董 正 曾啟繁,2① 劉亮潔 王 師,2

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室 青島 266003; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室 青島 266237)

在脊椎動物中,Smad基因通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能, 在機體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用(Massaguéet al, 2000; Weinsteinet al,2000; Deryncket al, 2003)。

Smad基因家族從結(jié)構(gòu)和功能上主要可以分為3個亞族: 受體調(diào)節(jié)Smad(R-Smad)、通用性Smad(Co-Smad)和抑制型Smad(I-Smad), 其中R-smad可分為TGF-β 通路Smad和BMP 通路Smad。Smad 蛋白含有高度保守的N 端結(jié)構(gòu)域mad homologous domain1(MH1)和C 端結(jié)構(gòu)域mad homologous domain2 (MH2)(Grishin, 2001; Wuet al, 2001)。近年來研究發(fā)現(xiàn), 在脊椎動物中Smad3基因通過調(diào)控增強子結(jié)合蛋白(CEBP/ε)來促進(jìn)中性粒細(xì)胞的成熟和功能極化, 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用(吳婷婷等, 2014)。中性粒細(xì)胞是動物體內(nèi)天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,作為效應(yīng)細(xì)胞抗擊病原菌入侵, 在介導(dǎo)先天免疫防御和獲得性免疫反應(yīng)方面都有非常重要的作用(Dattoet al, 1999)。貝類的免疫機制包括細(xì)胞免疫和體液免疫, 主要靠血淋巴細(xì)胞來完成。與脊椎動物相比, 缺乏獲得性免疫功能(劉世良等, 2003)。近些年來研究暗示,Smad基因家族也參與了軟體動物的免疫應(yīng)答, 但其在貝類免疫反應(yīng)中的作用機制仍不清晰(Huet al, 2017)。

櫛孔扇貝是我國山東一帶重要的經(jīng)濟貝類, 也是我國重要的海水養(yǎng)殖品種(李成林等, 2011)。自20世紀(jì)90 年代以來, 高密度的人工養(yǎng)殖加上海洋水質(zhì)資源的惡化, 經(jīng)常引發(fā)大規(guī)模的細(xì)菌性疾病。其中,鰻弧菌(Vibrio anguillarum)病是主要的病原之一, 廣泛存在于海洋動物體內(nèi)及沿岸海水沉積物中(竇海鴿等, 2005)。目前, 在雙殼貝類中關(guān)于Smad基因家族的研究大多局限于鑒定和克隆(郭慧慧, 2012; Liuetal, 2014; 錢雪駿等, 2015), 對Smad基因家族的系統(tǒng)性分析以及免疫調(diào)控功能的相關(guān)理解仍然有限。因此,我們對櫛孔扇貝進(jìn)行了Smad基因家族的系統(tǒng)發(fā)生和表達(dá)模式分析, 以深入理解櫛孔扇貝中Smad基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制。此外, 我們也開展了鰻弧菌侵染實驗, 以分析Smad基因的免疫應(yīng)答反應(yīng), 為研究雙殼貝類的免疫應(yīng)答機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 Smad 基因的全基因組篩查與鑒定

為了篩查和鑒定Smad基因, 本研究使用脊椎動物和無脊椎動物Smad 同源蛋白質(zhì)序列對櫛孔扇貝的全基因組數(shù)據(jù)庫(Liet al, 2017)進(jìn)行檢索, 使用的物種包括人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、斑點雀 鱔(Lepisosteus oculatus) 、 果 蠅(Drosophilidaemelanogaster)、?？?Nematostella vectensis)、紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus)、長牡蠣(Crassostrea gigas)、福壽螺(Pomacea canaliculata)和蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis) (表1)。利用TBLASTN 將這些物種的Smad 蛋白序列與櫛孔扇貝的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(e 值小于1e-5), 得到櫛孔扇貝候選Smad基因(e 值小于1e-5)。通過查詢基因組的結(jié)構(gòu)注釋文件, 獲得上述所選物種的Smad基因在染色體或scaffold 上的位置信息。使用SMART (Letunicet al,2018)識別Smad 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域, 并進(jìn)一步使用Compute pI/Mw 工具(Bjellqvistet al, 1993)計算Smad蛋白的等電點(pI)和分子量。選用MEME (Baileyet al,1994)的默認(rèn)參數(shù)對Smad 蛋白的基序進(jìn)行識別和分析。使用IBS1.0.3 (Liuet al, 2015)展示Smad 蛋白結(jié)構(gòu)域和基序的分布。

