柴麗華，宋海龍，馬曉玲，陳 剛，石磊嶺*，魏鴻雁*

1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046

2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002

青龍衣是胡桃科（Juglandaceae）植物落葉喬木核桃楸Juglans mandshuricaΜaxim.未成熟果實(shí)的青色外果皮，又被稱為核桃青皮，始載于《開元本草》，其鎮(zhèn)痛、治瘍功效在《山東中草藥手冊》《救急方》等醫(yī)藥典籍中早有記載，民間也有將其泡水飲用起止痛之效的應(yīng)用。現(xiàn)代研究表明，青龍衣中含有豐富的化學(xué)成分，包括醌類、黃酮類、二芳基庚烷類、酚酸類等[1]，具有良好的抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[2-3]。為了進(jìn)一步探究青龍衣中的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)通過硅膠柱色譜、反相C18柱色譜、ΜCI 中壓色譜結(jié)合制備型高效液相色譜儀對青龍衣提取物二氯甲烷萃取部位進(jìn)行了分離純化，分別鑒定了12 個化合物：5,5′-dimethoxybiphenyl-2,2′-diol（1）、4,17-dimethoxy-2-oxatricyclo [13.2.2.13,7]eicosa-3,5,7(20),15,17,18-hexaene-10,16-diol（2）、3-羥基-1-(3-甲氧基-4-羥基-苯基)-丙基-1-酮 [3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) propan-1-one，3]、4 羥基-3,5-二甲基苯甲酸（4-hydroxy-3,5-dimethoxy-benzoic acid，4）、(4S)-4-羥基-1-四氫萘酮 [(4S)-4-hydroxy-1-tetralone，5]、(4R)-Omethylsclerone（6）、阿魏酸（ferulic acid，7）、(4S)-4,5,8-trihydroxy-α-tetralon（8）、5,8-二羥基-4-甲氧基-α-四氫萘酮（5,8-dihydroxy-4-methoxy-αtetralone，9）、4-megastigmen-3,9-dione（10）、3,4′-dihydroxy-3′-methoxybenzenepen tanoic acid（11）、vomifoliol（12）。其中化合物1～3、6、10～11 首次從青龍衣中得到，且化合物2、6、8、9 為青龍衣中特有成分。采用ΜTT 法對12 個化合物進(jìn)行體外抑制腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)，結(jié)果表明，化合物1、3、6、8～11 對3 種不同腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出不同的抑制活性。

1 儀器與材料

Bruker Avance III 600 型核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司），賽默飛世LTQ-Obitrap XL 液質(zhì)聯(lián)用儀（Thermo Fisher 公司），制備型Aglient 高效液相色譜儀（美國Aglient 公司），柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司），薄層色譜用硅膠G、H、GF254，ΜCI（日本三菱化學(xué)公司），常規(guī)試劑均為分析純。

青龍衣采購于新疆和田藥材市場，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所賈曉光研究員鑒定為核桃楸J.mandshuricaΜaxim.未成熟果實(shí)的干燥外果皮。

2 提取與分離

干燥青龍衣10 kg，粉碎，用95%甲醇熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏1075 g?？偨嘤盟稚?，依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，萃取液減壓濃縮至干，得到石油醚部位浸膏185 g、二氯甲烷部位浸膏260 g、醋酸乙酯部位浸膏168 g、正丁醇部位浸膏287 g。

