盛陳卓婭,姚根新,張心榮,李 東

盛陳卓婭,浙江省湖州市德清縣人民醫(yī)院病理科 浙江省湖州市313200

姚根新,浙江省湖州市德清縣人民醫(yī)院超聲科 浙江省湖州市 313200

張心榮,浙江省湖州市德清縣人民醫(yī)院超聲科 浙江省湖州市 313200

李東,浙江醫(yī)院超聲科 浙江省杭州市 310013

0 引言

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見的肝臟惡性腫瘤,其病死率居惡性腫瘤第二位,惡性程度高,轉(zhuǎn)移率高,預(yù)后較差[1,2].HCC發(fā)生發(fā)展涉及多基因的調(diào)控表達[3].酪氨酸蛋白激酶受體B4(ephrin type-B receptor 4,EphB4)是酪氨酸蛋白激酶受體家族中的一員,大量研究證實EphB4在多種人類惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達狀態(tài),具有重要臨床意義[4].超聲造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)能對組織的微循環(huán)血流狀態(tài)進行定量分析,能動態(tài)真實反映其血供情況[5].本研究旨在檢測HCC肝癌組織與癌旁組織的EphB4表達水平差異,分析EphB4表達水平與CEUS血流灌注參數(shù)的相關(guān)性,以期為臨床判斷病情、評估預(yù)后提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2019-02/2021-03期間,在我院行手術(shù)切除治療的HCC患者作為研究對象,共52例,其中男38例,女14例,年齡28-77歲,平均55.9歲±13.2歲.納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均為單發(fā)病灶;(2)均經(jīng)病理證實為HCC;(3)術(shù)前未曾接受任何治療;(4)無造影劑過敏;(5)能配合檢查.病灶大小1.83 cm -5.78 cm,平均4.58 cm±1.04 cm.本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過.所有患者均知情同意,并簽署知情同意書.

1.2 方法 CEUS檢查:采用Acuson S2000超聲診斷儀進行檢查,選擇4C1探頭(頻率4.0 MHz),內(nèi)置定量分析軟件.首先行常規(guī)超聲掃查,明確病灶位置、大小、邊界、內(nèi)部回聲等一般情況.啟動CEUS模式,以Sono Vue(意大利,Bracco公司)作為超聲造影劑,按說明書制成混懸液.經(jīng)肘部淺靜脈快速推注2.4 mL,尾隨生理鹽水沖管,同步計時并存儲動態(tài)圖像資料作后續(xù)分析.分別于肝癌組織、癌旁組織(距離腫瘤病灶邊緣1 cm處肝組織)選取實性部分作為感興趣區(qū),盡可能避開大血管、囊性區(qū)以及壞死區(qū).感興趣區(qū)選取深度、大小應(yīng)保持一致.系統(tǒng)將自動生成時間-強度曲線,獲得血流灌注參數(shù):峰值強度(maximum intensity,IMAX)、達峰時間(time to peak,TTP)、流出時間(washout time,WT).由同一名經(jīng)驗豐富的副高職稱超聲科醫(yī)師進行CEUS檢查,所有數(shù)據(jù)均測量3次取平均值.見圖1.

圖1 CEUS灌注參數(shù)示意圖.綠色線:肝癌組織的時間-強度曲線;黃色線:癌旁組織的時間-強度曲線.CEUS:超聲造影;IMAX:峰值強度;TTP:達峰時間;WT:流出時間.

1.3 EphB4表達水平及微血管密度測定 術(shù)后獲得HCC相應(yīng)局部肝癌組織以及癌旁組織標(biāo)本,用生理鹽水洗凈,加入RI-PA裂解液后充分研磨成研磨液,于4 ℃條件下離心20 min(12000轉(zhuǎn)/min),分離上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供)檢測EphB4表達量.

采用ElivisionTM二步法免疫組化染色,嚴(yán)格按照Weidner等研究者報道的方法[6],首先在40倍光鏡下觀察整張病理切片,選取3個“熱點”(血管高密度區(qū)),然后在200倍光鏡下計數(shù)血管數(shù).與周圍血管、結(jié)締組織細(xì)胞分開,且棕染的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個計數(shù)微血管.計數(shù)3次,取平均值作為微血管密度(microvessel density,MVD)最終值(圖2).

圖2 MVD檢測.在200倍光鏡下,術(shù)后病理組織可見棕染的微血管.MVD:微血管密度.

統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù).計量資料表示為mean±SD,組間比較采用t檢驗.相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析.P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 不同組織間CEUS灌注參數(shù)比較 肝癌組織IMAX明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);肝癌組織TTP、WT明顯短于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表1).

表1 不同組織間CEUS灌注參數(shù)比較

2.2 不同組織間EphB4表達水平及MVD水平比較 肝癌組織EphB4表達水平明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);肝癌組織MVD明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表2).

表2 不同組織間EphB4表達水平及MVD比較

2.3 CEUS灌注參數(shù)與EphB4表達水平相關(guān)性 肝癌組織中,EphB4表達水平與IMAX呈正相關(guān)(r=0.862,P<0.05),而EphB4表達水平與TTP、WT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.765,r=-0.781,P<0.05).

3 討論

HCC病灶內(nèi)有著十分豐富的血供,這與病灶內(nèi)血管新生過程旺盛密切相關(guān)[7].大量新生血管可為腫瘤組織細(xì)胞增殖、生長及發(fā)展提供充足養(yǎng)分.全面了解HCC腫瘤內(nèi)的血供狀態(tài)及組織細(xì)胞增殖情況,不僅能為臨床判斷病情嚴(yán)重程度提供依據(jù),而且能為臨床選擇合適治療方案提供參考.

