區(qū)婷婷，曾楠，杜弢

細(xì)胞內(nèi)的脂肪代謝對(duì)于維持細(xì)胞正常的能量代謝和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著不可忽視的作用，腫瘤細(xì)胞異常增殖所需能量供應(yīng)除了增加葡萄糖攝入消耗供能外，也可通過增加脂肪代謝供能［1］。有研究發(fā)現(xiàn)減少脂肪積累或者減弱脂質(zhì)代謝可影響前列腺細(xì)胞的癌變進(jìn)程［2］，另有研究指出脂肪代謝與腫瘤細(xì)胞耐藥和化療不敏感度有關(guān)［3，4］，這些研究提示靶向脂肪酸合成可能成為腫瘤治療的新策略［5］。

最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)抑制脂肪酸和膽固醇的合成可以有效降低肝癌的發(fā)生［6］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在肝細(xì)胞脂肪變性和肝癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，許多疾病如高脂血癥、炎癥、病毒等可干擾肝細(xì)胞ER的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致肝脂質(zhì)代謝失調(diào)與肝細(xì)胞的炎性壞死、凋亡，促進(jìn)肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）中ACE2/Ang-（1-7）/Mas軸對(duì)維持機(jī)體肝臟脂代謝的穩(wěn)態(tài)非常重要［8，9］。其中Mas受體可緩解ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的ERS，從而減少HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積累［10］。Mas受體相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體D（MAS-related G-protein Coupled Receptor member D，MrgD），又稱為MrgprD或TGR7，與Mas受體具有一定比例的同源性。這兩個(gè)受體對(duì)機(jī)體的血管與心臟等發(fā)揮類似的保護(hù)作用，如舒張血管［11，12］、抗心肌纖維化、抗心室肥大［13，14］等。目前，關(guān)于MrgD對(duì)肝癌細(xì)胞脂肪代謝方面的作用尚不清楚，本研究將初步探討MrgD調(diào)控肝癌細(xì)胞脂肪代謝和ERS的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 構(gòu)建過表達(dá)與干擾MrgD的穩(wěn)定HepG2細(xì)胞株

將pcDNA3-MRGD-EGFP表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒（Addgene）的人源MrgD全長(zhǎng)序列克隆插入CMV-eGFPPGK-Puro表達(dá)載體質(zhì)粒中的eGFP，獲得MrgD表達(dá)載體PGMLV-CMV-H_MRGD-eGFP-PGK-Puro。同時(shí)，設(shè)計(jì)針對(duì)人源MrgD序列干擾的MrgD-shRNA質(zhì)粒，插入PGMLV-SC5載體，構(gòu)建MrgD干擾載體H_MRGD-shRNA1（PGMLV-SC5）。上述質(zhì)粒載體均帶有嘌呤霉素篩選抗性。用構(gòu)建的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒原液，超濾濃縮并測(cè)定病毒滴度。用包裝好的慢病毒以及慢病毒陰性對(duì)照感染HepG2細(xì)胞并用嘌呤霉素篩選，得到目的轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞株，qRT-PCR評(píng)估MrgD表達(dá)變化。

表1 MrgD shRNA oligo序列

1.3 HepG2細(xì)胞脂肪變性模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

1.3.1 在1%BSA低糖DMEM培養(yǎng)基中，以油酸和棕櫚酸按一定比例配置200 μM游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FA），用于誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪變性模型。

1.3.2 選用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，胰酶消化、離心、重懸后，計(jì)數(shù)按5.0×104/孔的密度鋪于24孔板（6孔板則按1.5×105/孔種板），隔夜培養(yǎng)細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，細(xì)胞密度約70%，對(duì)照組每孔加入500 μL（6孔板按2 mL/孔）含1% BSA的低糖DMEM培養(yǎng)基，模型組每孔加入等體積的200 μM FFA高脂培養(yǎng)基（由1% BSA的培養(yǎng)基稀釋），繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.3.3 油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積：油紅O粉末（Sigma），以異丙醇溶解配置0.5%油紅O母液，與ddH2O按3∶2比例混勻后過濾配置工作液，按試劑標(biāo)準(zhǔn)步驟對(duì)4%多聚甲醛固定后的細(xì)胞進(jìn)行染色觀察。

1.4 Western Blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定及調(diào)配后，以10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜。用一抗稀釋液按1∶1000分別稀釋相如下的抗體：并下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（Sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）（CST）、乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC1）（CST）、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip）（CST）、GAPDH（Santa），置4℃緩慢搖床中孵育過夜，用含5%脫脂牛奶的1×TBST按照1∶5000的比例稀釋二抗；ECL法顯影，用Image J軟件各目的條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，參照TaKaRa RR036A逆轉(zhuǎn)錄試盒說明書，將細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR參照TaKaRa RR820A（TB Green Premix Ex TaqⅡ）說明書，使用Roche LightCycler?480Ⅱ進(jìn)行qRT-PCR程序。通過內(nèi)參基因的Ct值計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。以Folds=2-ΔΔCt公式比較目的基因的表達(dá)差異，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）處理組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組。qRT-PCR引物序列：H_MRGPRD-F：GCTGTTCGTGGTGGTCCTG；H_MRGPRD-R：GGAGAGGCGTGACAAGCTG；H_GAPDH-F：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG；H_GAPDH-R：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。