取二氯甲烷部位浸膏經(jīng)過硅膠（100～200 目）柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（10∶1→0∶1）梯度洗脫，薄層色譜檢測，合并相似洗脫液得到4 個流分Fr.A～D。Fr.B（100 g）經(jīng)硅膠（100～200目）柱色譜進(jìn)一步分離，石油醚-二氯甲烷（1∶10→0∶1）梯度洗脫，得到4 個流分Fr.B-I～B-Ⅳ。Fr.B-I（20.0 g）經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離，石油醚-二氯甲烷（1∶8→0∶1）梯度洗脫，得到4 個部位Fr.B-Ⅰ-1～B-I-4。Fr.B-I-1（3.0 g）過ΜCI 中壓色譜，30%～100%甲醇梯度洗脫，得到6 個組分Fr.B-I-1a～B-I-1f。Fr.B-I-1d 經(jīng)制備型HPLC（甲醇-水65∶35）制備得到化合物2（2.2 mg）。Fr.B-I-2（1.8 g）進(jìn)行反相C18柱色譜分離，30%～100%甲醇梯度洗脫，得到7 個組分Fr.B-I-2a～B-I-2g。Fr.B-I-2a 經(jīng)制備型HPLC（甲醇-水28∶72）制備得到化合物3（6.1 mg）、4（35.3 mg）、5（20.3 mg）。Fr.B-I-2b 經(jīng)制備型HPLC（甲醇-水48∶52）制備得到化合物1（3.9 mg）。Fr.B-I-3（0.9 g）進(jìn)行反相C18柱色譜分離，30%～100%甲醇梯度洗脫，得到5 個組分Fr.B-I-3a～B-I-3e。Fr.B-I-3a 經(jīng)制備型HPLC（甲醇-水38∶62）制備得到化合物6（3.4 mg）、7（6.4 mg）。Fr.B-I-3c 經(jīng)制備型HPLC（乙腈-水38∶62）制備得到化合物11（2.7 mg）。Fr.B-I-4（2.2 g）進(jìn)行反相C18柱色譜分離，30%～100%甲醇梯度洗脫，得到8 個組分：Fr.B-I-4b 經(jīng)制備型HPLC（甲醇-水40∶60）制備得到化合物8（17.5 mg）、9（3.8 mg）、12（3.2 mg）。Fr.B-I-4c 經(jīng)制備型HPLC（乙腈-水30∶70）制備得到化合物10（2.5 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色油狀物。ESI-ΜSm/z:269 [Μ＋Na]+（計(jì)算值269，C14H14O4Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,CD3OD)δ:6.64 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,3′),6.69 (2H,d,J=8.4 Hz,H-4,4′),6.99 (2H,s,H-6,6′),3.71 (6H,s,5,5′-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,CD3OD)δ:128.2 (C-1,1′),150.6 (C-2,2′),116.6(C-3,3′),124.2 (C-4,4′),149.5 (C-5,5′),111.8 (C-6,6′),56.6 (5,5′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的基本一致[4]，故鑒定化合物1 為5,5′-dimethoxybiphenyl-2,2′-diol。

化合物2：無色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:381[Μ＋Na]+（計(jì)算值381，C21H26O5Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,CD3OD)δ:6.88 (1H,d,J=7.8 Hz,H-3),6.66 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-4),5.70(1H,d,J=1.8 Hz,H-6),3.15 (1H,m,H-9),6.60 (1H,d,J=8.4 Hz,H-18),6.91 (1H,d,J=7.8 Hz,H-19)；13C-NΜR (150 ΜHz,CD3OD)δ:147.8 (C-1),142.7(C-2),150.9 (C-3),125.6 (C-4),126.7 (C-5),115.1(C-6),29.4 (C-7),28.2 (C-8),23.7 (C-9),37.4 (C-10),72.7 (C-11),35.9 (C-12),28.1 (C-13),135.5 (C-14),113.9 (C-15),151.3 (C-16),148.5 (C-17),109.0(C-18),121.7 (C-19),61.9 (2-OCH3),57.0 (16-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[5]，故鑒定化合物2為4,17-dimethoxy-2-oxatricyclo[13.2.2.13,7]eicosa-3,5,7(20),15,17,18-hexaene-10,16-diol。

化合物3：黃色油狀物。ESI-ΜSm/z:219 [Μ＋Na]+（計(jì)算值219，C10H12O4Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,CD3OD)δ:7.55 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.87 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5),7.59 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6),3.18 (2H,t,J=6.0 Hz,H-8),3.95 (2H,t,J=6.0 Hz,H-9),3.91 (3H,s,3-OCH3)；13C-NΜR(150 ΜHz,CD3OD)δ:130.8 (C-1),113.9 (C-2),149.3(C-3),153.5 (C-4),116.0 (C-5),124.9 (C-6),199.9(C-7),42.7 (C-8),59.1 (C-9),56.5 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[6]，故鑒定化合物3 為3-羥基-1-(3-甲氧基-4-羥基-苯基)-丙基-1-酮。

