郭玉勤，舒洪珍，譙明鳴，彭 成，劉 菲*，熊 亮*

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都 611137

姜黃Curcuma longaL.，又名寶鼎香、黃姜、毛姜黃等，姜科（Zingiberaceae）姜黃屬草本植物，生于海拔800 m 以下的低山、丘陵、平壩。主要分布于我國四川、福建、廣西、云南、臺灣等地，是著名的川產(chǎn)道地藥材[1-2]。姜黃作為傳統(tǒng)的藥食兩用植物，已有5 千多年的應(yīng)用歷史，在許多國家長期被用作草藥、香料和膳食補充劑[3-4]，具有破血行氣、通經(jīng)止痛的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用于治療痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、動脈粥樣硬化、高脂血癥、高血壓、糖尿病等疾病[5-6]。化學(xué)研究表明，姜黃中主要含姜黃素類、萜類以及其他成分，其中萜類又以倍半萜類成分為代表。目前，從姜黃中鑒定的倍半萜類化合物多達100 多個，結(jié)構(gòu)類型主要包括沒藥烷型、愈創(chuàng)木烷型、吉瑪烷型、桉葉烷型、長松針烷型、杜松烷型、檀香烷型、欖香烷型、蒈烷型、蒼耳烷型、菖蒲烷型、柏木烷型等[7-11]，其中沒藥烷型倍半萜含量最為豐富。課題組前期分離鑒定了多個倍半萜并發(fā)現(xiàn)這些成分具有顯著的舒張血管活性[12-14]，為了進一步研究姜黃的化學(xué)成分及其活性，本研究運用多種色譜和波譜技術(shù)分離純化姜黃中的倍半萜類成分，得到1 個新的裂環(huán)沒藥烷型倍半萜成分，命名為姜黃烷G（curcumane G，1）。對分離得到的化合物進行舒張血管活性評價，結(jié)果顯示化合物1 無顯著舒張血管作用。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Bruker-700 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；Agilent 6230 LC/TOF 高分辨質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；安東帕ΜCP 200 旋光儀（美國安東帕有限公司）；圓二色譜儀（英國Chirascan-plus CD光譜儀）；紅外光譜儀（美國Agilent 公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；中壓液相色譜儀（瑞士Búchi Gradient Former B-687）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（亞榮生化儀器）；Zorbax SB-C18（250 mm×9.4 mm，5 μm）色譜柱（美國Agilent 公司）；薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）；柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（瑞典Amershan Pharmacia 公司）；電子天平（德國Sartorius BP221S）；離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)（澳大利亞PL3508B6/C-V Panlab 8 Chamber Organ Bath System）；可調(diào)式移液器（美國 Thermo Fisher Scinentific）；甲醇（色譜級，美國Tedia 公司）；乙醇（色譜級，美國Fisher 公司）；其他所用試劑均為分析純（成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

1.2 實驗動物

SD 大鼠，清潔級，雄鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030，檢疫后用。飼養(yǎng)溫度21～27 ℃，濕度（50±5）%，晝夜光照及通風(fēng)環(huán)境自然調(diào)節(jié)。動物實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審核（備案編號為2020-04），均符合3R 原則。

1.3 藥材

姜黃飲片購于四川新荷花中藥飲片有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物研究室李敏教授鑒定為姜黃Curcuma longaL.的干燥根莖。姜黃飲片標本（CL-20160803）保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所。

