武玉姣,張夢,俞倩穎,周瑤,夏振煒
(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 兒內(nèi)科,上海 200025)
支氣管哮喘(下文簡稱哮喘)是一種慢性氣道炎癥性疾病,由固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞共同參與,引起氣道炎癥細(xì)胞浸潤,氣道反應(yīng)性增高,黏液分泌過度,最終導(dǎo)致氣道狹窄和重塑[1]。哮喘的臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)發(fā)作的咳嗽、喘息、胸悶等,嚴(yán)重者可因呼吸困難危及生命。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,由遺傳和環(huán)境等多因素引起的氣道免疫調(diào)節(jié)異常所致。既往觀點(diǎn)認(rèn)為,Th2型免疫應(yīng)答過度導(dǎo)致Th1/Th2免疫失衡是引起哮喘氣道炎癥的主要原因,近些年研究發(fā)現(xiàn)ILC2等也參與哮喘疾病的病理生理過程[2]。ILC2可產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13,促進(jìn)過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展,并能夠通過細(xì)胞接觸依賴的方式調(diào)節(jié)未致敏T細(xì)胞,促進(jìn)其定向分化為Th2,從而抑制其向Th1分化[3]。有研究指出,在缺乏T、B細(xì)胞的情況下,ILC2也可誘導(dǎo)哮喘氣道炎癥反應(yīng),表明ILC2在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中亦發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。因此,調(diào)節(jié)ILC2水平對于控制哮喘氣道炎癥反應(yīng)同樣重要。
血紅素加氧酶(heme oxygenase,HO)是一種細(xì)胞內(nèi)限速酶,可以將血紅素降解為膽綠素、游離二價鐵離子和CO,其有3種亞型:HO-1、HO-2和HO-3[5]。其中,HO-1是一種保護(hù)性蛋白,具有抗氧化應(yīng)激、抑炎、抗平滑肌增生及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等重要功能[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)氯化高鐵血紅素(hemin)上調(diào)HO-1表達(dá)后可減輕卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘發(fā)的過敏性哮喘小鼠模型氣道炎癥反應(yīng)[8-9]。本研究選用屋塵螨(house dust mite,HDM),一種存在于環(huán)境中的重要病原體(是目前最常見的哮喘過敏原)以致敏、激發(fā)、構(gòu)建過敏性哮喘小鼠模型。并且,經(jīng)hemin干預(yù)誘導(dǎo)HO-1高表達(dá),分析Th1/Th2比值及肺臟ILC2百分比,從而初步探討HO-1拮抗HDM誘發(fā)的小鼠過敏性哮喘氣道炎癥及對Th1/Th2比值、ILC2百分比的影響。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雌性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量(18±2) g,6~8周齡,30只,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司,飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 FACS相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑和抗體(亞美尼亞倉鼠抗小鼠): Lineage(CD3、Gr-1、CD11b、CD45R、Ter-119)-FITC、CD11c-APC、Ly6G-FITC、CD4-BV450、IL-4-FITC和IFN-γ-APC,購自BioLegend公司;抗CD90.2-PE-Cy7、GATA3-BV421、RORγt-AF647、Siglec-F-PE、CD11b-PE-Cy7和CD45-APC-Cy7抗體,購自BD公司;破膜固定液、Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色液,購自Thermo Fisher Scientific公司;IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13檢測試劑盒,購自BioLegend公司;兔抗鼠HO-1抗體,購自CST公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 小鼠過敏性哮喘模型的建立 小鼠過敏性哮喘模型的致敏、激發(fā)方法參照文獻(xiàn)[10](n=5)。吸入異氟烷麻醉小鼠后,于第0天(Day 0, D0, 后類推)鼻滴50 μL含100 μg HDM的PBS致敏;于D7~D11連續(xù)每天鼻滴50 μL含10 μg HDM的PBS激發(fā),建立HDM所致過敏性哮喘小鼠模型(HDM組)。對照組以等量PBS代替HDM混懸液滴鼻(CON組)。HDM + hemin組經(jīng)等量HDM處理,于-D2、-D1和D5、D6給予每只小鼠腹腔注射75 μmol/kg hemin。各組小鼠均于D14異氟烷麻醉后被處死并取材研究。