CEUS作為近年來迅速發(fā)展起來的一項超聲檢查新技術(shù),其在監(jiān)測組織微循環(huán)灌注方面有著獨特優(yōu)勢.CEUS是微米級純血池血管示蹤技術(shù),能敏感動態(tài)反映組織內(nèi)微循環(huán)血流,進而定量評估其血流特征[8].本研究結(jié)果顯示,肝癌組織IMAX明顯高于癌旁組織(P＜0.05),而TTP、WT明顯短于癌旁組織(P＜0.05).提示肝癌組織的整體血流量較癌旁組織豐富,且其血流動力學(xué)特征為快速流入、達峰后快速流出,即為“快進快出”的造影模式.原因可能是,一方面HCC以動脈供血為主,腫瘤組織在多種血管生成因子作用下,生成大量不成熟微小血管,而這些微小血管具有較高通透性;另一方面,腫瘤組織內(nèi)存在大量動靜脈短路,導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血流量增大,流速增快[9].MVD是目前公認(rèn)的能有效反映組織微血管生成狀態(tài)的可靠指標(biāo).本研究結(jié)果顯示,肝癌組織MVD明顯高于癌旁組織(P＜0.05).進一步證實了HCC腫瘤組織內(nèi)存在大量新生微小血管.HCC腫瘤內(nèi)MVD明顯增加,是導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血流量增加,流速增快的重要原因之一.

HCC內(nèi)豐富的血供有利于腫瘤細(xì)胞增殖,而腫瘤細(xì)胞增殖受到原癌基因過表達影響.原癌基因具有促細(xì)胞增殖作用,在HCC病情發(fā)展中發(fā)揮著重要作用.EphB4作為 Ephrin家族中的一類酪氨酸蛋白激酶,一方面通過作用于Rac1/Akt通路,促進腫瘤細(xì)胞增殖,另一方面能通過作用于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲性生長[10,11].本研究結(jié)果顯示,肝癌組織EphB4表達水平明顯高于癌旁組織(P＜0.05).提示EphB4表達水平上調(diào)與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).進一步分析HCC腫瘤組織血流灌注參數(shù)與EphB4表達水平的相關(guān)性顯示:在肝癌組織中,EphB4表達水平與IMAX 呈正相關(guān),而與TTP、WT呈負(fù)相關(guān).提示HCC腫瘤組織的血流灌注狀態(tài)與EphB4表達調(diào)控關(guān)系密切.隨著HCC腫瘤組織內(nèi)血供增多,流速增快,EphB4表達量隨之上升,從而促進腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移.

4 結(jié)論

CEUS能定量評估HCC腫瘤組織的微循環(huán)血流狀態(tài),其血流灌注參數(shù)與EphB4表達水平具有一定相關(guān)性,可為臨床評估EphB4表達水平提供參考.

文章亮點

實驗背景

酪氨酸蛋白激酶受體B4(ephrin type-B receptor 4,EphB4)表達在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,而病理學(xué)方法評估EphB4表達狀態(tài)具有創(chuàng)傷性,難以滿足術(shù)前評估要求.超聲造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)所具有的獨特優(yōu)勢,可為臨床無創(chuàng)性評估EphB4表達狀態(tài)提供一種可靠手段.

實驗動機

采用CEUS定量分析HCC組織的血流灌注變化,從而間接評估其EphB4表達水平,為臨床無創(chuàng)性評估EphB4表達狀態(tài)提供參考.

實驗?zāi)繕?biāo)

采用CEUS定量分析HCC血流灌注狀態(tài),進而評估其EphB4表達水平.結(jié)果顯示:CEUS血流灌注參數(shù)與EphB4表達水平具有相關(guān)性,可間接評估HCC的EphB4表達水平.

實驗方法

本篇論文采用CEUS定量分析HCC血流灌注變化與EphB 4表達水平的相關(guān)性.CEUS是一種純血池示蹤方法,可定量分析目標(biāo)組織的血流灌注特征.

實驗結(jié)果

本篇論文研究達到了實驗?zāi)繕?biāo),研究結(jié)果顯示肝癌組織峰值強度(maximum intensity,IMAX)、EphB4表達水平及微血管密度(microvessel density,MVD)明顯高于癌旁組織(P＜0.05);肝癌組織達峰時間(time to peak,TTP)、流出時間(washout time,WT)明顯短于癌旁組織(P＜0.05);肝癌組織EphB4表達水平與IMAX、TTP、WT具有相關(guān)性.本研究結(jié)果說明CEUS可無創(chuàng)性評估HCC的EphB4表達狀態(tài).

實驗結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)HCC血流參數(shù)與EphB4表達水平具有一定相關(guān)性.本研究提出CEUS能有效反映HCC的EphB4表達水平,從而指導(dǎo)臨床治療.

展望前景

CEUS檢查時,患者盡量放慢呼吸頻率,減少呼吸運動幅度,超聲醫(yī)師將腫瘤圖像置于顯示屏中央?yún)^(qū)域進行觀察.本研究未來研究的方向是運用CEUS判定HCC組織EphB4表達水平的診斷效能.本研究未來研究的最佳方法是CEUS聯(lián)合血管生成相關(guān)因子評估HCC的EphB4表達水平.