1.6 細(xì)胞免疫熒光

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化重懸后計(jì)數(shù)，按8×104/孔于24孔板中均勻種板，細(xì)胞貼壁后當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約40%匯合度進(jìn)行免疫熒光觀察。MrgD一抗和二抗Cy3均按1∶500比例稀釋；按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行抗體孵育后，在熒光顯微鏡下，選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源，觀察、采集圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s），采用GraphPad Prism 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、作圖，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2的MrgD過表達(dá)與干擾穩(wěn)定株的構(gòu)建與鑒定

對(duì)構(gòu)建的人源MrgD表達(dá)載體PGMLV-CMVH_MRGD-eGFP-PGK-Puro和含有MrgD序列干擾的MrgD-shRNA質(zhì)粒測(cè)序鑒定正確后，構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，通過qRT-PCR與Western Blot分別檢測(cè)細(xì)胞株MrgD的mRNA與蛋白水平。qRT-PCR（圖1A）結(jié)果顯示過表達(dá)細(xì)胞MrgD的mRNA水平較對(duì)照細(xì)胞顯著上升（P＜0.001），4組shRNA干擾組細(xì)胞MrgD的mRNA水平較其對(duì)照組明顯降低（P＜0.001），其中shRNA3最低，后續(xù)試驗(yàn)均選用感染shRNA3序列細(xì)胞株；免疫熒光顯示的MrgD蛋白表達(dá)有同樣的趨勢(shì)（圖1B）。

圖1 過表達(dá)和低表達(dá)MrgD的HepG2穩(wěn)定株的建立與鑒定A：qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞MrgD mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參；B：免疫熒光觀察細(xì)胞MrgD蛋白表達(dá)。Lv-Con：過表達(dá)對(duì)照組；Lv-MrgD：MrgD過表達(dá)組；Sh-Con：干擾對(duì)照組；Sh-MrgD：MrgD干擾組；*P＜0.001。

2.2 體外脂肪變性模型的構(gòu)建

采用含200 μM的由棕櫚酸（palmitic acid，PA）和油酸（oleic acid，OA）混合的FFA脂性培養(yǎng)基刺激HepG2細(xì)胞12 h。設(shè)置4個(gè)分組：對(duì)照組（1%BSA處理）以及OA∶PA比例分別為1∶2、1∶1、2∶1的FFA處理組，之后用MTS測(cè)定各組細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示200 μM的FFA（OA∶PA=2∶1）處理細(xì)胞12 h不影響細(xì)胞活性（圖2A），故選用該方案誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪變性并進(jìn)行油紅O染色。結(jié)果顯示，與1%BSA培養(yǎng)基處理的對(duì)照組對(duì)比，F(xiàn)FA處理的HepG2細(xì)胞內(nèi)的橘紅色脂滴顯著增加（圖2B）。

圖2 FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂滴堆積分別用含1%BSA（模型對(duì)照組）與含200 μM FFA的低糖DMEM培養(yǎng)基（模型組）培養(yǎng)HepG2細(xì)胞12 h A：MTS檢測(cè)200 μM的FFA（OA∶PA=1∶2、1∶1、2∶1）的處理HepG2細(xì)胞12 h的活性。*P＜0.05，**P＜0.01。B：200 μM的FFA（OA∶PA=2∶1）誘導(dǎo)細(xì)胞12 h的油紅O染色。

2.3 MrgD改善FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

為探究MrgD是否對(duì)肝臟脂肪代謝有影響，通過油紅O染色觀察MrgD過表達(dá)對(duì)FFA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積含量的影響，Western blot檢測(cè)脂肪合成相關(guān)蛋白（ACC1）以及ERS標(biāo)記蛋白（BiP、ATF4）水平。結(jié)果顯示，在HepG2脂肪變性模型中，MrgD過表達(dá)明顯抑制了FFA誘導(dǎo)的顯著增加的脂滴蓄積（圖3A）；FFA誘導(dǎo)后，對(duì)照組細(xì)胞脂肪合成標(biāo)記蛋白SREBP2、ACC1和ERS標(biāo)記蛋白BiP水平上調(diào)，而過表達(dá)MrgD下調(diào)了上述蛋白的表達(dá)（圖3B）。

圖3 MrgD對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的影響用200 μM的FFA誘導(dǎo)MrgD過表達(dá)組及其對(duì)照12 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證A：油紅O染色觀察各組脂滴沉積情況；B：Western Blot檢測(cè)過表達(dá)組的脂肪合成相關(guān)蛋白（ACC1、SREBP2）與ERS標(biāo)記蛋白（BiP）水平。

2.4 干擾MrgD促進(jìn)FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

同時(shí)，MrgD干擾HepG2細(xì)胞脂肪變性后，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，MrgD干擾后FFA誘導(dǎo)的脂滴合成顯著增加（圖5A）；相應(yīng)的脂肪合成標(biāo)記蛋白SREBP2、ACC1表達(dá)水平顯著上調(diào)，同時(shí)ERS標(biāo)記蛋白BiP表達(dá)水平增高（圖5B）。

