黃政，涂榮會，鐘國強，方存明，馬小林，胡學(xué)俊

(1.宣城市人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，宣城 242000；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，南寧 530022)

缺氧后適應(yīng)(hypoxic postconditioning，HPC)是減輕心肌缺血-再灌注損傷的有效方法，其機制可能與抑制免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB信號通路在缺血-再灌注后的心肌免疫炎性損傷中發(fā)揮重要作用[2]，積極干預(yù)TLR4/NF-κB信號通路可能是減輕心肌缺血-再灌注損傷的新靶點。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)對損傷的心肌細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為細胞內(nèi)HSP70能夠與NF-κB結(jié)合，抑制NF-κB下游炎性蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。另外，細胞內(nèi)HSP70也可對TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用。缺血預(yù)適應(yīng)以及某些藥物可通過上調(diào)HSP70表達減輕心肌缺血-再灌注損傷[3-4]。HPC的心肌保護作用是否與TLR4/NF-κB信號通路以及HSP70表達有關(guān)，目前鮮見報道。本研究通過建立心肌細胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷模型，實施HPC，體外模擬心肌HPC，從細胞水平探討HPC對HSP70、TLR4/NF-κB信號通路以及心肌細胞免疫炎性損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料H9C2心肌細胞系購自中國科學(xué)院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)液、FBS購自Gibco公司，槲皮素(quercetin，Quer)購自北京索萊寶科技公司，大鼠HSP70、TLR4、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6、、B淋巴細胞瘤2基因(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、Caspase-3、β-actin抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，Hoechst 33242染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理及分組 用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2心肌細胞，置于37 ℃、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中；細胞缺氧培養(yǎng)時更換為DMEM無糖培養(yǎng)液，置于含5% CO2、95% N2混合氣體的厭氧罐中；細胞復(fù)氧培養(yǎng)時再次更換為DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中。按照不同處理方式將細胞分為4組：(1)對照組(常氧培養(yǎng)10 h)；(2)H/R組(缺氧4 h后復(fù)氧6 h)；(3) HPC組(缺氧4 h后行復(fù)氧5 min/缺氧5 min，共3次，再復(fù)氧6 h)；(4)HPC+ Quer組(缺氧前1 h加50 μmol/L的HSP70抑制劑Quer后行HPC)。

1.2.2 Hoechst 33242染色觀察細胞形態(tài) 取處于對數(shù)生長期的細胞接種于細胞爬片上，培養(yǎng)至約80%融合時進行分組處理。處理結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，用PBS漂洗后加入4%多聚甲醛，室溫固定10 min，再加入終濃度為10 μg/mL的Hoechst 33242染色液，避光染色5 min后加入抗熒光淬滅封片劑，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 FACS檢測細胞凋亡情況 用胰蛋白酶消化各組細胞，離心后收集細胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入適量的1×結(jié)合緩沖液輕輕吹打重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×109個/L，取100 μL細胞懸液加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混勻，室溫孵育15 min。再加入5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，用FACS檢測細胞的凋亡情況。

1.2.4 Western blotting檢測蛋白的表達 將各組細胞加至RIPA裂解液中冰上裂解30 min，以16 660×g離心10 min后取上清液。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白上樣，SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗溶液(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，再加入二抗溶液室溫孵育1 h。經(jīng)洗滌、顯影、灰度掃描后，用Odyssey 3.0軟件對蛋白條帶進行灰度值測定。蛋白質(zhì)的表達量以目的條帶與β-actin的灰度比值表示。

2 結(jié)果

2.1 HPC對心肌細胞HSP70表達的影響與對照組比較，H/R組HSP70表達水平顯著升高(P<0.05)，HPC組HSP70表達水平較H/R組進一步升高(P<0.05)，而HPC+Quer組HSP70表達水平較HPC組顯著下降(P<0.05，圖1)。

注： A. Western blotting檢測HSP70蛋白的表達；B.各組細胞HSP70蛋白相對表達量的比較。與對照組比較，* P<0.05；與H/R組比較，#P<0.05；與HPC組比較，△P<0.05。圖1 各組細胞HSP70蛋白表達水平的比較