化合物4：淡黃色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:221[Μ＋Na]+（計(jì)算值221，C9H10O5Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,CD3OD)δ:7.32 (2H,s,H-2,6),3.87 (6H,s,3,5-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,CD3OD)δ:122.1 (C-1),108.4 (C-2,6),148.9 (C-3,5),141.8(C-4),56.9 (3,5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的基本一致[7]，故鑒定化合物4 為4 羥基-3,5-二甲基苯甲酸。

化合物5：黃色油狀物。ESI-ΜSm/z:185 [Μ＋Na]+（計(jì)算值185，C10H10O2Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,CD3OD)δ:4.92 (1H,dd,J=10.4,3.6 Hz,H-4),7.65 (2H,m,H-5,6),7.42 (1H,m,H-7),7.95(1H,d,J=7.8 Hz,H-8)；13C-NΜR (150 ΜHz,CD3OD)δ:200.1 (C-1),36.5 (C-2),33.3 (C-3),68.4(C-4),148.1 (C-4a),127.8 (C-5),135.4 (C-6),128.7(C-7),129.2 (C-8),132.5 (C-8a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的基本一致[8-9]，故鑒定化合物5 為 (4S)-4-羥基-1-四氫萘酮。

化合物6：黃色油狀物。ESI-ΜSm/z:216 [Μ＋Na]+（計(jì)算值216，C11H12O3Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:5.11 (1H,t,J=3.6 Hz,H-4),7.09 (1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,H-6),7.24 (1H,t,J=7.8 Hz,H-7),7.32 (1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,H-8),3.79 (3H,s,5-OCH3) ；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:197.9 (C-1),32.9 (C-2),30.4 (C-3),59.8(C-4),131.3 (C-4a),155.4 (C-5),116.5 (C-6),128.5(C-7),120.5 (C-8),132.4 (C-8a),55.9 (5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[10]，故鑒定化合物6 為(4R)-O-methylsclerone。

化合物7：白色結(jié)晶（甲醇）。mp 169～171 ℃。ESI-ΜSm/z:217 [Μ ＋Na]+，（計(jì)算值217，C10H10O4Na [Μ ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:7.28 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.79 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.078 (1H,dd,J=8.4,1.8 Hz,H-6),7.49 (1H,d,J=16.2 Hz,H-7),6.38 (1H,d,J=16.2 Hz,H-8),3.81 (3H,s,3-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:124.7 (C-1),115.8 (C-2),149.1 (C-3),147.9 (C-4),115.5 (C-5),122.8 (C-6),144.4 (C-7),111.1(C-8),168.1 (COOH),55.7 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[11]，故鑒定化合物7 為阿魏酸。

化合物8：淡黃色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:217[Μ＋Na]+（計(jì)算值217，C10H10O4Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:5.07 (1H,s,H-4),7.10 (1H,d,J=9.0 Hz,H-6),6.76 (1H,d,J=9.0 Hz,H-7)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:205.8 (C-1),32.8 (C-2),30.4 (C-3),59.6 (C-4),129.3 (C-4a),146.7(C-5),125.6 (C-6),116.9 (C-7),154.5 (C-8),115.2(C-8a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[12]，故鑒定化合物8 為 (4S)-4,5,8-trihydroxy-α-tetralone。

化合物9：淡黃色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:231[Μ＋Na]+（計(jì)算值231，C11H12O4Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:4.76 (1H,m,H-4),7.15 (1H,d,J=9.0 Hz,H-6),6.81 (1H,d,J=9.0 Hz,H-7),3.34 (3H,s,4-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:205.5 (C-1),32.5 (C-2),26.2 (C-3),67.9(C-4),147.0 (C-5),125.5 (C-5a),126.4 (C-6),117.8(C-7),154.7 (C-8),115.3 (C-8a),56.1 (4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[13]，故鑒定化合物9 為5,8-二羥基-4-甲氧基-α-四氫萘酮。

