萬玲娟，周廣芬，王繼龍，魏舒暢*，李真真，冉 鑫，何紅杰

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000

2.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東 淄博 255011

祖師麻Daphnes Giraldii Cortex始載于《陜西中藥志》[1]，具有祛風(fēng)除濕、散瘀止痛之功效，臨床常用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛。祖師麻中的主要化學(xué)成分為香豆素類、二萜類、木脂素類等，以祖師麻甲素為代表的香豆素類具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓、抗凝血等藥理作用[2]。本實(shí)驗(yàn)所制備的祖師麻凝膠貼膏劑（Daphnes Giraldii Cortexgel plaster，DGCGP）所用基質(zhì)為一種后交聯(lián)親水性貼膏基質(zhì)，該基質(zhì)不含水分、載藥量大、無過敏性、可反復(fù)揭貼，由于基質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生在制劑使用過程中，很好地克服了巴布膏生產(chǎn)時交聯(lián)速度難控制的缺點(diǎn)[3]。載藥量是DGCGP 成型過程中的最關(guān)鍵參數(shù)之一，決定著制劑成型工藝的成敗。本實(shí)驗(yàn)在前期研究確定的基質(zhì)組成基礎(chǔ)上，比較了不同載藥量下膠料的流變學(xué)特性變化，并采用Strat-ΜTΜ人工膜對成品貼膏進(jìn)行了體外經(jīng)皮滲透特性研究，本研究結(jié)果可為后交聯(lián)祖師麻凝膠貼膏劑的載藥量確定提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀，美國沃特世公司；RYJ-12B 型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；LC-XTG-1000 連續(xù)式熱熔膠涂布貼合試驗(yàn)機(jī)，上海立芩機(jī)械設(shè)備有限公司；NH-1D實(shí)驗(yàn)用捏合機(jī)，南通福斯特機(jī)械制造有限公司；安東帕ΜCR302高級流變儀，奧地利安東帕有限公司；YP1002N 電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料

卡波姆940（批號20190502），廣州康喬漢普藥業(yè)有限公司；聚維酮 K90（PVP K90，批號18528456P0），德國巴斯夫化工集團(tuán)有限公司；聚乙二醇400（PEG400，批號20180601）、丙二醇（批號20180510），江西益普生藥業(yè)有限公司；祖師麻流浸膏（批號20180301），甘肅泰康制藥有限責(zé)任公司。

祖師麻甲素對照品，批號110900-200405，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以98.8%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院；默克密理博Strat-ΜTΜ膜，上海必泰生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DGCGP 膠料的制備方法

中藥浸膏的加入會嚴(yán)重影響凝膠基質(zhì)的黏彈性能，加入量多則貼膏易爛膏、滲布，量少則無法保證藥效[4]。本實(shí)驗(yàn)分別對載藥量為4.0%、6.8%、9.6%、12.4%（S1～S4）的膠料進(jìn)行考察，以確定后交聯(lián)凝膠基質(zhì)的最佳載藥量。膠料制備過程如下：準(zhǔn)確稱取處方量的PVP K90 和卡波姆940 等以等量遞增法混勻，得固體組分；準(zhǔn)確稱取處方量的PEG400、丙二醇和不同量祖師麻流浸膏混勻，得到一組藥量不同的液體組分。設(shè)定捏合機(jī)溫度、攪拌槳轉(zhuǎn)速及混合時間，加入液體及固體組分混合。將混合好的膠料取部分樣密封，在流變儀上測試相關(guān)參數(shù)。其余膠料經(jīng)涂布、切割制成一組含藥量不同的貼膏，密封，室溫下放置備用。

2.2 相關(guān)流變學(xué)指標(biāo)的選擇

2.2.1 彈性模量（elastic modulus，G′）和黏性模量（viscosity modulus，G″） 彈性模量反映膠料的彈性特征；黏性模量反映膠料的黏性特征。

2.2.2 復(fù)合模量（complex modulus，G*） 復(fù)合模量G*＝(G′2＋G″2)1/2，表征膠料抵抗切應(yīng)變的能力，能反映膠料的交聯(lián)程度、硬度及柔順性等[5-6]。

2.2.3 高頻率與低頻率下彈性模量的比值（G，G＝G′ω=100/G′ω=0.1）G值與剝離強(qiáng)度負(fù)相關(guān)，比值越小，剝離強(qiáng)度越大，膠料的黏接力越強(qiáng)[7-8]。貼膏貼于皮膚是一個低速的過程，此時貼膏應(yīng)有一定的初黏性，低頻下具有較高G″值的貼膏，初黏力更大。

