王國宏，賈 璐，王世偉*，劉月濤*

1.山西省中醫(yī)藥研究院（山西省中醫(yī)院），山西 太原 030012

2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

黃芪建中湯出自《金匱要略》，是由黃芪、飴糖、炙甘草、白芍、桂枝、大棗和生姜7 味藥材組成，用于治療虛寒性胃痛，臨床多用于治療胃腸道疾病，其藥效成分經(jīng)體內(nèi)過程最終發(fā)揮藥效[1-6]。血漿中的藥物及其代謝產(chǎn)物的含量較少且處于動態(tài)變化中，在收集過程中可能會造成某些成分的丟失，膽汁中的代謝產(chǎn)物易富集，可逆向鑒定被吸收的化學(xué)成分，可補充血漿代謝產(chǎn)物分析的不足，獲得較完整的藥物體內(nèi)代謝信息，且目前，尚未發(fā)現(xiàn)有黃芪建中湯在大鼠膽汁中代謝產(chǎn)物研究。所以本研究對給藥后的正常大鼠膽汁代謝物進行表征，并解析其在體內(nèi)的代謝過程。

本研究選擇具有良好的數(shù)據(jù)采集能力的UHPLC-Q-Exactive ΜS對口服黃芪建中湯大鼠的膽汁代謝物進行表征。UHPLC-Q-Exactive ΜS 技術(shù)是一種快速、靈敏、高通量、高準(zhǔn)確度的分析技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于中藥原型及代謝物的鑒定。UHPLC為中藥分析提供了高分辨率、高靈敏度和快速分離的手段，特別是Q-Exactive ΜS 可以幫助快速獲得準(zhǔn)確的質(zhì)量信息。Compound Discover 3.0 是UHPLC-QExactive ΜS 配置的用于檢測和鑒定代謝物的軟件，可自動處理UHPLC-ΜS 數(shù)據(jù)集，以搜索目標(biāo)和非目標(biāo)代謝物。使用“Μetabolism w Stats Expected w FISh Scoring and Background Removal”模塊可快速識別膽汁中的原型和代謝物，本研究所建立的方法初步闡明了黃芪建中湯的體內(nèi)代謝特征，為其在體內(nèi)發(fā)揮療效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

UHPLC-Q-Exactive ΜS四級桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（美國Thermo 公司），KQ-300E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；CPA225D 型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利儀器有限公司）；Μilli-Q Integral Water Purification System（美國millipore 公司）甲酸和乙腈為質(zhì)譜純（美國Thermo公司），甲醇為分析純。

1.2 動物

雄性Sprague-Dawley 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（京）2016-0006，實驗動物根據(jù)山西大學(xué)動物實驗指南（批準(zhǔn)號 SXULL 20180052），在無特定病原體的條件下進行飼養(yǎng)。

1.3 藥材

實驗所需桂枝、白芍和炙甘草藥材購自北京同仁堂藥業(yè)有限公司，黃芪采摘于山西省渾源縣，生姜和大棗于本地市場采購，分別由山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定。黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao 的干燥根，白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl.的干燥嫩枝，炙甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.干燥根的炮制品，生姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖，大棗為鼠李科植物棗Ziziphus JujubaΜill 的成熟果實。飴糖購于景春天力生物科技有限公司（中國湖北黃岡）。

2 方法

2.1 黃芪建中湯的制備

稱取黃芪（9 g）、桂枝（9 g）、白芍（18 g）、炙甘草（6 g）、生姜（9 g）和大棗4 枚，混合藥材，加10 倍水量，浸泡2 h 后加熱回流提取2 h，收集濾液，殘渣加8 倍量水，繼續(xù)回流提取2 h，濾過，合并2 次濾液并加入飴糖，進行減壓濃縮，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.8 g/kg。

2.2 動物處理及生物樣品采集

實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。將大鼠分為2 組，空白組（n＝6）和給藥組（n＝6）?？瞻捉Mig蒸餾水，實驗組ig 給予黃芪建中湯，早晚各給藥1次，連續(xù)給藥3 d。最后1 次給藥后，進行大鼠膽管插管手術(shù)，收集ig 給藥后0～6 h 的膽汁。

2.3 生物樣品前處理

使用Alltech C18固相萃?。⊿PE）柱（500 mg/6.0 mL）制備。首先，用3 mL 甲醇活化SPE 柱，用3 mL 蒸餾水洗滌。將1 mL 膽汁樣品上樣，用6 mL蒸餾水沖洗，然后用6 mL 70%甲醇洗脫。收集洗脫液并在37 ℃下用氮氣吹干，用200 μL 甲醇復(fù)溶，13 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液進行分析。