表1 Smad 基因鑒定分析所用蛋白序列注冊號Tab.1 Accession numbers of Smad proteins used for Smad gene identification

1.2 系統(tǒng)發(fā)生分析

將人(H. sapiens)、小鼠(M. musculus)、斑點雀鱔(L.oculatus)、果蠅(D. melanogaster)、?？?N. vectensis)、紫海膽(S. purpuratus)、長牡蠣(C. gigas)、福壽螺(P.canaliculata)、蝦夷扇貝(P. yessoensis)以及櫛孔扇貝的Smad 蛋白序列進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)發(fā)生分析。使用ClustalX (Larkinet al, 2007)進(jìn)行多重序列比對, 導(dǎo)入MEGA7 (Kumaret al, 2016), 運用最大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建進(jìn)化樹, Bootstrap 1000 次檢驗。使用iTOL 展示進(jìn)化樹(Letunicet al, 2007)。

1.3 Smad 基因的表達(dá)量計算、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和GO 富集

用 STAR (Dobinet al, 2013)軟件將櫛孔扇貝的成體組織(橫紋肌、血、肝胰腺、眼、性腺、足、鰓、腎、外套膜、平滑肌)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Liet al, 2017)比對到櫛孔扇貝參考基因組序列, 用Samtools (Liet al,2009)軟件處理比對結(jié)果件, 用featureCounts (Liaoet al, 2014)軟件統(tǒng)計基因的counts 值, 最后基因的表達(dá)量用TPM (Transcripts Per Million)表示。

將23 506 個在櫛孔扇貝各組織中TPM>1 的基因, 導(dǎo)入“WGCNA”包(Langfelderet al, 2008)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(WGCNA)。根據(jù)之前構(gòu)建貝類共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的方法, 選擇權(quán)重系數(shù) softpower=13, 網(wǎng)絡(luò)類型 參 數(shù) networkType=“unsigned”, 最 小 模 塊 大 小minModuleSize=450, 設(shè) 定 切 樹 高 度detectCutHeight=0.997 來構(gòu)建櫛孔扇貝共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(Wanget al, 2020)。使用“pheatmap”包繪制表達(dá)熱圖,對均一化的表達(dá)量進(jìn)行展示。

利用EnrichPipeline 軟件(Huanget al, 2009)對Smad基因所在模塊的基因進(jìn)行功能富集分析, FDR校正后的P值(adjustedP-value)<0.05 為閾值, 篩選富集的GO term。

1.4 鰻弧菌侵染實驗

鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的培養(yǎng)和侵染方法參考Cong 等(2008)所述。在28 °C 下利用2216E 液體培養(yǎng)基(5 g/L 胰蛋白胨, 1 g/L 酵母提取物和0.1 g C6H5Fe·5H2O, pH=7.6)培養(yǎng)鰻弧菌, 通過2000g離心5 min 進(jìn)行收集, 將沉淀物懸浮于過濾海水中(0.22 μm 濾膜), 將鰻弧菌濃度調(diào)節(jié)至1×107CFU/mL用于進(jìn)行侵染實驗。選取健康1 齡櫛孔扇貝, 在實驗室暫養(yǎng)3 d 后, 用于革蘭氏陰性細(xì)菌鰻弧菌侵染實驗。隨后挑選50 只, 隨機分成對照組與實驗組, 在利用鰻弧菌侵染后0、5、24、48、72 h 進(jìn)行取樣, 每個時間點取5 個個體做為生物學(xué)重復(fù)。使用注射器從橫紋肌中收集血淋巴。收集完血淋巴樣品后, 立即將其在800g, 4 °C 條件下離心10 min 以收集血細(xì)胞。然后將血細(xì)胞立即在液氮中冷凍, 在使用前用–80 °C冰箱冷藏。

1.5 RNA 提取和實時定量PCR 分析

按照本課題組前期發(fā)表的方法提取總RNA (Huet al, 2006), 使用Nanovue Plus 分光光度計(GE Healthcare, NJ, USA)測定RNA 濃度和純度, 并通過瓊脂糖凝膠電泳評估RNA 完整性。使用莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(Thermo, USA)合成第一鏈cDNA 用作實時定量PCR 的模板。Smad基因的實時定量 P C R 擴增按照說明書體系使用SsoFast?EvaGreen?試劑進(jìn)行, 引物序列見表2, 在LightCycler480 進(jìn)行實時定量 PCR 分析(RocheDiagnostics 公司, 曼海姆, 德國)。PCR 運行程序如下:50 °C 2 min, 94 °C 10 min, 40 個循環(huán), 94 °C 15 s,62 °C 1 min, 選取EF1A基因作為鰻弧菌侵染實驗中實時定量PCR 分析的內(nèi)參基因(Liet al, 2016)。所有引物設(shè)計均使用Primer Premier5.0 軟件, 所設(shè)計引物首先通過BLASTN (1e-10)比對櫛孔扇貝基因組來評估特異性。采用2–ΔΔCt方法基于對照組計算鰻弧菌侵染后各Smad成員的相對表達(dá)量。使用SPSS20.0 軟件(IBM, 2013)中獨立 t 檢驗的統(tǒng)計軟件包, 分析各Smad各成員的表達(dá)變化。