2.2.4 蠕變?nèi)崃浚↗(t)）及蠕變回復(fù)率（J(t)%）J(t)是與時間相關(guān)的物理常數(shù)，它能表明膠料的柔性；J(t)%表示的是回復(fù)的應(yīng)變與最大應(yīng)變的比值×100，反映膠料變形后的回復(fù)程度，回復(fù)率越大，貼膏皮膚追隨性越好，在使用過程中越穩(wěn)定。

2.2.5 屈服應(yīng)力（yield stress，τ） 在材料拉伸或壓縮過程中，當(dāng)應(yīng)力達(dá)到一定值時，應(yīng)力有微小的增加，而應(yīng)變卻急劇增長的現(xiàn)象稱為屈服，使材料發(fā)生屈服時的正應(yīng)力就是材料屈服應(yīng)力[9]。

2.2.6 損耗系數(shù)（tanδ，tanδ＝G″/G′） 也稱正切損耗角，表示聚合物分子鏈段在運(yùn)動時受到內(nèi)摩擦力的大小[10]。

2.3 膠料的流變學(xué)特性考察

采用安東帕ΜCR302 高級流變儀，在接近人體體表溫度（32.0±0.1）℃下測試。選用轉(zhuǎn)子為PP25 SN56550，夾具間距設(shè)定為1 mm。

2.3.1 振幅掃描 動態(tài)振蕩試驗(yàn)都需要在線性黏彈區(qū)（linear viscoelastic region，LVR）內(nèi)進(jìn)行，LVR即樣品的模量不隨剪切應(yīng)力或應(yīng)變的變化而改變的區(qū)域。在應(yīng)變?yōu)?.01%～100%，頻率為1 Hz 的條件下，進(jìn)行振幅掃描，得到圖1。從圖1可得，S2膠料的LVR 最大，說明其穩(wěn)定性最大，受到剪切時結(jié)構(gòu)不易被破壞。4 種膠料LVR 的最大剪切應(yīng)力值（tau）由大到小分別為S2＞S3＞S1＞S4，具體數(shù)據(jù)見表1。

圖1 振幅掃描曲線Fig.1 Amplitude sweep curve

2.3.2 頻率掃描 振蕩模式下，在LVR 內(nèi)選應(yīng)變（γ）為1%，角頻率（ω）為100～0.1 rad/s，進(jìn)行頻率掃描，得到圖2。由圖2可知，無論是G″ω=0.1或是G′ω=100，S2 膠料的值均是最大的，說明其初黏力、剝離強(qiáng)度及內(nèi)聚力最好。具體數(shù)據(jù)見表1。

圖2 頻率掃描曲線Fig.2 Frequency sweep curve

表1 不同載藥量膠料的tau、G＊、G″ω=0.1、G、J(t)、J(t)%及τ 值Table 1 Tau,G＊,G″ω=0.1,G,Jt,Jt% and τ values of adhesive with different drug loading

2.3.3 不同溫度下膠料tanδ值的測定 動態(tài)模式下，在固定頻率1 Hz，應(yīng)變1%，溫度25～85 ℃的條件下，進(jìn)行溫度掃描（圖3）。隨著溫度升高，膠料的G′和G″均不斷下降，tanδ值不斷升高，這是由于溫度升高，分子熱運(yùn)動程度加劇，高分子鏈之間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞造成的。由圖可得S2 膠料的耐溫性最好。

圖3 溫度掃描曲線Fig.3 Temperature sweep curve

2.3.4 蠕變測試 根據(jù)膠料的LVR 設(shè)定測試應(yīng)力為200 Pa，施加應(yīng)力時間為300 s，回復(fù)時間600 s，得到Jt隨時間的變化曲線（圖4）。S2 膠料的Jt值最小，說明其不易發(fā)生形變，保型性好；Jt%值也最大，說明其形變回復(fù)性能好，具體Jt及Jt%值如下表1所示。

圖4 蠕變?nèi)崃侩S時間的變化圖Fig.4 Variation of creep compliance with time

2.3.5 旋轉(zhuǎn)模式下的τ測定τ能夠反映膠料的抗變形能力，具有較高τ值的貼膏抗變形性能更強(qiáng)。設(shè)剪切應(yīng)力范圍為1～1000 Pa，測定τ，得到圖5，黏度（η）不再增加時對應(yīng)的應(yīng)力為τ。S2 膠料的τ值最大，剛性最強(qiáng)，具體數(shù)據(jù)見表1。

圖5 屈服應(yīng)力測試曲線Fig.5 Yield stress test curve

2.4 體外透皮試驗(yàn)及參數(shù)計(jì)算[11-13]

2.4.1 透皮擴(kuò)散試驗(yàn)用滲透介質(zhì) 選擇Strat-ΜTΜ人工膜進(jìn)行DGCGP 中活性成分祖師麻甲素的體外擴(kuò)散試驗(yàn)。