1.2.2 小鼠肺臟組織病理學(xué)觀察 取1.2.1小鼠右下肺組織,PBS漂洗后置于4%多聚甲醛中固定,常規(guī)石蠟包埋切片,H-E及PAS染色后鏡檢。
1.2.3 Western blotting檢測小鼠肺臟組織HO-1的表達(dá)水平 取1.2.1小鼠右上肺組織,加入1 mL預(yù)冷的含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA,60 Hz勻漿60 s后于冰上靜置1 h;4 ℃、12 000×g離心15 min,收集上清液,BCA試劑盒定量蛋白并調(diào)整其濃度。80 V蛋白電泳30 min,120 V電泳60 min;300 mA轉(zhuǎn)膜1 h后,將PVDF膜置于封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST)中室溫封閉1 h。以封閉液按1∶1 000稀釋兔抗鼠HO-1抗體,4 ℃孵育PVDF膜過夜。1×TBST洗膜后加入用相同溶液按1∶5 000稀釋的二抗,室溫孵育1 h。1×TBST洗膜后ECL顯色。
1.2.4 FACS檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil,EOS)和中性粒細(xì)胞(neutrophil,NEU)百分比 異氟烷麻醉后頸椎脫臼處死小鼠(n=5),取仰臥位鋪于解剖板上,剪開小鼠頸部皮膚暴露氣管,將22 G導(dǎo)管針插入氣管,注入預(yù)冷PBS灌洗3次,0.6 mL/次。收集BALF,4 ℃、460×g離心6 min后收集細(xì)胞沉淀,加入抗CD11c-APC、Ly6G-FITC、Siglec-F-PE、CD11b-PE-Cy7和CD45-APC-Cy7抗體,4 ℃避光孵育45 min,后使用FACS液漂洗并進(jìn)行相關(guān)檢測。
1.2.5 ELISA檢測小鼠肺臟組織炎性因子表達(dá)水平 取1.2.1小鼠左肺葉,預(yù)冷PBS漂洗1次,洗去紅細(xì)胞;加入含0.05% Triton X-100及蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的PBS 800 μL,組織勻漿器60 Hz勻漿60 s;冰上靜置1 h后,4 ℃、12 000×g離心15 min,收集上清液。按ELISA試劑盒說明書檢測上清液中炎性因子水平。
1.2.6 FACS檢測小鼠肺臟組織Th1/Th2比值和ILC2百分比 于超凈工作臺剪碎肺臟組織(取材自1.2.4小鼠),置于5 mL無菌離心管中,加入3 mL無菌膠原酶,于37 ℃水浴鍋消化30 min,經(jīng)70 μm尼龍篩過濾后得到肺單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板,1 mL/孔,加入50 ng/mL 佛波酯(phorbol ester, PMA)和1 μg/mL離子霉素,同時加入1∶1 000稀釋的布雷非德菌素A(brefeldin A, BFA)以阻斷細(xì)胞因子胞外分泌。于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞。加入抗表面標(biāo)志物抗體抗CD4-BV450 4 ℃染色45 min,F(xiàn)ACS液漂洗2次;加入100 μL破膜固定液,室溫避光孵育60 min,破膜緩沖液漂洗2次;加入抗胞內(nèi)細(xì)胞因子抗體(抗IFN-γ-APC、IL-4-FITC)4 ℃染色60 min,破膜緩沖液漂洗2次,加入適量FACS液,流式細(xì)胞儀檢測Th1、Th2百分比。
同樣,肺部灌洗后經(jīng)氣管注入1 mL膠原酶,將充滿膠原酶的肺組織置于2 mL含膠原酶的消化液中,37 ℃消化30 min,經(jīng)70 μm尼龍篩過濾后得到肺單細(xì)胞懸液。依據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果取適量體積單細(xì)胞懸液重懸于FACS液,加入抗表面標(biāo)志物抗體抗Lineage-FITC、CD90.2-PE-Cy7抗體,4 ℃染色45 min,F(xiàn)ACS液漂洗2次;用Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子破膜固定液4 ℃避光孵育60 min,破膜緩沖液漂洗2次;加入抗核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子抗體(抗GATA3-BV421、RORγt-AF647抗體)4 ℃染色60 min;破膜緩沖液漂洗2次,加入適量FACS液,流式細(xì)胞儀檢測ILC2百分比。
2.1 小鼠肺臟組織HO-1蛋白表達(dá)量變化Wes-tern blotting檢測小鼠肺臟組織HO-1蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示,HDM組HO-1蛋白表達(dá)量較CON組顯著增高(P<0.05),而hemin干預(yù)后,蛋白表達(dá)量再顯著增加(P<0.005)(圖1)。