3 討論

脂質(zhì)代謝失調(diào)和炎癥是癌細(xì)胞的常見表型［15］，細(xì)胞內(nèi)脂肪酸作為膜脂、信號(hào)分子和修飾基團(tuán)的生物合成前體為腫瘤生長(zhǎng)提供能量?jī)?chǔ)存［16］。脂質(zhì)合成、攝取和儲(chǔ)存通常在肝癌發(fā)生中上調(diào)，靶向脂質(zhì)代謝可能是一種有前途的癌癥治療方法［17］。本研究發(fā)現(xiàn)在肝臟腫瘤細(xì)胞株HepG2中上調(diào)MrgD表達(dá)可通過抑制脂肪合成、改善ERS途徑顯著改善肝癌細(xì)胞脂肪變性，研究提示MrgD相關(guān)通路可能成為研究肝癌防治策略的新方向。

圖4 干擾MrgD對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的影響A：經(jīng)FFA誘導(dǎo)后各組的油紅O染色；B：Western Blot檢測(cè)FFA誘導(dǎo)后各組的脂肪合成相關(guān)蛋白（ACC1、SREBP2）與ERS標(biāo)記蛋白（BiP）。

FFA常用于誘導(dǎo)建立脂肪變性細(xì)胞模型［18，19］，油酸（OA）和棕櫚酸（PA）是體內(nèi)常見的FFA，可合成甘油三酯并儲(chǔ)存于肝細(xì)胞胞質(zhì)中。體內(nèi)甘油三酯含量過高會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，F(xiàn)FA能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的3條信號(hào)通路［20］。ERS的激活可導(dǎo)致肝脂質(zhì)代謝失調(diào)與肝細(xì)胞的炎性壞死、凋亡，在肝細(xì)胞脂肪變性和肝癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［7］。本研究應(yīng)用200 μM的FFA（OA∶PA=2∶1）誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性，造模后肝細(xì)胞ERS及脂肪合成相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平顯著升高。

RAS對(duì)維持機(jī)體肝臟脂代謝的穩(wěn)態(tài)非常重要，Mas受體是其中關(guān)鍵的一員，Mas受體敲除小鼠表現(xiàn)出肝臟脂質(zhì)蓄積增強(qiáng)和脂肪合成相關(guān)蛋白上調(diào)，而過表達(dá)Mas受體則會(huì)扭轉(zhuǎn)上述變化趨勢(shì)［21］。MrgD受體是與Mas受體有一定比例同源性，與Mas受體發(fā)揮許多相似的生理作用，但其MrgD在肝細(xì)胞脂代謝中的作用尚不清楚。本研究通過構(gòu)建FFA誘導(dǎo)的MrgD受體過表達(dá)與干擾的HepG2細(xì)胞脂肪變性模型，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MrgD明顯降低FFA誘導(dǎo)的胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)含量，并下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）和乙酰輔酶A羧化酶1（ACC1）。SREBP2是參與脂質(zhì)合成的調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。已有研究表明［22，23］，SREBP2表達(dá)受AdipoR1/AMPK/SIRT1信號(hào)通路調(diào)控的，AMPK激活后也可直接作用于SREBP2，使其磷酸化，進(jìn)而下調(diào)SREBP2的靶基因，如參與膽固醇和脂肪酸生物合成等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。ACC1同樣在脂肪酸合成中起主要作用。ACC是一類生物素羧化酶，其催化乙酰輔酶A和碳酸酯的ATP依賴性縮合以形成丙二酰輔酶A，后者是從頭脂肪生成的必需和限速底物，也是肝臟組織細(xì)胞中長(zhǎng)鏈脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶CPT-1（Carnitine palmitoyltransferase 1，肉毒堿-棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1）的變構(gòu)抑制劑［24］。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MrgD可抑制免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（Bip），同時(shí)在低表達(dá)MrgD細(xì)胞中觀察到相反的結(jié)果。BiP是一種高度保守的分子伴侶，它充當(dāng)Ca2+的調(diào)節(jié)劑協(xié)助蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并通過其兩個(gè)結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合域和底物結(jié)合域協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊過程。BiP作為維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑，可激活涉及未折疊蛋白反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄，也是ERS的主要標(biāo)記物［25］。已有的研究表明，F(xiàn)FA作用肝細(xì)胞后，脂肪合成基因SREBP-1c和BiP的mRNA和蛋白水平以及脂肪酸合成酶mRNA顯著增加，參與肝細(xì)胞脂肪變性過程［26］。這些研究結(jié)果提示MrgD可能通過調(diào)控ERS參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞脂肪合成。

綜上，本研究在體外初步揭示了MrgD通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制肝癌細(xì)胞脂肪合成。調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝異常及緩解ERS的機(jī)制，從而阻止或延緩肝臟脂肪變性和肝癌的發(fā)生發(fā)展，有望成為肝癌防治的一個(gè)有效方法，本研究有助于深入研究MrgD通路在肝癌細(xì)胞脂肪變性中的作用和機(jī)制，探討其在肝癌防治中的潛在價(jià)值。