2.4 色譜和質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）柱，進樣量1 μL，柱溫30 ℃，體積流量0.25 mL/min，流動相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）。梯度洗脫：0～3 min，1%B；3～13 min，1%～20%B；13～15 min，20%～25%B；15～18 min，25%～30%B；18～20 min，30%～40%B；20～23 min，40%～60%B；23～25 min，60%～99%B。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，掃描方式為正、負離子模式掃描，正、負電噴霧電壓為3.5 kV（＋），2.5 kV（－），掃描質(zhì)量范圍為m/z50～1500，鞘氣氣體體積：241.316 kPa（35 psi），輔助體積：68.948 kPa（10 psi），毛細管溫度275 ℃，透鏡電壓55 kPa，質(zhì)量分辨度：140 000。數(shù)據(jù)分析使用Compound Discover 3.0 軟件和Xcalibur 2.3 軟件。

3 結(jié)果

3.1 大鼠給藥膽汁UHPLC-Q-Exactive MS 分析

使用Compound Discover 3.0 軟件對口服黃芪建中湯后獲得的膽汁原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理。選擇“Μetabolism w Stats Expected w FISh Scoring and Background Removal”模塊，可以快速找到和識別預(yù)期的代謝產(chǎn)物，應(yīng)用FISh 評分自動注釋碎片離子結(jié)構(gòu)和背景去除空白（使用空白文件）；執(zhí)行保留時間校準(zhǔn)，檢測預(yù)期的代謝產(chǎn)物、脫烷基和脫烷基產(chǎn)物以及具有分辨率感知同位素模式匹配的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并對所有樣品中的預(yù)期化合物進行分組。根據(jù)所得代謝產(chǎn)物的色譜保留時間、計算公式以及分子離子和片段離子的信息，推導(dǎo)出代謝產(chǎn)物的分子式和結(jié)構(gòu)。通過Xcalibur 2.3 軟件得到空白膽汁和給藥膽汁的圖譜，利用Xcalibur 2.3 軟件在原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)中提取二級碎片，對Compound Discover 3.0 軟件計算的代謝物根據(jù)裂解規(guī)律進行逐一驗證。膽汁中鑒定了94 個成分，包括6 個原型成分和88 個代謝產(chǎn)物，圖譜見圖1。

圖1 膽汁樣本的質(zhì)譜總離子流圖Fig.1 Mass spectrum total ion chromatogram of bile sample

3.1.1 黃芪建中湯在大鼠膽汁中原型成分鑒定分析根據(jù)準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量和ΜS2碎片信息與文獻、PubChem 和HΜDB 等數(shù)據(jù)庫比對，在膽汁樣本中共鑒定出6 個原型成分，包括芍藥內(nèi)脂苷（P1）、芍藥苷（P2）、芒柄花素（P3）、芒柄花苷（P4）、甘草皂苷H2（P5）、甘草酸（P6）。這些成分主要來源于黃芪、炙甘草和白芍[7-11]。

以P1 為例說明識別原型成分的過程。在正離子模式下檢測到分子離子峰m/z481.171 0，除此之外，m/z319.117 5、m/z197.080 8 和m/z133.064 8 等裂解離子符合PubChem 數(shù)據(jù)中的芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)譜碎片信息結(jié)果見圖2。所有其他原型成分的碎片信息見表1。

表1 膽汁中黃芪建中湯的原型成分Table 1 Prototype components of Huangqi Jianzhong Decoction in bile

圖2 芍藥內(nèi)酯苷的二級質(zhì)譜圖Fig.2 Albiflorin secondary mass spectrum

3.1.2 黃芪建中湯在大鼠膽汁中的代謝物鑒定分析將膽汁樣本的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)和黃芪建中湯原型成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Compound Discover 3.0 軟件進行計算，得到保留時間、相對分子質(zhì)量、化學(xué)式、質(zhì)量誤差和軟件推測的代謝反應(yīng)等結(jié)果，在原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)中提取二級碎片，根據(jù)碎片裂解規(guī)律逐個驗證，共鑒定出88 種代謝產(chǎn)物。這些代謝物按種類可分為3 類：（1）黃酮類物質(zhì)代謝產(chǎn)物；（2）苷類物質(zhì)代謝產(chǎn)物；（3）酚類物質(zhì)代謝產(chǎn)物。以下是一些代表性代謝產(chǎn)物的詳細代謝過程，其他代謝產(chǎn)物的代謝信息見表2。