2 方法

2.1 提取與分離

姜黃藥材飲片（50 kg），加95%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取3 次，每次8 倍量溶劑，第1 次3 h、第2 次2 h、第3 次1.5 h，合并提取液，50 ℃減壓濃縮得半固體流浸膏7 kg。將浸膏混懸于水中，依次以石油醚、醋酸乙酯反復(fù)萃取并將萃取液于50 ℃減壓濃縮，得石油醚部位2 kg，醋酸乙酯部位3 kg。醋酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱色譜（150 cm×22 cm）分離，石油醚-醋酸乙酯系統(tǒng)（1∶0、7∶3、4∶6、0∶1）洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并組成相似的組分，減壓濃縮至稠浸膏，并依次編號為A～F。浸膏B（500 g）經(jīng)硅膠柱色譜（150 cm×22 cm）分離，用二氯甲烷-醋酸乙酯系統(tǒng)（100∶1→0∶1）梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜法檢視，合并相似洗脫組分并減壓濃縮，得16 個流分Fr.1～16。Fr.5進一步經(jīng)中壓液相色譜（30 cm×4 cm）分離，以甲醇-水系統(tǒng)（10%→100%）梯度洗脫，得到10 個流分Fr.5-1～5-10。Fr.5-1 經(jīng)過凝膠色譜柱分離，石油醚-二氯甲烷-甲醇（2∶2∶1）洗脫，得到5 個流分Fr.5-1-1～5-1-5）。Fr.5-1-5 經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（200∶1→1∶1）梯度洗脫，得到5 個流分Fr.5-1-5-1～5-1-5-5。Fr.5-1-5-3 依次經(jīng)過制備薄層色譜（石油醚-醋酸乙酯2∶3）和反相半制備高效液相色譜（60%甲醇）分離得到化合物1（6 mg，tR＝28 min，1 mL/min）。

2.2 活性測定

2.2.1 溶液的配制 K-H 液（Kreb’-Henseleit solution）配制：NaCl 13.87 g；KCl 0.7 g；KH2PO40.32 g；ΜgSO40.28 g；NaHCO34.2 g；Glucose 3.64 g；EDTA 0.018 g；CaCl20.56 g；加超純水至2 L，pH值7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用。

樣品溶液的配制：精密稱取化合物1 適量，加二甲基亞砜配制成50 μmol/mL 的母液，備用。

2.2.2 大鼠胸主動脈血管環(huán)的制備 頸椎脫臼處死SD 大鼠，取出胸主動脈，置于預(yù)冷卻的K-H 液中，剔除血管周圍的脂肪和結(jié)締組織后，將其剪成4 個3～5 mm 的血管環(huán)，分別將血管環(huán)固定于4 個裝有20 mL K-H 液的浴槽內(nèi)（恒溫37 ℃，持續(xù)通95%O2＋5% CO2混合氣體），采用離體組織灌流模型和Power Lab 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)記錄離體血管環(huán)張力的變化。保持血管環(huán)起始張力為1.0 g 的狀態(tài)下，每15 min 換1 次K-H 液，待血管環(huán)平衡60 min 后，用60 mmol/L 的KCl 連續(xù)刺激血管環(huán)至少2～3 次。每次刺激后，使用K-H 液連續(xù)沖洗3 次，每次5 min，待血管環(huán)張力恢復(fù)至基礎(chǔ)狀態(tài)后，穩(wěn)定30 min。當(dāng)連續(xù)相同刺激所引起的血管收縮幅度小于10%時，往浴槽內(nèi)加入60 mmol/L 的KCl 預(yù)收縮胸主動脈環(huán)，待血管收縮張力達到平臺期時，累積加入5 個濃度（0.25、0.75、2.50、7.50、25.00 μmol/L）的樣品溶液，觀察濃度與舒張效應(yīng)曲線，比較不同濃度下化合物對KCl（60 mmol/L）預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色油狀液體，易溶于甲醇、丙酮等有機溶劑。[α]25D＋20.6 (c0.06,ΜeOH)。其質(zhì)譜數(shù)據(jù) (＋)-HR-ESI-ΜSm/z:289.141 4 [Μ＋Na]+（計算值C15H22O4Na,289.141 6）,提示該化合物分子式為C15H22O4，不飽和度為5。UV 光譜顯示其在238 nm處有最大吸收，且IR 光譜中顯示1684 cm-1的吸收帶，提示其可能含有α,β 不飽和酮等官能團[15-16]。1H-NΜR（表1）顯示該化合物結(jié)構(gòu)中含有1 個烯氫信號 [δH6.16 (1H,brs)]、3 個單峰甲基信號 [δH2.16(3H,s),1.87 (3H,brs),2.10 (3H,brs)]和1 個雙峰甲基信號 [δH0.91 (3H,d,J=7.0 Hz)]。13C-NΜR 和DEPT 譜顯示該化合物共有15 個碳信號，可歸屬為4 個甲基碳、3 個亞甲基碳、4 個次甲基碳 [包含1個連氧叔碳 (δC79.5) 和1 個烯碳 (δC124.8)]和5個季碳 [包含2 個酮羰基碳 (δC205.4,199.6)、1 個酯羰基碳 (δC176.3) 以及1 個雙鍵季碳 (δC155.2)]信號。與文獻對比發(fā)現(xiàn)，化合物1 的核磁數(shù)據(jù)與已知化合物3,4-seco-bisabol-10-ene-3-one-1,4-olide[17]的數(shù)據(jù)類似，區(qū)別在于化合物1 的C-9 被氧化為羰基 (δC199.6)，因此，推斷化合物1 為裂環(huán)沒藥烷型倍半萜。為了進一步確定化合物1 的結(jié)構(gòu)，進行了2D NΜR 實驗。HΜBC 譜和1H-1H COSY 譜顯示的主要相關(guān)信號如圖1所示，尤其是在HΜBC譜中，H-7、H2-8、H-10 同時與C-9 (δC199.6) 相關(guān)確證了C-9 為羰基，且與雙鍵Δ10(11)共軛，化合物1 的平面結(jié)構(gòu)得以確定。

圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)及主要HMBC、1H-1H COSY 和NOESY 信號Fig.1 Structure and key correlations of HMBC,1H-1H COSY and NOESY of compound 1

表1 化合物1 的1H-(700 MHz,acetone-d6) 和13C-NMR數(shù)據(jù) (175 MHz,acetone-d6)Table 1 1H-(700 MHz,acetone-d6) and 13C-NMR (175 MHz,acetone-d6) data of compound 1

進一步通過分析NOSEY 譜和比較核磁數(shù)據(jù)理論值與計算值確定其相對構(gòu)型。在NOSEY 譜中，H2-2 與H-6 相關(guān)說明H-1 與H-6 位于異側(cè)，而Μe-7處于支鏈上，無法通過NOSEY 實驗確定其相對構(gòu)型，因此，化合物1 的構(gòu)型存在4 種可能，即(1S,6S,7S)/(1R,6R,7R)和 (1S,6S,7R)/(1R,6R,7S)。為進一步確定其相對構(gòu)型，分別對(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1和(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 的核磁數(shù)據(jù)進行計算。計算結(jié)果表明(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 和(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 的13C-NΜR 化學(xué)位移計算值（y）與實驗值（x）的相關(guān)系數(shù)（R2）差異不大 [R2(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1:0.998 5；(1S,6S,7R)-1/ (1R,6R,7S)-1:0.998 0；圖2-A、B]，相比之下DP4+概率分析對于異構(gòu)體的區(qū)分更具優(yōu)勢[18]，基于1H-和13C-NΜR 數(shù)據(jù)的DP4+概率分析（圖2-C）顯示(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 明顯優(yōu)于(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1。進一步通過計算ECD 確定化合物1 的絕對構(gòu)型，使用Conflex 軟件對(1S,6S,7R)-1 進行優(yōu)勢構(gòu)象搜索，得到了11 個構(gòu)象（Boltzmann distribution≥1%）。利用 Gaussian6.0 軟件，根據(jù)密度泛函數(shù)理論（DFT），采用密度泛函B3LYP 方法在6-31G 基組水平于空氣中對所選構(gòu)象進行優(yōu)化，再將優(yōu)化后的構(gòu)象采用密度泛函ω-B97XD 方法在DGDZVP 基組水平，于IEFPCΜ 模型在乙腈中再次優(yōu)化，隨后，優(yōu)化的構(gòu)象于密度泛函CAΜ-B3LYP 方法在DGDZVP 基組水平，于IEFPCΜ 模型在乙腈中計算ECD 圖譜[12]。最后，使用SpecDis1.71 軟件打開化合物1 上述構(gòu)象的ECD 圖譜，根據(jù)每個構(gòu)象的玻爾茲曼能量分布進行擬合，生成了(1S,6S,7R)-1 和(1R,6R,7S)-1 的計算ECD 譜（σ＝0.3 eV，UV 位移＋13 nm）如圖3所示。結(jié)果表明，在200～340 nm，理論計算的 (1S,6S,7R)-1 ECD 譜與實測ECD 譜非常吻合。因此，化合物1 的絕對構(gòu)型確定為 1S,6S,7R，化合物 1 鑒定為(1S,6S,7R)-3,4-裂環(huán)沒藥烷-10-烯-3,9-二酮-1,4-內(nèi)酯。