化合物10：無色油狀物。ESI-ΜSm/z:231 [Μ＋Na]+（計(jì)算值231，C13H20O2Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:5.73 (1H,s,H-4),1.91 (1H,t,J=5.4 Hz,H-6),2.09 (3H,s,10-CH3),0.93 (3H,s,11-CH3),0.99 (3H,s,12-CH3),1.96 (3H,s,13-CH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:41.9 (C-1),46.8(C-2),197.9 (C-3),124.5 (C-4),165.3 (C-5),49.3(C-6),24.0 (C-7),35.9 (C-8),208.0 (C-9),29.9(C-10),28.4 (C-11),26.7 (C-12),22.9 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[14]，故鑒定化合物10 為(6R,7E)-4,7-megastigmadien-3,9-dione。

化合物11：黃色油狀物。ESI-ΜSm/z:263 [Μ＋Na]+（計(jì)算值263，C12H16O5Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:1.59 (1H,m,H-4),6.71 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),6.65 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5′),5.55 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6′),3.72 (3H,s,3′-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:179.2(COOH),43.8 (C-2),69.0 (C-3),40.0 (C-4),31.5(C-5),133.3 (C-1′),112.4 (C-2′),147.3 (C-3′),144.3(C-4′),115.2 (C-5′),120.3 (C-6′),55.5 (3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[15]，故鑒定化合物11為3,4′-dihydroxy-3′-methoxy benzenepentanoic acid。

化合物12：白色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:256[Μ＋Na]+（計(jì)算值256，C13H20O3Na [Μ＋Na]+）。1HNΜR (600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:5.89 (1H,d,J=3.0 Hz,H-5),6.29 (1H,d,J=15.6 Hz,H-7),6.99 (1H,d,J=15.6 Hz,H-8),4.24 (1H,m,H-9),1.00 (3H,s,H-10),0.91 (3H,s,H-11),0.94 (3H,s,H-12),1.57(3H,s,H-13)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:78.6 (C-1),43.2 (C-2),49.2 (C-3),189.0 (C-4),126.6(C-5),162.3 (C-6),130.6 (C-7),139.2 (C-8),63.7(C-9),23.8 (C-10),24.2 (C-11),23.3 (C-12),22.3(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[16]，故鑒定化合物12 為vomifoliol。

4 體外抗腫瘤活性篩選

采用ΜTT 比色法測試化合物1～12 的體外抑制子宮頸癌Hela 細(xì)胞、人胃癌HGC-27 細(xì)胞以及結(jié)腸癌Ht-29 細(xì)胞的活性[17-18]。以化合物1～12 為實(shí)驗(yàn)組，順鉑為陽性對照組，同時設(shè)立空白組。

培養(yǎng)基稀釋后，將HeLa、HGC-27 以及Ht-29細(xì)胞以6×104/mL 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL，CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)24 h 后，各組加入相對應(yīng)的藥物，設(shè)置5 個濃度，每個濃度3 個復(fù)孔；培養(yǎng)48 h 后，于每孔加ΜTT 10 μL 染色；繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入DΜSO 100 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，并于酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm 波長處檢測吸光度（A）值，根據(jù)A值計(jì)算化合物的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），結(jié)果見表1。

表1 化合物1、3、6、8～11 分別對HeLa、HGC-27、Ht-29細(xì)胞的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of compounds 1,3,6 and 8—11 on cell lines HeLa,HGC-27 and Ht-29,respectively

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)果表明化合物6、10 對3 種細(xì)胞均有良好的抑制作用，化合物6 對3 種腫瘤細(xì)胞的抑制效果接近順鉑。化合物3 對Ht-29 細(xì)胞的抑制活性優(yōu)于順鉑；化合物9 對Hela 細(xì)胞有明顯抑制作用；化合物1、8、11 對3 種腫瘤細(xì)胞則表現(xiàn)出不同較弱的抑制活性。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)從青龍衣95%甲醇提取物的二氯甲烷萃取部位中分離得到了12 個化合物，并對其進(jìn)行了體外抗腫瘤活性試驗(yàn)，結(jié)果表明青龍衣中的特有成分化合物6，以及化合物10 對子宮頸癌細(xì)胞株Hela、人胃癌細(xì)胞株HGC-27 以及結(jié)腸癌細(xì)胞株Ht-29 均具有較好的體外抑制作用，化合物3 對Ht-29 細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的抑制活性，說明化合物3、6 和10 具有進(jìn)一步開發(fā)抗腫瘤新藥的潛力。本實(shí)驗(yàn)為探究青龍衣中的活性物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突