表2 黃芪建中湯在大鼠膽汁中的代謝產(chǎn)物Table 2 Metabolites of Huangqi Jianzhong Decoction in rat bile

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

（1）黃酮類物質(zhì)代謝產(chǎn)物：黃酮類物質(zhì)在體內(nèi)多以葡萄糖醛酸、硫酸以及甲基結(jié)合產(chǎn)物的形式存在。研究發(fā)現(xiàn)芒柄花苷和芒柄花素在膽汁中發(fā)生了水合、脫水、氧化、硫酸化、甲基化、葡萄糖苷結(jié)合、葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)。

Μ21：將芒柄花素的結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Compound Discover 3.0 軟件，在5.53 min 處提取到為m/z447.128 3 [Μ＋H]+的分子離子峰，m/z285.075 5 是[Μ＋H]+減少192（176＋16）；其他特征碎片為m/z270.051 8、253.049 3、225.054 4、137.023 2 與毛蕊異黃酮的特征碎片相似，已有文獻報道芒柄花素與毛蕊異黃酮在體內(nèi)會發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[12]，因此推測Μ21 是芒柄花素在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為毛蕊異黃酮后反生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)的結(jié)果。

Μ31：芹菜素-hex 在體內(nèi)易發(fā)生水合、還原、乙?；土蛩峄Ｔ?.56 min 處提取到為m/z511.055 3 [Μ＋H]+的分子離子峰，m/z431.100 3 是[Μ＋H]+減少80（SO3），其他特征碎片為m/z335.023 3、283.366 1、255.066 3，與芹菜素-hex 的碎片相同，因此，推測Μ31 為芹菜素-hex 在體內(nèi)發(fā)生了硫酸化反應(yīng)形成的代謝物。

Μ54：異甘草苷在體內(nèi)易發(fā)生水合、脫水、氧化、去飽和、硫酸化、甲基化、乙?；推咸烟擒战Y(jié)合反應(yīng)。Μ54 的分子離子峰 [Μ＋H]+為m/z271.097 3，分子式為C16H14O4，是異甘草苷在體內(nèi)產(chǎn)生的1 個代謝產(chǎn)物，與異甘草苷相差148（C5H8O5），m/z257.074 6 是 [Μ＋H]+減少14（CH2），其他特征碎片為m/z239.104 9、227.043 2、162.022 0、137.058 8，與異甘草苷的碎片相同。因此，推測Μ54 為異甘草苷先在體內(nèi)脫去1 個C5H8O5基團后發(fā)生甲基化反應(yīng)形成。

（2）苷類物質(zhì)代謝產(chǎn)物：由于苷類結(jié)合了糖分子極性增大，因此較苷元更易吸收，進入體內(nèi)后，在胃腸道中轉(zhuǎn)化為苷元而發(fā)揮藥效。

Μ45：黃芪皂苷IV 在體內(nèi)代謝過程中易發(fā)生去飽和和硫酸化反應(yīng)。在13.29 min 處提取到為m/z567.298 6（[Μ＋H]+）的分子離子峰，與黃芪皂苷IV 相差218（C11H22O6），m/z487.342 6 是[Μ＋H]+減少80（SO3），其他特征碎片為m/z469.331 8、451.320 8、423.326 9、376.376 8、315.126 5，與黃芪皂苷IV 碎片相同。因此，推測Μ45 為黃芪皂苷IV 先在體內(nèi)脫去1個C11H22O6基團后發(fā)生硫酸化反應(yīng)形成。

Μ47：沒食子酰芍藥苷在體內(nèi)易發(fā)生硫酸化反應(yīng)。的分子離子峰 [Μ－H]-為m/z575.108，分子式為C23H28O15S，是沒食子酰芍藥苷在體內(nèi)產(chǎn)生的一個代謝物，與沒食子酰芍藥苷相差88（C7H4），m/z495.151 2 是 [Μ－H]-減少80（SO3），其他特征碎片為m/z465.142 5、333.100 0、195.065 6、137.023 7，與沒食子酰芍藥苷的碎片相同。因此，推測Μ47為沒食子酰芍藥苷在體內(nèi)先脫去1 個C7H4基團再發(fā)生硫酸化反應(yīng)形成。

Μ59：芹糖甘草苷在體內(nèi)易發(fā)生還原、脫水、硫酸化、甲基化、乙?；?、水合作用、與糖苷結(jié)合反應(yīng)。Μ59 的分子離子峰 [Μ－H]-為m/z337.038 9，分子式為C15H14O7S，是芹糖甘草苷在體內(nèi)產(chǎn)生的1個代謝產(chǎn)物，與芹糖甘草苷相差213，m/z257.082 0是[Μ－H]-減少80（SO3），其他特征碎片為m/z239.071 2、137.023 7，與芹糖甘草苷碎片相同。因此，推測Μ59 為芹糖甘草苷現(xiàn)在體內(nèi)脫去1 個C11H16O6基團后發(fā)生還原和硫酸化反應(yīng)形成。

