張俊華，高云，馬衛(wèi)國(guó)，許青霞

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科，鄭州 450008)

實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)的理想動(dòng)物模型[1]。MS是主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，其中CD4+T細(xì)胞在疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]，同時(shí)CD8+T細(xì)胞甚至B細(xì)胞在EAE發(fā)病過程中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)[3]。胸腺是T細(xì)胞分化發(fā)育成熟的主要器官[4]，T細(xì)胞在胸腺內(nèi)的分化發(fā)育可分為3個(gè)階段：即CD4CD8雙陰性(double negative，DN)細(xì)胞階段；CD4CD8雙陽(yáng)性(double positive，DP)細(xì)胞階段；CD4單陽(yáng)性(CD4 single positive，CD4SP)或CD8單陽(yáng)性(CD8 single positive，CD8SP)細(xì)胞階段，它們是由DP細(xì)胞經(jīng)陽(yáng)性和陰性選擇而分化發(fā)育成熟的具有免疫功能的T細(xì)胞。已有研究發(fā)現(xiàn)，存在胸腺的EAE小鼠在發(fā)病高峰期后會(huì)有自發(fā)恢復(fù)期，而摘除胸腺的EAE小鼠將缺失自發(fā)恢復(fù)期，此現(xiàn)象提示胸腺對(duì)EAE小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]。因?yàn)殛P(guān)于胸腺對(duì)EAE發(fā)病機(jī)制作用的報(bào)道甚少，本研究將探索EAE小鼠胸腺細(xì)胞亞群變化，以闡述EAE小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)特異性胸腺細(xì)胞的分化機(jī)制，進(jìn)而為EAE的發(fā)病機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料6～8周齡C57BL/6小鼠25只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)在中美(河南)荷美爾腫瘤研究院SPF級(jí)動(dòng)物房中。MOG35-55(肽序列：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys)，純度98%，購(gòu)于上海吉爾生化公司；弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA，滅活結(jié)核分枝桿菌含量5 mg/mL)購(gòu)于上海三踏生物科技有限公司；百日咳毒素(pertussis toxin，PT)購(gòu)于北京聯(lián)立信生物技術(shù)有限責(zé)任公司；大鼠抗小鼠抗體CD4-FITC、CD8-PE購(gòu)于eBioscience公司；Annexin Ⅴ/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 EAE模型的構(gòu)建及臨床評(píng)分 對(duì)21只C57BL/6小鼠兩點(diǎn)背部皮下免疫200 μL乳化劑(5 mg/mL CFA與1.5 mg/mL MOG按照1∶1比例配制，使用乳化管反復(fù)推拉混勻，形成油包水樣的乳劑)。免疫后第0和2天經(jīng)小鼠尾靜脈注射PT稀釋液(200 μL/只，PT試劑2 μL稀釋于PBS緩沖液中)[7]。記錄小鼠的臨床評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0，正常小鼠；0.5，尾巴部分癱瘓；1，尾巴完全癱瘓；1.5，一后肢無(wú)力；2，兩后肢均無(wú)力；2.5，一后肢癱瘓，一后肢無(wú)力；3，兩后肢均癱瘓；3.5，前肢無(wú)力；4，一前肢無(wú)力，一前肢癱瘓；4.5，前肢完全癱瘓；5，死亡。同時(shí)對(duì)3只對(duì)照組小鼠皮下注射PBS。

1.2.2 胸腺單細(xì)胞懸液的獲取 EAE誘導(dǎo)后第0、5、10、15天各取3只小鼠，頸椎脫臼處死，打開小鼠胸腔暴露心臟上方白色的胸腺，從根部摘除，觀察胸腺大小。使用剪刀將小鼠的胸腺剪碎，使用研磨棒研磨胸腺組織塊，充分研磨后用70 μm濾網(wǎng)過濾，2 009×g離心5 min，棄上清液，PBS重懸獲得單個(gè)胸腺細(xì)胞懸液備用。用同樣的方法獲取3只PBS對(duì)照小鼠及臨床評(píng)分分別為0、1、3.5的小鼠胸腺細(xì)胞，并在倒置顯微鏡下使用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)胸腺細(xì)胞。

