積流量0.30 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積2 μL。質(zhì)譜參數(shù)：離子源為電噴霧離子源（ESI）混合離子源模式；檢測范圍m/z100～1500；檢測模式為正/負(fù)離子；碰撞電壓35 V；毛細(xì)管電壓3.2 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；干燥氣流溫度350 ℃。

2.2.2 樣品分析及數(shù)據(jù)處理 采用Xcalibur 軟件和Compound Discover 3.0 數(shù)據(jù)庫采集并分析TSD HJ、TSD DJ 中化學(xué)成分差異，分別取各供試品溶液2 μL進(jìn)樣檢測分析。根據(jù)對照品和參照文獻(xiàn)的質(zhì)譜信息，以及PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）等化學(xué)數(shù)據(jù)庫在線網(wǎng)址初步篩選化合物。

2.2.3 TSD HJ 和DJ 樣品成分鑒定及歸屬 采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/ΜS 技術(shù)對TSD HJ 和DJ樣品的化學(xué)成分進(jìn)行分析，為盡可能多的對成分進(jìn)行定性分析，常見離子模式為[Μ＋H]+、[Μ－H]-、[Μ＋COOH]-，因此，在正、負(fù)離子模式下總離子流圖見圖1。根據(jù)一級質(zhì)譜所得質(zhì)荷比與二級特征碎片離子信息，通過分析沒食子酸、5-羥甲基糠醛、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 共9 個(gè)混合對照品的母離子和二級碎片離子，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)信息[13-18]，初步鑒定出HJ 和DJ 樣品中31 種化學(xué)成分，二者在成分種類上沒有差異；并對其藥材來源進(jìn)行了歸屬，結(jié)果表明，化學(xué)成分的主要藥材來源分別為11 種化合物來自當(dāng)歸和川芎，7 個(gè)化合物來自紅花，5 種化合物來自白芍，3 種化合物來自熟地黃，2 種化合物來自桃仁，另外4 種成分屬于共有成分，所鑒定出的化合物詳細(xì)信息見表1。

表1 TSD HJ 和DJ 樣品化學(xué)成分質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)Table 1 Mass spectrometry identification data of chemical components in HJ and DJ of TSD

圖1 正、負(fù)離子模式下TSD HJ 和DJ 樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of TSD HJ and DJ samples in positive (ESI+) and negative (ESI-) ion modes

2.2.4 代表性化合物質(zhì)譜裂解分析過程 TSD 主要含有9 個(gè)苯酞類、7 個(gè)酚酸類、7 個(gè)黃酮類、5 個(gè)糖苷類、2 個(gè)苯丙素類和1 種呋喃類成分，其中有機(jī)酸類化合物主要以負(fù)離子模式為主，其離子峰形式為[Μ－H]-，在二級質(zhì)譜中主要發(fā)生CO2或H2O分子的中性丟失，易形成[Μ－H－CO2]-或[Μ－HH2O]-碎片離子[19]，苷類成分主要在二級質(zhì)譜中脫苷形成苷元等特性[20]。本研究以羥基紅花黃色素A的裂解規(guī)律為例，以此方式推測其余多種化合物的結(jié)構(gòu)鑒定過程。

化合物5，保留時(shí)間為7.52 min，通過對照品比對鑒定為羥基紅花黃色素A（來源于紅花），化學(xué)式為C27H32O16，準(zhǔn)分子離子峰為m/z611.163 8 [ΜH]-，通過失去1 分子-C4H8O4的基團(tuán)離子得m/z491.120 5 [Μ－H]-，在失去1 分子-C4H8O4和1 分子水（H2O）得到m/z325.072 2 [Μ－H]-的碎片，由此在失去1 分子-C8H8O 基團(tuán)從而裂解得到m/z205.014 0 [Μ－H]-和m/z119.049 6 [Μ－H]-的碎片。另外，碎片離子為m/z403.103 4 [Μ－H]-由準(zhǔn)分子離子峰失去1 分子-C6H10O5、1 分子CO 以及1 分子水的基團(tuán)離子所得，再失去1 分子-C4H8O4后，碎片為m/z283.061 9 [Μ－H]-，最后裂解得到m/z163.003 1 [Μ－H]-、m/z119.049 2 [Μ－H]-的離子碎片。因此，這些離子碎片可以用來區(qū)別和鑒定羥基紅花黃色素A 化合物，詳細(xì)裂解過程見圖2。