圖2 (1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 (A) 和 (1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 (B) 在PCM-mPW191/6-331＋G (d,p) 水平上的13C-NMR 化學(xué)位移的回歸分析及DP4＋概率 (C)Fig.2 Regression analysis of experimental and calculated 13C-NMR chemical shifts of (1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 (A) and (1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 (B) at PCM-mPW1PW91/ 6-311＋G (d,p) level (acetone-d6);and DP4＋probability for (1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 and(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 at PCM-mPW1PW91/6-311＋G (d,p) level (C)

圖3 化合物1 的實測ECD 譜和計算ECD 譜Fig.3 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

4 舒張血管活性評價

中醫(yī)藥治療心血管疾病具有安全性高、穩(wěn)定性好、療效顯著的優(yōu)點，主要表現(xiàn)在舒張血管、抗氧化、抗凝血、調(diào)血脂、增加血流量和心肌細胞保護等方面。現(xiàn)代藥理研究表明，姜黃具有舒張血管、抗凝血、改善血液流變學(xué)和血流動力學(xué)等作用，可用于心血管疾病的治療[19-22]。課題組前期發(fā)現(xiàn)姜黃中的沒藥烷型倍半萜類成分具有良好的舒張血管作用[12-14]，因此本實驗測定了化合物1對KCl預(yù)收縮的胸主動脈環(huán)舒張作用，但結(jié)果顯示該化合物無明顯活性。

5 討論

本實驗運用多種色譜分離技術(shù)從姜黃95%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中獲得1 個新的裂環(huán)沒藥烷型倍半萜（1），并通過NOESY 和計算NΜR 確定其相對構(gòu)型，計算ECD 確定其絕對構(gòu)型。姜黃中含有較多的沒藥烷型倍半萜，但裂環(huán)沒藥烷型倍半萜較為少見，而且這類裂環(huán)沒藥烷型倍半萜在自然界中較為罕見，目前僅在姜科中分離得到[17]?；衔? 在沒藥烷型骨架的基礎(chǔ)上，C-4-C-3 經(jīng)氧化斷鍵而開環(huán)，并形成丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，而其他裂環(huán)沒藥烷型倍半萜的裂環(huán)位置通常在C-2 與C-3 之間[20]。盡管課題組前期發(fā)現(xiàn)姜黃倍半萜成分具有顯著的舒張血管作用，但化合物1 對KCl 預(yù)收縮的胸主動脈環(huán)無明顯活性。因此猜測裂環(huán)沒藥烷型倍半萜結(jié)構(gòu)中的裂環(huán)對其舒張血管活性可能產(chǎn)生影響。本研究豐富了姜黃的化學(xué)成分，為姜黃倍半萜類成分的后續(xù)研究提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突