2.4.2 體外透皮吸收試驗(yàn)測定 取貼膏剪成大小與供給池相同的圓片，貼于Strat-ΜTΜ膜上，將Strat-ΜTΜ膜固定于供給池與接收池之間。接收池內(nèi)加入8 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液（pH 7.4），排除皮膚與接收池間的氣泡，在恒溫（32.0±0.5）℃、轉(zhuǎn)速500 r/min 下啟動并計(jì)時。在設(shè)定時間2、4、6、8、10、12、24、30、36、48 h 分別從接收池取樣2 mL，并立即補(bǔ)充等體積32 ℃接收液。取出樣品用0.22 μm 微孔濾膜濾過后用HPLC 法測定各時間祖師麻甲素質(zhì)量濃度。

2.4.3 單位面積累積滲透量（Qn）測定 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按下式計(jì)算Qn。

A為有效擴(kuò)散面積（2.2 cm2），V為接受室容積（8 mL），Vi為每次取樣體積，Cn為第n次取樣時接收液中的藥物質(zhì)量濃度（μg/mL），Ci為第i次取樣時接收液中的藥物質(zhì)量濃度（μg/mL）

以時間t（h）為橫坐標(biāo)，Qn（μg/cm2）為縱坐標(biāo)，制作曲線，對曲線中的直線部分進(jìn)行回歸分析，得Qn-t方程，其斜率即為藥物的穩(wěn)態(tài)滲透速率［J，μg/(cm2·h)］。

2.4.4 皮膚滯留率（Qs）和累積透過率（Q）測定 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下皮膚，用生理鹽水洗凈，剪碎給藥部分，加一定量的甲醇超聲后離心，取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，測定祖師麻甲素含量，按公式計(jì)算Qs；用同樣的方法處理給藥貼膏并按公式計(jì)算Q。

Qs＝V1C1/VC

Q＝AQn/VC

V1為皮膚提取液總體積，C1為皮膚提取液中祖師麻甲素的質(zhì)量濃度，V為給藥貼膏提取液總體積，C為給藥貼膏提取液中祖師麻甲素的質(zhì)量濃度

2.5 樣品測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Waters Symmebry-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動相為0.1%磷酸水溶液-甲醇（68∶32）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長327 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取祖師麻甲素對照品5.92 mg，置25 mL 量瓶中，加85%甲醇溶解并定容，得到祖師麻甲素對照品儲備液。

2.5.3 供試品溶液的制備 按“2.4.2”項(xiàng)下在設(shè)定時間取接收液2 mL，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.5.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對照品及供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果顯示樣品中祖師麻甲素分離度良好（圖7），與其相鄰色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以祖師麻甲素峰面積計(jì)算不低于3000。

圖7 祖師麻甲素對照品溶液 (A) 和后交聯(lián)祖師麻凝膠貼膏經(jīng)皮滲透接收液 (B) 的HPLC 圖Fig 7 HPLC of daphnetin reference substance (A) and transdermal receiving fluid post-crosslinking Daphnes Giraldii Cortex gel paster percutaneous penetration (b)

2.5.5 線性關(guān)系考察 精密吸取上述祖師麻甲素對照品儲備液，逐步稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.95、2.37、4.74、5.92、11.84、23.68 μg/mL 的對照品溶液，分別吸取10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作回歸曲線，得祖師麻甲素回歸方程Y＝40.965X－12.575，r＝0.999 7，祖師麻甲素在0.95～23.68 μg/mL 呈良好的線性關(guān)系。

2.5.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算得祖師麻甲素峰面積的平均RSD值為2.13%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下48 h 的透皮接收液作為供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定，結(jié)果峰面積的平均RSD 值為2.74%，表明該供試品溶液在室溫條件24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下的透皮接收液適量共6 份，進(jìn)樣測定。計(jì)算得祖師麻甲素質(zhì)量濃度的平均RSD 為2.31%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗(yàn) 取己測定的透皮接收液分別精密加入80%、100%、120%的祖師麻甲素對照品溶液，每個質(zhì)量濃度制備3 份樣品，按“2.5.1”項(xiàng)色譜條件測定并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，各質(zhì)量濃度的平均加樣回收率分別為96.9%、99.0%、101.3%，RSD 分別為2.47%、1.69%、2.28%。

2.6 結(jié)果分析

由表1可知，載藥量升高時，膠料的穩(wěn)定性、抗變形能力、初黏力、剝離強(qiáng)度及耐溫耐剪切性也會明顯提高，當(dāng)載藥量達(dá)到6.8%再增加載藥量時，膠料的各項(xiàng)性能反而下降，故載藥量為6.8%時性能最佳。由表2可知，隨著載藥量提高，祖師麻甲素的滲透系數(shù)及累積透過率也隨之增大，載藥量為12.4%的滲透系數(shù)及累積透過率均最大；載藥量由6.8%增加至9.6%時的累積透過率變化很小，說明增大載藥量對祖師麻凝膠貼膏的經(jīng)皮滲透性沒有顯著促進(jìn)作用。