圖2 羥基紅花黃色素A 二級譜圖以及裂解規(guī)律Fig.2 Secondary spectra of hydroxysafflor yellow A and cracking patterns

2.3 基于多指標(biāo)成分定量測定的TSD HJ 和DJ 質(zhì)量差異評價(jià)

2.3.1 色譜條件 沒食子酸、5-羥甲基糠醛、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 9 種指標(biāo)成分的含量測定，結(jié)合其最佳吸收波長，按照前期課題組已經(jīng)建立的多波長切換法多成分含量測定方法條件檢測[9]，色譜圖見圖3。理論塔板數(shù)以各檢測成分峰計(jì)算均大于10 000。

圖3 切波長法測定TSD HJ 和DJ 樣品中9 種成分Fig.3 Nine components contents in HJ and DJ of TSD sample determined by cutting wavelength method

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.4”項(xiàng)下混合對照品溶液，分別稀釋0、2、4、8、16、32 倍，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以各成分對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各成分回歸方程。結(jié)果分別為沒食子酸Y＝1.378 9X－0.120 1，r＝0.999 7，線性范圍1.323 7～42.360 0 mg/L；5-羥甲基糠醛Y＝1.273 2X－0.043 1，r＝0.999 6，線性范圍0.64～20.48 mg/L；綠原酸Y＝0.384 8X－0.345 5，r＝0.999 9，線性范圍1.375～44.000 mg/L；芍藥內(nèi)酯苷Y＝0.075 6X＋0.000 2，r＝0.999 9，線性范圍2.365～75.680 mg/L；羥基紅花黃色素AY＝0.134 3X－0.402 1，r＝0.999 9，線性范圍3.81～121.92 mg/L；芍藥苷Y＝0.253 5X－0.644 5，r＝0.999 6，線性范圍8.843 7～283 mg/L；阿魏酸Y＝1.048 2X－0.123 3，r＝0.999 7，線性范圍2.005～64.160 mg/L；毛蕊花糖苷Y＝0.279 4X－0.029 8，r＝0.999 7，線性范圍0.728 1～23.300 0 mg/L；洋川芎內(nèi)酯IY＝0.638 4X－0.032 3，r＝0.999 6，線性范圍1.147 5～36.720 0 mg/L。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1.4”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算沒食子酸、5-羥甲基糠醛、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 峰面積的RSD 分別為0.23%、0.52%、0.10%、0.16%、0.26%、1.19%、0.10%、0.09%、0.08%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批次樣品（TSD HJ），按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果沒食子酸、5-羥甲基糠醛、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 的RSD依次為0.28%、0.25%、0.51%、0.28%、0.52%、0.25%、0.30%、1.0%、1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（TSD HJ），分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果沒食子酸、5-羥甲基糠醛、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 峰面積的RSD分別為0.65%、0.87%、1.68%、0.72%、1.24%、0.63%、0.33%、0.74%、0.35%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次樣品（TSD HJ）6 份，分別精密稱取約0.2 g，置10 mL 量瓶中，分別按已測定含量的100%加入沒食子酸、5-羥甲基糠醛、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 9 種對照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算各指標(biāo)成分的回收率。結(jié)果9 種指標(biāo)成分的平均加樣回收率分別為99.3%、98.7%、99.5%、98.8%、99.0%、99.6%、98.5%、98.0%、99.0%，RSD 分別為1.2%、0.9%、1.4%、1.0%、0.7%、0.9%、1.1%、1.5%、1.3%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.3.7 TSD DJ 與HJ 基準(zhǔn)樣品中9 種指標(biāo)性成分含量差異對比 采用已建立的指標(biāo)成分含量測定方法測得HJ 樣品和DJ 樣品中指標(biāo)成分的含量見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍藥苷、羥基紅花黃色素A、芍藥內(nèi)酯苷含量平均值在TSD 樣品中較高；并對比HJ 和DJ樣品，發(fā)現(xiàn)DJ 樣品中，芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷3 種成分平均含量稍低于HJ 樣品，沒食子酸、5-羥甲基糠醛、綠原酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 6 種成分平均含量稍高于HJ 樣品。進(jìn)一步通過SPSS 22.0 軟件分析HJ 與DJ 樣品中9 種成分平均含量數(shù)據(jù)之間的差異，以9 種成分含量為變量，對所有DJ 與HJ 樣品進(jìn)行分組，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組間兩兩比較采用最小顯著性差異（LSD）法檢驗(yàn)（P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），結(jié)果表明，HJ 樣品中9 種成分含量與DJ樣品中相應(yīng)成分含量無顯著性差異，說明HJ 與DJ對9 種成分的平均含量結(jié)果無影響。