表2 熒光定量PCR 引物列表Tab.2 Primers used for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 櫛孔扇貝Smad 基因的鑒定及結(jié)構(gòu)分析

我們在櫛孔扇貝總共鑒定出Smad3、Smad4、Smad5和Smad6四個Smad基因(表3)。四個基因全長差異較大, 其中Smad3基因最長, 達(dá)50 088 bp,Smad5基因最短, 為13 759 bp。在外顯子數(shù)量方面,Smad3最多, 有13 個外顯子,Smad6數(shù)量最小, 有5個外顯子。這些Smad 的預(yù)測分子量范圍從41.28 到62.46 kDa, 預(yù)測的等電點(pI)范圍從6.34 到8.37 (表3)。通過Smad 蛋白序列在SMRT 上進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(圖1), 4 個Smad基因都具有N 端結(jié)構(gòu)域MH1 和C端結(jié)構(gòu)域MH2。同一亞族的成員含有大致相同的基序組成和排列順序, 例如 R-Smad 成員均具有Motif1-13。不同亞族中的蛋白序列Motif 組成和分布存在較大差異, 僅Motif1、Motif2、Motif4 和Motif8是三個亞家族共有的。

表3 櫛孔扇貝Smad 基因家族序列特征Tab.3 Sequences of C. farreri Smad genes

2.2 櫛孔扇貝 Smad 基因家族的系統(tǒng)發(fā)生分析及Smad 成員共線性分析

系統(tǒng)發(fā)生分析表明,Smad基因主要聚為4 個支,即TGF-β 通路R-Smad、BMP 通路R-Smad、Co-Smad和I-Smad(圖2)。其中TGF-β 通路R-Smad和BMP通路R-Smad同屬R-Smad亞家族。櫛孔扇貝中的Smad3、Smad4、Smad5、Smad6分別聚到TGF-β 通路R-Smad、Co-Smad、BMP 通路R-Smad和I-Smad四個亞族中。在本文所分析的所有無脊椎動物中,Smad數(shù)量都為4 個。軟體動物Smad基因家族成員基本類似。其中櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和牡蠣享有完全相同的Smad基因家族成員, 這與它們高度相近的親緣關(guān)系情況相一致。櫛孔扇貝的Smad3與其他物種的Smad2和Smad3聚在一起;Smad5與其他物種的Smad1、Smad5、Smad9聚類, 兩者所在的亞族分別調(diào)控不同的信號通路, TGF-β 通路R-Smad和BMP 通路R-Smad的同源性高于其與Co-Smad和I-Smad的同源性。櫛孔扇貝的Smad4與其他物種的Smad4聚類,Co-Smad亞族中只有一種Smad4, 負(fù)責(zé)與R-Smad 蛋白形成異源復(fù)合物。櫛孔扇貝Smad6與其他物種的Smad6、Smad7聚類。脊椎動物含有完備的Smad基因家族成員, 數(shù)量都為8 個。其中,Smad1、Smad2、Smad7和Smad9為脊椎動物特異性Smad基因。Smad1、Smad5和Smad9聚為一支;Smad2和Smad3聚為一支;Smad6和Smad7具有更近的共同祖先, 暗示這些Smad基因可能由基因或染色體加倍產(chǎn)生。這一發(fā)現(xiàn)也得到了共線性分析的支持(圖3)。軟體動物的Smad3、Smad4和Smad6分布在同一條染色體上。而在本文所分析的脊椎動物中Smad3和Smad6在同一條染色體上,Smad2、Smad4和Smad7在同一條染色體。暗示Smad基因家族在脊椎動物的演化中發(fā)生了加倍。

圖2 Smad 家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree of Smad genes

圖3 Smad 基因在染色體或scaffold 上的分布Fig.3 Distribution of Smad genes on chromosomes and scaffolds