1.2.3 凋亡檢測(cè)和FACS分析 按照1.5×106/管的檢測(cè)量取胸腺細(xì)胞懸液，并根據(jù)Annexin Ⅴ/PI試劑盒的操作步驟進(jìn)行凋亡檢測(cè)，標(biāo)記大鼠抗小鼠抗體CD4-FITC、CD8-PE，使用FlowJo軟件分析胸腺細(xì)胞凋亡情況和胸腺細(xì)胞亞群DN、DP、CD4SP、CD8SP細(xì)胞的比例變化。

2 結(jié)果

2.1 胸腺細(xì)胞數(shù)與EAE病程的關(guān)系EAE誘導(dǎo)第9～10天小鼠開始發(fā)病并呈現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀，第15天左右小鼠發(fā)病達(dá)到高峰，第20～22天小鼠癥狀開始部分緩解(圖1A)；根據(jù)EAE病程，選取具有代表性的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：EAE誘導(dǎo)后第0天(對(duì)照)，第5天(發(fā)病前期)，第10天(發(fā)病起始期)，第15天(發(fā)病高峰期)。計(jì)數(shù)4組小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示，在EAE誘導(dǎo)后第5天胸腺細(xì)胞數(shù)顯著升高，第10天和第15天又逐漸降低，其中在發(fā)病高峰期的第15天胸腺細(xì)胞數(shù)最低(圖1B)。

注：A.EAE誘導(dǎo)后臨床評(píng)分；B.EAE誘導(dǎo)后第0、5、10、15天胸腺細(xì)胞數(shù)。與第0天組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 胸腺細(xì)胞數(shù)與EAE小鼠病程的關(guān)系

2.2 胸腺細(xì)胞數(shù)與EAE臨床評(píng)分的相關(guān)性與PBS組比較，0臨床評(píng)分組小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，且0、1、3.5臨床評(píng)分組小鼠間的胸腺細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 PBS組小鼠和臨床評(píng)分0、1、3.5組小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)的比較

2.3 胸腺細(xì)胞亞群凋亡分析EAE誘導(dǎo)后第5天胸腺細(xì)胞凋亡率開始升高，第10天凋亡率最高，達(dá)到8%左右，并且與第0天比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)，然而第15天又急劇下降至第0天的水平(圖2A)。另外，對(duì)凋亡率最高的第10天小鼠進(jìn)行胸腺細(xì)胞亞群凋亡率分析，發(fā)現(xiàn)凋亡率最高的是DP細(xì)胞，CD4SP、CD8SP細(xì)胞次之，DN細(xì)胞最低(圖2C)，且其他3類細(xì)胞凋亡率與DP細(xì)胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

注：A.4組小鼠胸腺細(xì)胞凋亡比例；B～C.DN、DP、CD4SP、CD8SP細(xì)胞亞群的凋亡分析。*P<0.05。圖2 胸腺細(xì)胞凋亡分析

2.4 EAE誘導(dǎo)后胸腺細(xì)胞亞群分析DN、CD4SP、CD8SP細(xì)胞在EAE誘導(dǎo)后比例逐漸升高，DP細(xì)胞則逐漸降低(P<0.05，圖3)。

注：A.4組小鼠胸腺細(xì)胞亞群流式分析；B.4組小鼠胸腺細(xì)胞亞群統(tǒng)計(jì)分析。第0、5、10、15天4組小鼠比較，*P<0.05。圖3 EAE誘導(dǎo)后胸腺細(xì)胞亞群分析