表2 TSD HJ 和DJ 樣品中9 種指標(biāo)成分的平均含量 (n=3)Table 2 Average contents of nine components in HJ and DJ samples of TSD (n=3)

2.4 TSD HJ 與DJ 樣品干膏得率差異分析

根據(jù)前期課題組對單味藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑干膏得率的研究基礎(chǔ)[21]，取TSD 合煎和各飲片單煎濃縮液200 mL，冷凍干燥，稱取浸膏質(zhì)量，根據(jù)如下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)煎液的干膏得率，結(jié)果見表3，HJ 樣品的平均干膏得率為46.64%，DJ 樣品的平均干膏得率47.08%，TSD 基準(zhǔn)樣品在合煎之后干膏得率雖有所降低，但二者差異不大。

表3 TSD HJ 和DJ 樣品的干膏得率 (n=3)Table 3 Dry paste yield of TSD HJ and DJ samples (n=3)

干膏得率＝干膏質(zhì)量/飲片質(zhì)量

2.5 基于大鼠急性痛經(jīng)模型評價(jià)TSD 合煎與單煎基準(zhǔn)樣品的核心藥效差異性研究

2.5.1 大鼠急性痛經(jīng)模型的建立及給藥 60 只SD雌性大鼠（體質(zhì)量180～220 g），經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為5 組（n＝6 只/組）：對照組、模型組、陽性組、TSD HJ 組、TSD DJ 組。根據(jù)文獻(xiàn)資料查閱及課題組前期預(yù)試驗(yàn)，建立苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素所致急性痛經(jīng)模型[22]。除對照組外，其余4 組均每日sc 苯甲酸雌二醇（10 mg/kg），連續(xù)4 d。在第4 天，陽性藥組ig 給予塞來昔布溶液36 mg/kg，TSD HJ 組、TSD DJ 組按照等效臨床劑量的3 倍，分別以5.47、5.52 g/kg 的凍干粉ig 給藥（分別稱量“2.1.1 和2.1.2”項(xiàng)下凍干粉加入生理鹽水配制給藥液），對照組和模型組ig 等體積生理鹽水，持續(xù)4 d，實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食不禁水。于第7 天末次結(jié)束給藥后的30 min，各組分別ip 催產(chǎn)素20 U/kg。

2.5.2 統(tǒng)計(jì)分析 通過SPSS 22.0 軟件分析多組數(shù)據(jù)之間的差異，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；多組間兩兩比較采用最小顯著性差異（LSD）法檢驗(yàn)。

2.5.3 檢測指標(biāo)及結(jié)果分析

（1）扭體潛伏期、扭體次數(shù)及扭體抑制率比較：ip 催產(chǎn)素后立即計(jì)時(shí)，記錄大鼠第1 次發(fā)生扭體的時(shí)間，即為扭體潛伏期。并記錄從第1 次扭體反應(yīng)后30 min 內(nèi)各組大鼠扭體次數(shù)，計(jì)算扭體抑制率。結(jié)果表明，與對照組相比較，模型組大鼠的扭體潛伏期顯著縮短（P＜0.01），扭體次數(shù)顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組、TSD HJ 組和TSD DJ 組大鼠扭體潛伏期明顯增加（P＜0.01），扭體次數(shù)明顯減少（P＜0.05、0.01）。其中TSD HJ 組與TSD DJ 組相比，二者在大鼠扭體反應(yīng)抑制率較無明顯差異。結(jié)果見表4。

表4 TSD HJ 與DJ 對急性痛經(jīng)模型大鼠扭體反應(yīng)的比較(±s,n=5)Table 4 Comparison writhing response of HJ and DJ in TSD based on acute dysmenorrhea model rats (±s,n=5)

表4 TSD HJ 與DJ 對急性痛經(jīng)模型大鼠扭體反應(yīng)的比較(±s,n=5)Table 4 Comparison writhing response of HJ and DJ in TSD based on acute dysmenorrhea model rats (±s,n=5)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 ##P＜0.01 vs model group;“-”marked with no data扭體抑制率＝1－給藥組扭體次數(shù)/模型組扭體次數(shù)

