馬秀艷,蔣 磊,宋艷宇,*,孫 麗,宋長春,侯愛新,高晉麗,杜 宇

1 中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,濕地生態(tài)與環(huán)境重點實驗室, 長春 130102 2 美國路易斯安那州立大學,海岸與環(huán)境學院, 美國 LA 70803

土壤微生物能夠調(diào)節(jié)陸地生物地球化學循環(huán),是土壤中重要的物質(zhì)循環(huán)推動者,同時也是生物圈與非生物圈物質(zhì)與能量交換的重要樞紐[1]。它們在土壤有機質(zhì)分解和元素循環(huán)中起著重要作用,土壤微生物通過微生物作用與周圍環(huán)境發(fā)生交換,以此獲得營養(yǎng)物質(zhì)來滿足自身需要[2]。土壤微生物本身也是土壤養(yǎng)分庫,對土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與供應(yīng)起著重要作用[3]。

固氮微生物種類豐富,其體內(nèi)存在具有催化功能的固氮酶,其中nifH 基因編碼固氮酶中的鐵蛋白[4],是所有固氮微生物含有的最保守的功能基因,因此nifH基因被廣泛應(yīng)用于研究固氮微生物群落[5]。反硝化作用是氮循環(huán)的關(guān)鍵步驟之一,反硝化是微生物參與土壤氮循環(huán)的重要過程之一。土壤中反硝化過程主要是由異養(yǎng)反硝化細菌完成[6- 7]。參與反硝化過程的酶主要有硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶,它們的編碼基因分別為nar、nirK/nirS、norB和nosZ,其中亞硝酸還原酶中的nirK和nirS分別為可溶性含銅酶和細胞色素酶的編碼基因,是反硝化過程中研究最多也是最重要的功能基因[8]。

土壤微生物對溫度變化敏感,其對溫度的響應(yīng)直接影響生態(tài)系統(tǒng)過程[9]。溫度是控制生物反應(yīng)的基礎(chǔ),不同生物體溫度敏感性的變化可能會影響微生物對氣候變化的響應(yīng)[10]。溫度升高可以促進土壤微生物的呼吸作用,微生物消耗土壤中的氧氣使土壤呈厭氧環(huán)境進而影響反硝化作用[11]。有研究表明,溫度變化對微生物量、微生物群落及其組成有直接影響[12- 13]。對草原生態(tài)系統(tǒng)土壤反硝化速率及其相關(guān)微生物變化的研究發(fā)現(xiàn)增溫顯著增加了高寒草原土壤中的反硝化細菌的數(shù)量及土壤反硝化速率[14]。土壤水分含量是土壤氮素轉(zhuǎn)化過程中至關(guān)重要的影響因素。土壤水分含量與其他土壤理化性質(zhì)共同作用可顯著改變土壤的孔隙度及孔隙分布,從而影響氧氣在土壤中的流通,進而影響微生物的活性[15- 16]。短期的溫度升高和水分增加可顯著提高土壤nifH基因豐度[17],不同水分條件下土壤中nirK和nirS基因豐度隨著水分的增加而增加[18],nirK基因?qū)ν寥浪肿兓捻憫?yīng)更靈敏[19]。因此,研究溫度和水分變化對氮循環(huán)功能基因豐度的影響對于明確未來氣候變化影響下氮循環(huán)過程具有重要意義。