表2 不同載藥量下祖師麻甲素體外經(jīng)皮滲透的動力學(xué)參數(shù) (n=3)Table 2 Kinetic parameters of daphnetin in vitro transdermal infiltration under different drug loads (n=3)

3 討論

分析流變學(xué)測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)載藥量由4.0%增大到6.8%時，膠料性能增強(qiáng)，但當(dāng)載藥量增加至9.6%甚至12.4%時，其性能又逐步下降。這說明提取物對后交聯(lián)凝膠貼膏的成型及性能影響顯著，分析其原因可能與提取物在凝膠性基質(zhì)中的存在狀態(tài)有關(guān)。祖師麻流浸膏系用乙醇提取，其提取溶劑與后交聯(lián)凝膠貼膏基質(zhì)中的液體組分PEG400、丙二醇等的溶解性能具有一定差異，因此提取物在基質(zhì)中只能部分溶解，當(dāng)載藥量較小時不溶部分作為填充劑又可穩(wěn)定凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，改善基質(zhì)性能，當(dāng)載藥量太高時不溶物會減少高分子間的接觸機(jī)會使物理纏結(jié)點(diǎn)減少，分子鏈間易發(fā)生滑動，造成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)強(qiáng)度減弱，性能下降。

Dahlquist 的黏性標(biāo)準(zhǔn)提出[14]，J(t)＞10-5Pa-1的膠黏劑樣品顯示出了適當(dāng)?shù)募羟袕?qiáng)度性能，本實(shí)驗(yàn)J(t)值均在10-5Pa-1以上，說明利用該基質(zhì)制成的貼膏具有良好的皮膚追隨性，不會溢邊和漏膏。沈瑞雪等[15]認(rèn)為，G值應(yīng)較高，以5＜G＜300 為宜，4批膠料均在范圍內(nèi)；G′值應(yīng)小于3.3×105Pa，否則黏結(jié)性就會消失，本實(shí)驗(yàn)中G′值最大為14 547 Pa，符合要求。以上均說明該基質(zhì)對乙醇提取物有較強(qiáng)的載藥能力，最大載藥量可達(dá)12.4%。但由透皮結(jié)果可知就祖師麻而言載藥量過大會造成原料藥浪費(fèi)，故以6.8%為最佳。

分析體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)測定了DGCGP 48 h 內(nèi)的經(jīng)皮滲透情況（圖6），前12 h 內(nèi)祖師麻甲素的透皮速率較緩，12 h 后則以較高的速率恒速透過皮膚。表明后交聯(lián)凝膠貼膏基質(zhì)在12～48 h 內(nèi)有很好的釋藥性能，且后交聯(lián)凝膠貼膏基質(zhì)吸汗透氣，不妨礙皮膚生理功能，可長時間貼敷，利用該基質(zhì)有利于將祖師麻開發(fā)為長效外用制劑。載藥量與貼膏膠料中的濃度正相關(guān)，載藥量太低會造成藥物透皮速率及釋藥時間不足，載藥量過高會影響貼膏性能。本實(shí)驗(yàn)載藥量由4.0%增加到12.4%時，皮膚滯留率相差不大，但藥物的累積透過率僅增加了1.4倍，增大載藥量的透皮效果并不顯著，綜合流變學(xué)及透皮測試結(jié)果，確定最佳載藥量為6.8%。

圖6 不同載藥量下祖師麻甲素的經(jīng)皮滲透曲線Fig.6 Percutaneous permeability curve of daphnetin under different drug loading

祖師麻甲素為香豆素類化合物極性相對較小，親脂性基質(zhì)對其有較強(qiáng)的滯留作用，釋放能力有限，因此已有文獻(xiàn)對親脂性基質(zhì)制成的制劑進(jìn)行透皮特性考察時都使用含有機(jī)溶劑的接收液[16]。但含有機(jī)溶劑的接受液實(shí)驗(yàn)結(jié)果的與實(shí)際透皮情況相差甚遠(yuǎn)。本實(shí)驗(yàn)所用后交聯(lián)親水凝膠作為基質(zhì)與祖師麻甲素極性相差較大，用PBS 溶液作為接收液即可獲得較好的透皮效果，結(jié)果更具參考價值。

文獻(xiàn)表明，皮膚滲透性大小依次為大鼠皮膚＞豬皮膚＞人皮膚[17]，豬皮比鼠皮更接近人的皮膚，但不易獲得，鼠皮存在批次間差異。本實(shí)驗(yàn)選Strat-ΜTΜ膜作為滲透介質(zhì)，與各種動物皮膚相比，這種人造膜的皮膚滲透性更接近人的皮膚（R2＝0.99）[18]，所得結(jié)果更具有可靠性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突