2.3 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析及GO 富集結(jié)果

共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 櫛孔扇貝Smad3、Smad4、Smad5和Smad6分別富集在M14、M12、M9 和M6模塊中(圖4a)。M14、M12、M9 和M6 模塊分別包含2 025、2 709、2 369 和2 564 個基因。Smad基因在10 種成體組織中的表達(dá)具有明顯特異性,Smad3在橫紋肌和平滑肌中表達(dá)量最高, 暗示其參與了肌肉的形成和發(fā)育(圖4b)。Smad3基因所在的模塊主要富集到細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)復(fù)合物等GO 功能(表4)。Smad4在櫛孔扇貝各個成體組織中均有表達(dá), 其中性腺中表達(dá)量最高, 表明其可能在性腺的形成和發(fā)育中起重要作用(圖4c)。Smad4所在的基因模塊主要富集到細(xì)胞器組織和信號受體活性等GO 功能(表5)。Smad5在血液中特異性高表達(dá), 暗示其調(diào)控血細(xì)胞的生成(圖4d)。另外, 我們發(fā)現(xiàn)與Smad5共表達(dá)的基因中包含大量Toll樣受體信號通路的關(guān)鍵基因(表6)。Smad5所在的基因模塊主要富集到蛋白質(zhì)結(jié)合和蛋白質(zhì)復(fù)合物等GO 功能(表7)。Smad6在鰓中表達(dá)量最高, 暗示其可能在鰓中起調(diào)控作用(圖4e)。Smad6所在的基因模塊主要富集到對外界刺激的反應(yīng)調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)結(jié)合等GO 功能(表8)。

表4 M14 模塊基因GO 富集結(jié)果Tab.4 GO enrichment analysis of the M14 genes

表5 M12 模塊基因GO 富集結(jié)果Tab.5 GO enrichment analysis of the M12 module genes

表6 M9 模塊中Toll 樣受體信號通路的關(guān)鍵基因Tab.6 The key genes of Toll like receptor signaling pathway in M9 module

表7 M9 模塊GO 富集結(jié)果Tab.7 GO enrichment analysis of the M9 module genes

表8 M6 模塊GO 富集結(jié)果Tab.8 GO enrichment analysis of M6 module gene

圖4 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和Smad 及其共表達(dá)基因在櫛孔扇貝成體組織中的表達(dá)量熱圖Fig.4 WGCNA and heatmaps of Smad and their co-expressed genes among adult tissues in C. farreri

2.4 鰻弧菌侵染72 h 內(nèi)Smad 基因的免疫應(yīng)答分析

為研究Smad基因響應(yīng)鰻弧菌侵染的表達(dá)模式,本研究監(jiān)測了侵染72 h 內(nèi)櫛孔扇貝的Smad基因表達(dá)變化。結(jié)果顯示,Smad3基因在侵染24 h 時上調(diào)表達(dá), 48 h 之后與0 h 的表達(dá)量基本一致。Smad5基因在侵染24 h 時, 表達(dá)量上調(diào)1.74 倍, 顯著上調(diào)。在侵染48 h 時,Smad5基因的表達(dá)量較24 h 有所降低,但仍顯著高于0 h 時。直至侵染后的72 h,Smad5基因的表達(dá)逐步恢復(fù)正常, 與0 h 的表達(dá)量基本一致(圖5)。暗示Smad3和Smad5基因參與了櫛孔扇貝的免疫應(yīng)答。

圖5 鰻弧菌感染后Smad 基因在櫛孔扇貝血淋巴中的表達(dá)模式Fig.5 Expression of Smad genes in the hemolymph of C. farreri after V. anguillarum challenge