注:A. Western blotting檢測小鼠肺臟組織中HO-1蛋白表達(dá)量;B. 不同組別小鼠肺臟組織中HO-1蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖。*P<0.05,**P<0.005。圖1 不同組別小鼠肺臟組織中HO-1蛋白表達(dá)量變化比較
2.2 造模小鼠肺臟組織病理學(xué)變化H-E和PAS染色結(jié)果顯示,HDM組小鼠氣道內(nèi)存在較多炎癥細(xì)胞浸潤,氣道分泌物增加,hemin干預(yù)后炎癥反應(yīng)明顯減輕,CON組未見明顯炎癥反應(yīng)(圖2)。
圖2 不同組別小鼠肺臟的組織病理學(xué)分析(400×)
2.3 小鼠BALF中EOS和NEU百分比變化FACS檢測BALF中EOS(CD45+Siglec-F+CD11c-)及NEU(CD45+Ly6G+CD11b+)百分比。結(jié)果顯示,HDM組BALF中EOS及NEU百分比較CON組顯著增加,以前者為主;hemin干預(yù)后,與HDM組相比,EOS、NEU百分比顯著降低(有P<0.05、P<0.005,圖3)。
注:A. FACS分析BALF中EOS(CD45+Siglec-F+CD11c-)百分比變化;B. FACS分析BALF中NEU(CD45+Ly6G+CD11b+)百分比變化;C. BALF中EOS百分比變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果;D. BALF中NEU百分比變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*P<0.05,**P<0.005。圖3 不同組別小鼠BALF中EOS及NEU百分比比較
2.4 小鼠肺臟組織中Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平變化ELISA檢測小鼠肺臟組織中Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)及Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與CON組相比,HDM組IFN-γ水平無顯著差異(P>0.05),IL-4、IL-5、IL-13水平顯著升高(均P<0.000 1);hemin干預(yù)后,與HDM組相比,IFN-γ水平無顯著變化(P>0.05),但I(xiàn)L-4、IL-5、IL-13水平顯著降低(P<0.000 1、P<0.005、P<0.05)(圖4)。
注:A. ELISA檢測不同組別小鼠肺臟組織中IFN-γ水平;B. ELISA檢測不同組別小鼠肺臟組織中IL-4水平;C. ELISA檢測不同組別小鼠肺臟組織中IL-5水平;D. ELISA檢測不同組別小鼠肺臟組織中IL-13水平。*P<0.05,**P<0.005,***P<0.000 1。圖4 不同組別小鼠肺臟組織中Th1、Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平變化比較
2.5 小鼠肺臟組織Th1/Th2比值變化FACS分析小鼠肺臟組織中Th1/Th2比值變化。結(jié)果顯示,HDM組Th1(CD4+IFN-γ+T)百分比與對照組相比有下降趨勢,而hemin干預(yù)后有所上升,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);HDM組Th2(CD4+IL-4+T)百分比較對照組顯著增加,在hemin干預(yù)后顯著下降(均P<0.005)。HDM組Th1/Th2比值顯著降低,同樣hemin干預(yù)后較HDM組比值顯著增加(P<0.000 1、P<0.05)。詳見圖5。
注:A. FACS分析小鼠肺臟Th1(CD4+IFN-γ+T)、Th2(CD4+IL-4+T)占CD4+T細(xì)胞百分比變化;B. 肺臟組織中Th1百分比變化統(tǒng)計(jì)圖;C. 肺臟組織中Th2百分比變化統(tǒng)計(jì)圖;D. 肺臟組織中Th1/Th2比值變化統(tǒng)計(jì)圖。*P<0.05,**P<0.005,***P<0.000 1。圖5 不同組別小鼠肺臟組織中Th1、Th2百分比及Th1/Th2比值變化比較
2.6 FACS分析小鼠肺臟組織ILC2百分比變化FACS分析小鼠肺臟組織ILC2(LIN-CD90.2+GATA3+)百分比變化。結(jié)果顯示,HDM組ILC2百分比較CON組顯著增加,hemin干預(yù)后與HDM組比較百分比顯著降低(均P<0.05, 圖6)。
注:A. FACS分析小鼠肺臟組織ILC2(LIN-CD90.2+GATA3+)百分比變化;B. 小鼠肺臟組織ILC2百分比變化統(tǒng)計(jì)圖。*P<0.05。圖6 不同組別小鼠肺臟組織中ILC2百分比變化比較