2.2 HPC中HSP70對心肌細胞凋亡的影響Hoechst 33242染色結(jié)果顯示， 對照組細胞核形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形，淡藍色，未見凋亡細胞；H/R組可見較多細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染、顏色發(fā)白的凋亡細胞；HPC組凋亡細胞較H/R組減少；HPC+Quer組凋亡細胞較HPC組增多(圖2)。

圖2 Hoechst 33242 染色觀察細胞形態(tài)變化(×200)

與Hoechst 33242染色結(jié)果一致，F(xiàn)ACS檢測結(jié)果顯示，H/R組細胞凋亡率[(61.9±1.8)%]較對照組[(8.6±0.2)%]顯著增加(P<0.05)；HPC組細胞凋亡率[(26.6±1.3)%]較H/R組[(61.9±1.8)%]顯著減少(P<0.05)；而HPC+Quer組細胞凋亡率[(54.8±1.4)%]較HPC組[(26.6±1.3)%]顯著增加(P<0.05，圖3)。

注： A.FACS檢測心肌細胞凋亡情況；B.各組心肌細胞凋亡率的比較。與對照組比較，*P<0.05；與H/R組比較，#P<0.05；與HPC組比較，△P<0.05。圖3 FACS檢測心肌細胞凋亡情況

2.3 HPC中HSP70對TLR4、NF-κB p65表達的影響H/R組TLR4、NF-κB p65表達水平較對照組顯著升高(P<0.05)；HPC組TLR4、NF-κB p65表達水平較H/R組顯著下降(P<0.05)；而HPC+Quer組TLR4、NF-κB p65表達水平較HPC組顯著升高(P<0.05，圖4)。

2.4 HPC中HSP70對炎性因子表達的影響H/R組TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；HPC組TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著低于H/R組(P<0.05)；而HPC+Quer組TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著高于HPC組(P<0.05，圖5)。

注： A. Western blotting檢測TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表達；B.各組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白相對表達量的比較；與對照組比較，*P<0.05；與H/R組比較，#P<0.05；與HPC組比較，△P<0.05。圖5 各組心肌細胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達水平的比較

2.5 HPC中HSP70對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響H/R組Bcl-2表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，Bax、Caspase-3表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。HPC組Bcl-2表達水平顯著高于H/R組(P<0.05)，Bax、Caspase-3表達水平顯著低于H/R組(P<0.05)。而HPC+Quer組Bcl-2表達水平顯著低于HPC組(P<0.05)，Bax、Caspase-3表達水平顯著高于HPC組(P<0.05)。詳見圖6。

3 討論

本研究通過建立心肌細胞H/R損傷模型，并應(yīng)用HSP70抑制劑Quer干預(yù)，從細胞水平探討HPC中HSP70對TLR4/NF-κB信號通路及炎性因子表達的影響。結(jié)果顯示，HPC在顯著上調(diào)心肌細胞HSP70表達的同時，抑制TLR4、NF-κB p65及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達，減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷和凋亡，而應(yīng)用HSP70抑制劑Quer后上述效應(yīng)被減弱。本研究結(jié)果提示，HPC可能通過HSP70抑制TLR4/NF-κB信號通路，減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞免疫炎癥損傷。

心肌缺血-再灌注損傷的發(fā)生并不少見。缺血心肌血流恢復(fù)后可產(chǎn)生不同程度的心肌結(jié)構(gòu)改變以及細胞凋亡、壞死加重，這些改變在臨床上難以被常規(guī)手段檢測到，容易被忽略。因此，預(yù)防和減輕缺血-再灌注損傷對進一步改善再灌注治療患者的預(yù)后具有重要意義。