3 討論

本研究通過檢測Smad基因的表達(dá)量以及構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò), 分析了Smad基因及其共表達(dá)基因在櫛孔扇貝不同成體組織中的表達(dá)模式。Smad基因家族各基因在櫛孔扇貝成體各組織均產(chǎn)生了不同程度的表達(dá),Smad3在橫紋肌中表達(dá)量最高, 暗示其在肌肉組織生長和發(fā)育過程中具有重要作用。在哺乳動物中,成肌細(xì)胞中的Smad3可以與轉(zhuǎn)錄因子Myod1結(jié)合,促進(jìn)成肌細(xì)胞的肌源性分化(Huanget al, 2016)。在三角帆蚌中, 敲降Smad3可加速傷口的愈合(Huet al,2017)。Smad4是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物中唯一一個Co-Smad成員, 可以介導(dǎo)所有TGF-β 超家族成員信號的傳遞(Nakaoet al, 1997)。Smad4在櫛孔扇貝肌肉、眼、鰓、腎、性腺、肝胰腺、外套膜、血和足中均有不同程度的表達(dá), 這說明與哺乳動物中Smad4廣泛的生物學(xué)作用一致。其中, 性腺中Smad4表達(dá)量最高,暗示了該基因可能參與了扇貝的性腺發(fā)育。在哺乳動物中,Smad4對于卵巢顆粒細(xì)胞的增殖與分化、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的增殖與凋亡、卵母細(xì)胞的成熟、排卵、繁殖性能等方面有著重要作用。Smad4在水牛和綿羊的卵巢中高度表達(dá)。有實驗證明, 特異性敲除小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的Smad4基因, 會導(dǎo)致雌性小鼠生育能力下降甚至不育; 特異性敲除卵母細(xì)胞中的Smad4基因, 也會導(dǎo)致小鼠不育(秦智娟等, 2016)。Smad5在血液中特異性高表達(dá), 暗示其參與調(diào)控了血細(xì)胞的生成與發(fā)育。在哺乳動物中,Smad5調(diào)控胚胎的造血發(fā)育機制并且介導(dǎo)由中胚層細(xì)胞向造血特化的負(fù)向調(diào)控。Smad5缺失小鼠的原始紅系祖細(xì)胞增殖形成集落的能力減弱。Smad6在鰓中的表達(dá)量最高, 推測其在鰓中發(fā)揮調(diào)控作用。鰓是貝類濾食、呼吸的重要器官, 其與外界接觸最多, 需要對外部環(huán)境的變化及時做出調(diào)節(jié)反應(yīng)(郭海燕等, 2007)。

貝類只存在天然免疫, 其主要通過血淋巴細(xì)胞行使天然免疫功能(劉世良等, 2003)。為探究Smad基因家族在貝類免疫調(diào)節(jié)中的作用機制, 本研究分析了鰻弧菌侵染72 h 內(nèi)血細(xì)胞中Smad基因家族各成員的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Smad3和Smad5均上調(diào)表達(dá)。其中,Smad5在侵染后的24 h 時, 發(fā)生顯著上調(diào)。這與Hu 等(2017)在用嗜水氣單胞菌感染三角帆蚌后,血細(xì)胞中Smad3和Smad5的表達(dá)變化情況基本相一致。在哺乳動物中,Smad3可通過調(diào)控增強子結(jié)合蛋白(CEBP/ε)來促進(jìn)中性粒細(xì)胞的成熟和功能極化, 進(jìn)而增強機體的抗感染能力, 發(fā)揮天然免疫調(diào)節(jié)作用。我們推測,Smad3在扇貝中也發(fā)揮天然免疫調(diào)控功能。另外我們發(fā)現(xiàn)與Smad5共表達(dá)的基因中包含大量Toll樣受體信號通路的關(guān)鍵基因(表 8)。Toll樣受體(TLRs)是一類在脊椎動物和無脊椎動物中發(fā)揮天然免疫反應(yīng)極為重要的蛋白質(zhì)分子。Toll樣受體對病原體的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)進(jìn)行識別, 是天然免疫發(fā)揮防御作用的關(guān)鍵。到目前為止, 已發(fā)現(xiàn)11個TLR家族成員(胡寧克等, 2011)。邱麗梅(2006)在櫛孔扇貝中克隆得到了CfToll-1、CfMyD88、CfTRAF6、CfNFkB和CfIkB基因, 表明貝類中確實存在TLR信號通路。據(jù)此, 可以推測Smad5 與TLR家族相互作用, 共同調(diào)控扇貝的免疫應(yīng)答。

此外, 我們還分析了各Smad成員的共線性情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在所有分析物種中Smad3和Smad6均在分布同一條染色體上。考慮到軟體動物的早期起源及其相對原始的基因組, 這意味著Smad3和Smad6的共染色體現(xiàn)象可能早已存在于兩側(cè)對稱動物的共同祖先中(Liet al, 2017)。

4 結(jié)論

綜上所述, 本研究中通過對櫛孔扇貝Smad基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、以及鰻弧菌侵染的免疫應(yīng)答分析, 解析了貝類Smad基因家族的表達(dá)調(diào)控機制和在免疫應(yīng)答中的作用。結(jié)果表明,Smad3和Smad6的共染色體現(xiàn)象可能早已存在于兩側(cè)對稱動物的共同祖先中;Smad5基因可能通過與Toll樣受體信號通路相互作用, 參與機體的免疫應(yīng)答。本研究將為貝類Smad基因在天然免疫系統(tǒng)中的作用提供進(jìn)一步參考。