3 討論

MS是一種免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病[8-9]，其中髓鞘主要浸潤(rùn)細(xì)胞為T細(xì)胞[10]。用于MS研究最廣泛的動(dòng)物模型是EAE大鼠或小鼠，其主要致病細(xì)胞是Th1和Th17[11]，但EAE潛在的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。胸腺是重要的淋巴器官之一，骨髓來源的祖細(xì)胞在這里經(jīng)歷增殖分化，最終產(chǎn)生功能性T細(xì)胞[12]。另外，胸腺是控制器官特異性的自身免疫中心，既通過陽(yáng)性選擇獲得MHC限制性，也通過陰性選擇獲得自身免疫耐受性[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，切除新生豚鼠的胸腺可以防止或明顯延遲EAE癥狀的出現(xiàn)[14]；相似的，有研究證實(shí)T細(xì)胞是產(chǎn)生EAE體征和組織學(xué)損傷所必需的[15]，綜上可知，MS患者的胸腺功能可能發(fā)生了變化。為了更好地闡述EAE誘導(dǎo)后胸腺發(fā)生的變化，尤其是胸腺來源MOG特異性T細(xì)胞的變化，本研究分析了4個(gè)病程時(shí)間點(diǎn)——EAE誘導(dǎo)后第0天(對(duì)照)、第5天(發(fā)病前期)、第10天(發(fā)病起始期)和第15天(發(fā)病高峰期)的胸腺細(xì)胞變化，主要是胸腺細(xì)胞亞群變化及凋亡情況，這些對(duì)胸腺細(xì)胞在EAE誘導(dǎo)后的增殖分化過程的研究將有助于EAE發(fā)病機(jī)制的闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)，在EAE誘導(dǎo)后第5天胸腺細(xì)胞數(shù)顯著升高，第10天和第15天又明顯下降，可以認(rèn)為小鼠在誘導(dǎo)物MOG抗原的早期作用下先動(dòng)員了胸腺細(xì)胞的增殖分化。另外本研究發(fā)現(xiàn)，臨床評(píng)分越高的小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)越低，這與很多學(xué)者證實(shí)的EAE小鼠胸腺萎縮結(jié)論相一致[5]，在其他MS模型中也有發(fā)現(xiàn)胸腺萎縮，如大鼠EAE模型[16]、患有原發(fā)性進(jìn)展性EAE的A.SW小鼠[17]等。因?yàn)樾叵偈荰細(xì)胞分化發(fā)育成熟的器官[18]，在胸腺細(xì)胞中，DP細(xì)胞通過陽(yáng)性選擇分化發(fā)育為單陽(yáng)性細(xì)胞，而未通過陽(yáng)性選擇的DP細(xì)胞全部凋亡，故進(jìn)一步研究胸腺細(xì)胞的凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)，EAE誘導(dǎo)后胸腺細(xì)胞凋亡率開始升高，在EAE誘導(dǎo)后第10天凋亡率達(dá)到最高，第15天又下降。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，凋亡率最高的第10天小鼠其主要凋亡細(xì)胞亞群是DP細(xì)胞。這一數(shù)據(jù)說明，EAE誘導(dǎo)后至發(fā)病起始期胸腺細(xì)胞中DP細(xì)胞的陽(yáng)性選擇進(jìn)程加快，也就是胸腺細(xì)胞分化發(fā)育成熟為MOG特異性效應(yīng)T細(xì)胞的速度加快。為了進(jìn)一步獲得EAE誘導(dǎo)后胸腺細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化，本研究利用FACS發(fā)現(xiàn)，除了DP細(xì)胞比例在EAE誘導(dǎo)后逐漸減少，DN、CD4SP、CD8SP細(xì)胞的比例在EAE誘導(dǎo)后都逐漸升高，這一數(shù)據(jù)也與前面DP細(xì)胞凋亡最嚴(yán)重的結(jié)果相一致。

綜上所述，EAE誘導(dǎo)后至發(fā)病初始階段胸腺細(xì)胞中MOG特異性胸腺細(xì)胞增殖加快，凋亡率增加，其可能機(jī)制為在疾病發(fā)生之前MOG抗原通過加速對(duì)胸腺內(nèi)DP細(xì)胞的陽(yáng)性選擇來產(chǎn)生更多MOG特異性效應(yīng)T細(xì)胞，這些細(xì)胞隨著疾病的進(jìn)展最終遷移至致病部位并表現(xiàn)出相應(yīng)的臨床癥狀。本研究能夠詳細(xì)地描述EAE誘導(dǎo)后MOG特異性胸腺細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化，可為闡述EAE發(fā)病機(jī)制提供幫助。