過敏性哮喘是一種復(fù)雜的氣道疾病,由于環(huán)境污染及生活方式的改變,其發(fā)病率逐年上升,給社會及個人帶來了嚴(yán)重的健康問題及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),而其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確。研究表明,Th2型免疫反應(yīng)過度,Th1型免疫反應(yīng)相對減弱是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要因素,既往研究認(rèn)為Th2產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子促進(jìn)IgE及大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,誘發(fā)EOS相關(guān)氣道炎癥[11]。近年研究發(fā)現(xiàn),哮喘是固有免疫與適應(yīng)性免疫相互作用的結(jié)果,二者共同促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生,ILC2也可產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子,促進(jìn)過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展[12]。ILC是一群參與固有免疫應(yīng)答的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞,由于缺少重組激活基因依賴的抗原特異性受體基因的重排,而不表達(dá)適應(yīng)性免疫細(xì)胞(T細(xì)胞或B細(xì)胞)抗原特異性受體[13]。ILC主要定位于黏膜屏障,在抵抗病原體入侵、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、維持黏膜穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)損傷組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[14]。ILC對維持肺臟微環(huán)境的平衡和穩(wěn)定,肺臟固有免疫穩(wěn)態(tài)十分重要,當(dāng)其數(shù)量或功能異常時,將參與到自身免疫性疾病、過敏、哮喘等的發(fā)生發(fā)展過程中[15]。
Th2和ILC2分別介導(dǎo)適應(yīng)性和固有免疫應(yīng)答。有研究表明,ILC2和CD4+T細(xì)胞可通過不同的機(jī)制相互激活,具有正向免疫調(diào)節(jié)作用[16]。但是,目前Th2及ILC2在過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展中的相對重要性尚不明確[17]。一方面,ILC2可在共刺激分子的作用下向CD4+T細(xì)胞提呈抗原,調(diào)節(jié)未致敏T細(xì)胞分化,增強(qiáng)過敏原特異性Th2介導(dǎo)的氣道炎癥[18]。已有研究指出,即使沒有適應(yīng)性免疫細(xì)胞參與,ILC2也可產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子,誘導(dǎo)EOS相關(guān)氣道炎癥[19]。另一方面,研究發(fā)現(xiàn),BALF中CD4+T細(xì)胞活化早于ILC2,提示ILC2的激活可能依賴于T細(xì)胞的作用[20]。
HO-1是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白,具有細(xì)胞保護(hù)和抑炎作用,在細(xì)胞受到hemin、重金屬、炎性因子以及CO刺激時均會產(chǎn)生HO-1。hemin作為HO-1的底物能夠通過誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷和炎癥損害。本研究用hemin干預(yù)HDM組小鼠,發(fā)現(xiàn)HO-1高表達(dá)能顯著抑制哮喘小鼠氣道炎癥,表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤和氣道分泌物均減少、肺臟炎性因子水平降低,表明HO-1能夠緩解過敏性哮喘小鼠氣道炎癥。另外,本研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)后,小鼠肺臟Th2及Th2型細(xì)胞因子水平顯著降低(有P<0.05),相對應(yīng)的Th1及Th1型細(xì)胞因子水平無顯著變化(均P>0.05),Th1/Th2比值升高,表明HO-1能夠調(diào)節(jié)過敏性哮喘小鼠中Th1/Th2平衡,上述結(jié)果與既往HO-1調(diào)節(jié)以EOS浸潤為主的OVA所致過敏性哮喘氣道炎癥研究結(jié)果一致[8]。此外,研究還發(fā)現(xiàn),HDM致敏、激發(fā)的小鼠哮喘模型肺臟組織中ILC2數(shù)量顯著增加(P<0.05)。有研究表明,過敏原刺激后,哮喘患者外周血中ILC2是肺組織中浸潤ILC2的主要來源[21]。研究同時發(fā)現(xiàn),HO-1高表達(dá)后ILC2數(shù)量減少,表明HO-1的高表達(dá)能夠調(diào)節(jié)ILC2數(shù)量,其是否通過影響ILC2的募集以發(fā)揮作用需要進(jìn)一步研究。另外,由于Th2與ILC2的相互作用機(jī)制尚不明確,本研究不能確定HO-1高表達(dá)主要是影響Th2還是ILC2,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
綜上所述,HO-1高表達(dá)能夠抑制HDM所致過敏性氣道炎癥,其可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2比值及ILC2平衡發(fā)揮作用。本研究為進(jìn)一步探究HO-1抑制過敏性氣道炎癥的機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。