組別 扭體潛伏期/min 扭體次數(shù)/次 扭體反應(yīng)抑制率/%對照 30 0-模型 7.48±1.65** 14.17±3.67** 0陽性 13.32±2.21## 5.83±2.03# 58.86 HJ 10.81±1.59## 6.33±4.27# 55.32 DJ 10.60±0.91## 6.50±3.86## 54.13

（2）大鼠血清中PGF2α、PGE2、VEGF 與子宮勻漿中ET-1、Ca2+以及NO 含量的測定：大鼠在觀察扭體后進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈采血，并收集左側(cè)同段子宮。全血室溫下靜止2 h 后，3000 r/min 離心10 min，取上清液-20 ℃保存?zhèn)溆?，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清中PGF2α、PGE2、VEGF 含量。同時(shí)，精確稱取適量子宮樣本，用預(yù)冷PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）液沖洗子宮，剪碎子宮組織，將組織與相應(yīng)體積的PBS（按1∶9 質(zhì)量體積比）放入勻漿器里，放置冰上研磨，勻漿后取上清液用于ELISA法檢測組織中ET-1、Ca2+以及NO 含量。結(jié)果表明，與對照組比較，模型組大鼠血清中PGF2α、PGE2、VEGF 與子宮組織中ET-1、Ca2+、NO 水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，陽性組、TSD HJ 組和TSD DJ 組各因子水平含量顯著降低（P＜0.05、0.01），其中TSD HJ 組各因子的水平與TSD DJ 組相比較，總體差異不大。結(jié)果見表5。

表5 TSD 合煎與單煎對急性痛經(jīng)模型大鼠血清和子宮組織因子水平的對比 (±s,n=5)Table 5 Results of serum and uterine tissue factor levels of acute dysmenorrhea model rats by combined and single decoction of TSD (±s,n=5)

表5 TSD 合煎與單煎對急性痛經(jīng)模型大鼠血清和子宮組織因子水平的對比 (±s,n=5)Table 5 Results of serum and uterine tissue factor levels of acute dysmenorrhea model rats by combined and single decoction of TSD (±s,n=5)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 ##P＜0.01 vs model group

組別 血清 子宮組織PGE2/(pg·mL-1) PGF2α/(pg·mL-1) VEGF/(pg·mL-1) Ca2+/(μg·mL-1) ET-1/(pg·mL-1) NO/(μmol·L-1)對照 236.40±14.66 143.79±14.72 289.56±31.11 18.87±2.06 74.79±11.75 11.19±1.34模型 386.18±24.79** 274.14±12.00** 444.42±32.83** 33.24±1.82** 120.73±9.21** 22.86±2.55**陽性 259.91±23.46## 191.31±18.20## 318.64±30.3## 20.97±1.74## 82.42±6.20## 13.98±2.17##HJ 311.66±31.32## 228.26±20.38## 348.37±20.93## 24.08±1.49## 92.18±5.88## 17.13±1.85##DJ 347.92±24.66# 250.45±9.65## 378.55±24.56## 27.67±1.70## 107.38±7.96# 18.45±1.78##

（3）HE 染色觀察大鼠子宮組織病理情況：取血后處死大鼠，分離大鼠子宮組織，使用冰生理鹽水清洗組織表面及腔內(nèi)積血后，用4%中性多聚甲醛溶液浸泡固定，制作HE 染色病理切片，鏡檢，采用HE 染色法觀察子宮上皮細(xì)胞炎癥、水腫等病理變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離各組大鼠子宮時(shí)首先觀察子宮形態(tài)，對照組子宮形態(tài)正常，無水腫，而模型組則出現(xiàn)比較嚴(yán)重的水腫與出血，形態(tài)扭曲，給藥組有輕微的水腫。進(jìn)一步通過病理學(xué)組織分析，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組主要顯示子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞變性或壞死，固有層水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤，固有層腺體數(shù)量減少，肌層平滑肌細(xì)胞排列紊亂。與模型組相比，給藥組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)趨向正常，炎癥明顯改善，上皮細(xì)胞胞漿空泡化減少，固有層子宮腺體擴(kuò)張明顯改善，結(jié)果見圖4。