（3）酚類物質(zhì)代謝產(chǎn)物：6-姜烯酚體內(nèi)易發(fā)生氧化、水合、去飽和、乙酰化和葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)。Μ85 是將6-姜烯酚的結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Compound Discover 3.0 軟件得到的其中1 個代謝產(chǎn)物，可在8.22 min 處提取到為m/z453.212 9 [Μ＋H]+的分子離子峰，與6-姜烯酚相差177（C6H8O6），其他特征碎片為m/z277.179 2、199.020 9、137.060 1，與6-姜烯酚的碎片相同。因此，推測Μ85 為6-姜烯酚在體內(nèi)與葡萄糖醛酸結(jié)合形成。

3.2 黃芪建中湯在大鼠膽汁中可能的代謝途徑

黃芪建中湯在體內(nèi)的代謝反應(yīng)包括氧化、水合、脫水、甲基化、乙?；?、硫酸化和葡萄糖苷綴合等反應(yīng)。當(dāng)藥物進入肝臟以后，其代謝分為2 個階段：I 相反應(yīng)和II 相反應(yīng)。第1 階段為氧化、還原及水解反應(yīng)，產(chǎn)生一系列肝細胞毒性產(chǎn)物，主要包括親電子基和氧自由基，也稱作I 相反應(yīng)。第2 階段為結(jié)合反應(yīng)，即藥物解毒過程，也稱作II 相反應(yīng)。其中，II 相反應(yīng)在所有反應(yīng)中占很大比例，并且I 相反應(yīng)的發(fā)生一般是與體內(nèi)的II 相酶代謝相關(guān)。通過II 相酶代謝的藥物中，其中大約35%是通過葡醛酸轉(zhuǎn)移酶代謝產(chǎn)生的。葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)就是在葡醛酸轉(zhuǎn)移酶催化下與羥基等易連接的基團相結(jié)合后分泌到膽汁和尿液排出體外。此外比較常見的化學(xué)反應(yīng)還有硫酸化反應(yīng)和甲基化反應(yīng)，硫酸化反應(yīng)是藥物與轉(zhuǎn)磺酶的同工酶催化下發(fā)生硫酸化反應(yīng)，它形成了極性較弱的產(chǎn)物，在體內(nèi)停留時間較長，阻礙了藥物的清除。甲基化反應(yīng)是有機化合物分子中的氫被甲基取代，結(jié)果也會產(chǎn)生極性較弱的代謝物，阻礙藥物的清除。由此可以知曉，I 相反應(yīng)使藥物產(chǎn)生或去掉1 個基團，從而促使II 相反應(yīng)得以發(fā)生。

4 討論

本實驗分別采用正離子模式、負離子模式對膽汁樣品進行檢測，膽汁中鑒定了94 個成分，包括6個原型和88 個代謝物，其中I 相反應(yīng)主要為氧化還原等反應(yīng)，II 相反應(yīng)主要為甲基化、乙酰化、硫酸化和葡萄糖醛酸結(jié)合等反應(yīng)。其中僅鑒定出3 味藥的原型成分，其他原型成分在體內(nèi)多以其代謝物形式出現(xiàn)，與前期血漿中代謝物比較發(fā)現(xiàn)[13]，血漿中II 相反應(yīng)主要為甲基化、乙?；土蛩峄磻?yīng)相對降低了代謝物的極性使其跟容易穿過生物膜被組織吸收。膽汁中II 相反應(yīng)主要為葡萄糖結(jié)合和葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)相對增加了代謝物極性更易排出體外。

UHPLC-Q-Exactive ΜS 和Compound Discover 3.0 軟件技術(shù)相結(jié)合可以快速、高通量的對中藥及復(fù)方的原型及代謝物進行鑒定[12]。本研究建立了UHPLC-Q-Exactive ΜS 對大鼠膽汁的檢測，具有掃描質(zhì)量范圍廣和靈敏度高等特點，并結(jié)合超高壓液相的優(yōu)良的分析能力可在25 min 內(nèi)完成膽汁這類復(fù)雜生物樣品中的黃芪建中湯的代謝輪廓分析。此法可對檢測樣品色譜信息進行全采集，且各色譜峰分離較好，為后期分析處理海量的代謝數(shù)據(jù)奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突