HSP是細胞在應(yīng)激狀態(tài)下新合成或合成增加的一組保護性蛋白，主要功能是協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊、復(fù)性和移位，從而維持細胞結(jié)構(gòu)、功能穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激、鈣超載均可誘導(dǎo)HSP70表達，后者通過其分子伴侶作用維護客戶蛋白的穩(wěn)定，維持細胞內(nèi)外鈣離子平衡，減輕細胞氧化應(yīng)激損傷[5-6]。HSP70也可通過Fas、JNK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制凋亡相關(guān)蛋白(如AIF、eEF2等)的表達，減少心肌細胞凋亡[7-9]。通過缺血預(yù)處理、藥物等手段誘導(dǎo)HSP70表達可減少缺血-再灌注動物模型的心肌細胞凋亡，減小心肌梗死面積，改善心臟功能[6，10]。本研究發(fā)現(xiàn)，HPC在上調(diào)HSP70的同時顯著抑制促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達，顯著減少H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，而應(yīng)用HSP70抑制劑Quer后這種效應(yīng)被減弱，提示HPC抑制心肌細胞凋亡的機制可能與其上調(diào)HSP70表達有關(guān)。

需要指出的是，Quer是一種具有多種生物活性的化合物，其藥理作用包括抗脂質(zhì)過氧化、抑制腫瘤細胞增殖、抗菌、抗炎、抗過敏、降血壓、改善內(nèi)皮功能等。雖然Quer不是HSP70特異性抑制劑，但因其無細胞毒性而被作為HSP70抑制劑廣泛用于各種心血管疾病的研究[11-13]。Song等[14]在大鼠離體心肌細胞和在體心臟的研究中發(fā)現(xiàn)，采用p38 MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理可顯著減輕大鼠心肌細胞H/R和心肌缺血-再灌注損傷，采用shRNA敲除HSP70基因則顯著加重大鼠心肌細胞H/R和心肌缺血-再灌注損傷，而應(yīng)用Quer可以達到與敲除HSP70基因類似的效果。本研究同樣采用Quer作為抑制劑干預(yù)HSP70表達，所得結(jié)果與文獻報道[11]一致。

目前已證實，TLR在介導(dǎo)心、腦、腎等器官的缺血-再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用[15-17]。TLR4是重要的PRR，在心肌組織中高表達。心肌缺血-再灌注損傷時氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥反應(yīng)等導(dǎo)致心肌細胞結(jié)構(gòu)、功能受損，受損細胞釋放的損傷相關(guān)分子模式或內(nèi)源性配體可被TLR4識別，激活TLR4介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，使心肌細胞成為自身免疫系統(tǒng)攻擊的靶標。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4通過上調(diào)Bax、Caspase-3表達并下調(diào)Bcl-2表達，促進新生大鼠H/R心肌細胞凋亡[18]。HSP70在TLR4介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。細胞外HSP70可作為TLR4的配體，激活TLR4介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而細胞內(nèi)HSP70則通過TLR4、NF-κB等信號通路抑制免疫應(yīng)答[11，19]。本研究發(fā)現(xiàn)，HPC在上調(diào)細胞內(nèi)HSP70的同時顯著抑制TLR4表達，并減少H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，而應(yīng)用HSP70抑制劑Quer后這種效應(yīng)被減弱，提示HPC中HSP70可能通過抑制TLR4活化參與對缺血-再灌注心肌細胞的保護。

炎癥反應(yīng)是心肌缺血-再灌注損傷發(fā)生的重要機制之一。TLR4/NF-κB是經(jīng)典的炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其激活后可促進下游炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6等表達，而這些炎性因子又能誘導(dǎo)靶細胞凋亡、壞死、血管內(nèi)皮功能紊亂[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，HPC在上調(diào)HSP70并抑制TLR4表達的同時，顯著減少NF-κB p65表達，NF-κB的下游蛋白TNF-α、IL-1β、IL-6表達也顯著減少，提示HPC減輕炎癥反應(yīng)的機制可能與其抑制TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。事實上，缺血-再灌注時TLR4/NF-κB信號通路激活的始動因素是細胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，而HPC通過上調(diào) HS70表達以及其他機制減輕了細胞損傷和凋亡，從上游阻斷了TLR4/NF-κB信號通路的激活。

綜上所述，本研究顯示HPC通過上調(diào)HSP70表達減輕H/R誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號通路活化，減輕心肌細胞免疫炎性損傷和凋亡。本研究結(jié)果是對HPC心肌保護作用機制的新補充。