圖4 HE 染色觀察大鼠子宮組織病理情況 (HE,×200)Fig.4 Pathological observation of rat uterine tissues by HE staining (HE,× 200)

3 討論

TSD 中6 味中藥復(fù)雜的配伍關(guān)系生動(dòng)地展現(xiàn)該方的養(yǎng)血補(bǔ)血、活血補(bǔ)氣的功效，通過化學(xué)組成以及核心藥效研究，發(fā)現(xiàn)復(fù)方合煎與單煎基準(zhǔn)樣品在化學(xué)成分以及藥效方面未見明顯差異。本研究首先結(jié)合UPLC-Q-Exactive Orbitrap/ΜS 質(zhì)譜分析方法，初步分析鑒定出31 個(gè)共有成分，并對其進(jìn)行藥材來源歸屬，未發(fā)現(xiàn)有新的化合物；進(jìn)一步對其中9種指標(biāo)成分進(jìn)行含量差異，發(fā)現(xiàn)復(fù)方合煎與單煎樣品相比，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A等9 種成分的平均含量無顯著性差異；最后，建立為進(jìn)一步揭示合煎與單煎樣品之間的藥效差異，本實(shí)驗(yàn)建立苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素構(gòu)建大鼠急性痛經(jīng)模型，發(fā)現(xiàn)TSD HJ 與DJ 樣品均具有緩解痛經(jīng)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TSD HJ 與DJ 樣品在化學(xué)成分種類及數(shù)量上基本相同，藥效也基本一致，但其成分的含量變化有所不同，可能與自身發(fā)生受熱分解、結(jié)合、沉降等理化反應(yīng)有關(guān)，亦或受煎煮、濃縮、干燥等各個(gè)制備工藝環(huán)節(jié)影響[5,23]。芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A、沒食子酸、阿魏酸、五羥甲基糠醛、洋川芎內(nèi)酯I 受合煎、單煎的直接影響，然而綠原酸、毛蕊花糖苷2 種成分是否受單煎與合煎影響還有待繼續(xù)研究?？梢?，化學(xué)組分的變化在量化TSD 復(fù)方制劑“藥味合煎”與單味藥配方顆?！皢渭寤旌稀钡幕A(chǔ)性研究具有十分重要的意義。

3.1 復(fù)方合煎后中藥組分含量稍有增加

芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基紅花黃色素A 經(jīng)過合煎之后成分含量稍有增加。通過查閱大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)芍藥苷作為白芍的主要有效成分，由于結(jié)構(gòu)中含有糖苷鍵與苯甲酸酯鍵[24]，使其在水提過程中溶出率增高，從而增加了芍藥苷在水中的溶解度，田祥琴等[6]通過研究補(bǔ)陽還五湯合煎與分煎，發(fā)現(xiàn)芍藥苷的含量合煎是單煎的6 倍，可見芍藥苷具有良好的水溶性特點(diǎn)；芍藥內(nèi)酯苷是芍藥苷的同分異構(gòu)體，有研究發(fā)現(xiàn)[25]，經(jīng)過短時(shí)間的煎煮可以有效提高芍藥內(nèi)酯苷的含量，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致；羥基紅花黃色素A 屬于熱不穩(wěn)定性黃酮類成分，在制備過程中成分易受損失，但亦有研究表明[26]在紅花與桃仁的經(jīng)典配伍藥對下，羥基紅花黃色素A 的提取轉(zhuǎn)移率無顯著性影響，本研究羥基紅花黃色素A 含量稍有增加可能與合煎過程中成分的相互作用，抑制了羥基紅花黃色素A 的分解?？梢姵煞值暮吭黾优c自身的結(jié)構(gòu)密切關(guān)聯(lián)，還與用藥配伍環(huán)境有關(guān)。

3.2 復(fù)方合煎后中藥組分含量稍有降低

合煎后，沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、五羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 等代表性成分含量降低，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。通過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)。阿魏酸、沒食子酸屬于桂皮酸、苯甲酸類成分，作為大多數(shù)有機(jī)合成的前體化合物[8]，同時(shí)，受熱易分解，同時(shí)單煎到合煎的過程中又受到了配伍合煎的影響，上述前體化合物的溶出量在合煎體系中較易分解而有所降低，比如阿魏酸存在順反式結(jié)構(gòu)，反式較順式更穩(wěn)定，猜測可能合煎體系導(dǎo)致了反式阿魏酸含量增加，順式阿魏酸降低；5-羥甲基糠醛作為一種在高溫或弱酸等條件下由單糖產(chǎn)生的糠醛化合物，在中藥配伍及復(fù)方變化中溶出量減少，朱敏等[25]考察不同組合四物湯，發(fā)現(xiàn)藥對、藥組和全方中5-HΜF(xiàn) 含量均低于單味藥熟地黃，說明四物湯合煎及其藥對的配伍具有抑制5-HΜF(xiàn) 成分溶出的作用；洋川芎內(nèi)酯I 屬于苯酞類揮發(fā)性成分，加熱等過程會(huì)降低其成分的含量，使其分解[27]。

特別地，毛蕊花糖苷一般煎煮后含量有所降低，袁曉旭等[28]研究熟地黃與澤瀉、郁金三藥合煎對熟地黃中毛蕊花糖苷煎出量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合煎后毛蕊花糖苷煎出量稍微有所降低，而本研究中毛蕊花糖苷平均含量基本不變；綠原酸作為一種常見的有機(jī)酸，大多數(shù)研究者[29]發(fā)現(xiàn)綠原酸合煎后含量增加或基本不變，而本實(shí)驗(yàn)合煎樣品相較于單煎樣品的平均含量降低，由此可知，毛蕊花糖苷和綠原酸不受合煎與單煎體系的影響，造成含量變化的因素復(fù)雜多樣?？梢姡鲜龀煞衷诤霞弩w系中更容易分解或受抑制導(dǎo)致含量降低，也為中藥復(fù)方制劑“復(fù)方合煎”與中藥配方顆?！八幬秵渭濉敝写嬖趶?fù)雜的化學(xué)成分變化過程提供參考，但具體影響因素也有待深入細(xì)化研究。

3.3 展望

TSD 作為經(jīng)典名方代表方之一，以治療痛經(jīng)為主的臨床應(yīng)用十分廣泛，通常以TSD 為基礎(chǔ)方復(fù)方合煎，根據(jù)具體癥狀辨證加減用藥，如若氣滯重者加用柴胡、香附等以疏肝理氣；若寒濕甚者加艾葉、干姜等以溫經(jīng)散寒止痛；若氣血虛弱者加黃芪、黨參以益氣化瘀止痛[30-31]，可見，臨床患者病證復(fù)雜多樣，往往需要辨證論治、臨方調(diào)劑，同時(shí)也其攜帶、儲存等諸多不便利。而單味藥配方顆粒作為中藥湯劑的改良劑型，具有免除煎煮、服用便捷、質(zhì)量可控的特點(diǎn)，并且2021年4月國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)并已正式頒布首批160 個(gè)中藥配方顆粒國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[32]，單味藥配方顆粒的推廣與應(yīng)用為我國實(shí)現(xiàn)經(jīng)典名方現(xiàn)代化提供了一條新的可行路徑，在未來復(fù)方合煎的經(jīng)典名方發(fā)展方向上將發(fā)揮至關(guān)重要的作用。但“復(fù)方合煎”的古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑和“藥味單煎混合”的中藥配方顆粒在化學(xué)成分、核心藥效以及臨床應(yīng)用方面是否一致的問題成為現(xiàn)階段應(yīng)當(dāng)解決和研究的難點(diǎn)。本研究在探討TSD“復(fù)方合煎”與“藥味單煎”時(shí)，從化學(xué)組成與核心藥效角度深入分析合煎與單煎的差異性，還應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合臨床應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)TSD 臨床療效的加減辨證治療。古代經(jīng)典名方復(fù)方制劑和中藥配方顆粒作為對傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的創(chuàng)新發(fā)展，因此，古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑加減配伍中藥配方顆粒的使用，既保證中醫(yī)藥辨證施治整體傳統(tǒng)特色和經(jīng)典名方的療效優(yōu)勢，又可增強(qiáng)經(jīng)典名方用藥的靈活性，方便醫(yī)生臨方調(diào)劑、加減化裁，實(shí)現(xiàn)“一人一方”的個(gè)性化治療模式，讓中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑結(jié)合中藥配方顆粒以更優(yōu)質(zhì)的質(zhì)量與療效長久持續(xù)服務(wù)于臨床，以期深入實(shí)踐并探索經(jīng)典名方復(fù)方制劑加減配伍中藥配方顆粒的臨床應(yīng)用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突