大興安嶺是我國唯一的地帶性凍土分布區(qū),也是世界上主要的泥炭分布區(qū)之一[20],在全球變暖的影響下,中國東北的永久凍土區(qū)在過去的幾十年里經(jīng)歷了顯著退化[21],永凍層不再是永久凍土而是轉(zhuǎn)變成季節(jié)融化層,溫度升高使得凍土融化,導致活動層呈淹水狀態(tài)。前期研究表明溫度升高會促進凍土泥炭地N2O的釋放,但其微生物機制尚不明確。本研究以大興安嶺凍土泥炭地為研究對象,通過室內(nèi)模擬培養(yǎng)試驗,采用實時定量PCR技術(shù),研究土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物對溫度和水分變化的響應(yīng)。本研究旨在為全球變暖影響下永久凍土區(qū)泥炭地氮循環(huán)變化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究站點位于大興安嶺連續(xù)多年凍土區(qū)(東經(jīng)122°86′,北緯52°94′),屬于寒溫帶季風性氣候,全年無霜85—110 d,11月—次年4月冬季積雪,凍結(jié)期大概為7個月[22]。年平均溫度為-3.9℃。年平均降雨量為350—550 mm,降水主要集中在7—8月[23]。該地區(qū)主要植物類型包括常綠灌木、落葉灌木、草本植物,其中常綠灌木的主要代表為細葉杜香(Ledumpalustre)和甸杜(Chamaedaphnecalyculata),落葉灌木的主要代表為篤斯越橘(Vacciniumuliginosum),草本植物的主要代表為羊胡子草(Eriophorumvaginatum),而地被植物的主要代表為泥炭蘚(Sphagnumpalustre)[24]。該地區(qū)的土壤類型為泥炭土。

1.2 樣品采集與培養(yǎng)

2018年8月,選取大興安嶺凍土區(qū)典型泥炭地,隨機選取樣地,采樣地之間的距離至少為10 m,每處用土鉆采集8個土壤深度(0—20、20—40、40—60、60—80、80—100、100—120、120—140 cm和140—150 cm),其中0—60 cm深度為活動層,60—80 cm深度為過渡層,80 cm以下深度為永凍層。人工挑出植物根系、新鮮凋落物和石塊等雜物,低溫保存運回實驗室。取一部分新鮮土壤樣品測定土壤pH值和含水量,一部分土壤樣品置于陰涼處風干后研磨,過0.25 mm篩,測定土壤樣品的初始全氮含量。用于培養(yǎng)的土壤樣品冷凍保存。

1.3 實驗方法

1.3.1土壤微生物功能基因豐度及溫度敏感性

土壤微生物DNA提取[25]:按照土壤Fast DNA SPIN快速提取試劑盒(MPbio,USA)說明書準確稱取0.3 g土壤樣品到Lysing Matrix E管中,加入978 μL Sodium Phosphate Buffer和122 μL MT Buffer,采用FastPrep?處理后離心14000 g×10 min,將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的2 mL離心管中,加入250 μL PPS離心14000 g×5 min,將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的5 mL離心管并加入1 mL Binding Matrix Suspension,用手顛倒2 min后靜置3 min,去除500 μL上清后轉(zhuǎn)移混合液到SPINTM Filter后離心14000 g×1 min,加入500 μL SEWS-M到SPINTM Filter中離心14000 g×1 min,將SPINTM Filter下面catch tube中的液體倒掉,再離心14000 g×2 min,將SPINTM Filter放到一個新的Catch Tube中室溫下風干5 min,加入100 μL DES離心14000 g×1 min使DNA轉(zhuǎn)移到Catch Tube中,-80℃冰箱保存。

提取后用0.5%低熔點瓊脂糖凝膠純化DNA提取物,用苯酚-氯仿-丁醇萃取。為了獲得更具代表性的DNA樣本對每個樣本進行3次重復處理。通過熒光定量PCR儀(7500,ABI,美國)定量測定細菌的nifH、nirK和nirS基因豐度[26]。擴增所用引物及擴增程序見表1,實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL∶12.5 μL的1×SYBR緩沖液(TaKaRa,Japan),0.4 μL引物(10 μM),0.5 μL ROXΙΙ(TaKaRa),0.875 μL 3%BSA,0.625 μL 二甲亞砜(DMSO),10 ng DNA模板。

土壤微生物溫度敏感性[30]:

式中,Abundance1代表較低溫度T1測定的微生物豐度,Abundance2代表較高溫度T2測定的微生物豐度。

1.3.2土壤理化性質(zhì)測定

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運用SPSS 17.0軟件,采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)和顯著性差異(Tukey)以及Pearson相關(guān)分析等方法對不同土壤深度下土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物功能基因豐度以及無機氮含量進行差異顯著性分析,檢驗溫度和水分變化對土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物數(shù)量的影響,所有數(shù)據(jù)在進行方差分析前均進行正態(tài)性檢驗(s-w 檢驗),且符合正態(tài)分布,并運用Excel 2007進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 土壤初始理化性質(zhì)

不同深度土壤初始理化性質(zhì)如表2所示。土壤含水量范圍為57.49%—79.03%,土壤pH值范圍為4.50—4.76,土壤總氮含量變化范圍為4.48—11.53 mg/g。土壤含水量和總氮的最大值均出現(xiàn)在過渡層(60—80 cm),最小值均出現(xiàn)在凍土層(140—150 cm)。該地區(qū)土壤偏酸性,并且土壤酸性隨土層深度的增加而減弱。

2.2 溫度升高對泥炭地土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物的影響

2.2.1溫度升高對土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物功能基因豐度的影響及其溫度敏感性

培養(yǎng)55 d后,土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物功能基因豐度變化如圖1所示:0—20、20—40、40—60、60—80、80—100、100—120、120—140、140—150 cm土層nifH、nirK、nirS功能基因豐度分別為1.11×1010—1.08×1011、2.60×106—6.87×108、9.07×107—2.18×109基因拷貝數(shù)/g干土。0—20、20—40、60—80、80—100 cm土層中nifH基因豐度隨著溫度的升高顯著增加,140—150 cm土層中nifH的基因豐度隨著溫度的升高顯著降低,溫度升高顯著提高了0—20、20—40、40—60、60—80、80—100和140—150 cm土層nirK基因豐度。0—20、20—40、60—80 cm土層中nirS基因豐度隨著溫度的升高而顯著增加,但是100—120、120—140、140—150 cm土層中nirS基因豐度隨著溫度的升高而顯著減少(表3)。雙因素方差分析結(jié)果表明,溫度和土壤深度對nifH、nirK和nirS基因有顯著影響,并且存在交互作用(表4)。nifH、nirK、nirS功能基因豐度的溫度敏感性(Q10)平均值分別為1.51、2.53、1.22。nifH、nirK、nirS功能基因豐度的溫度敏感性分別在60—80、40—60、60—80 cm土層最高,在20—40、100—120、120—140 cm土層最低(圖1)。

圖1 溫度升高對不同深度土壤氮循環(huán)相關(guān)功能基因豐度的影響及其溫度敏感性Fig.1 Effect of temperature increasing on soil nitrogen cycle related functional gene abundance and its temperature sensitivity at different soil depths

表3 溫度對不同深度土壤氮循環(huán)相關(guān)功能基因豐度和有效氮含量影響的方差分析

2.2.2溫度升高對土壤有效氮含量的影響及其與氮循環(huán)相關(guān)微生物的相關(guān)性

表4 溫度和土壤深度及其交互作用對氮循環(huán)相關(guān)功能基因豐度和有效氮含量影響的雙因素方差分析

圖2 溫度升高對不同深度土壤含量的影響Fig.2 The effect of temperature increasing on contents at different soil depths

表5 氮循環(huán)相關(guān)功能基因與土壤氮含量相關(guān)分析

2.3 溫度和水分變化對泥炭地表層土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物的影響

2.3.1泥炭地表層土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物基因豐度變化

不同溫度和水分條件下表層土壤固氮和反硝化細菌數(shù)量變化如圖3所示:在5℃和15℃條件下,淹水處理使20—40 cm土壤nifH基因豐度增加了104.19%和18.28%。0—20 cm層nirS基因豐度分別降低了37.21%和74.86%,nirK基因豐度分別降低了54.78%和57.06%。20—40 cm土壤nirS基因豐度分別降低了10.88%和67.02%,nirK基因豐度分別降低了50%和29.33%。在淹水條件下,溫度升高使0—20和20—40 cm土壤中的nifH基因豐度分別增加了18.68%和11.47%,nirS基因豐度分別降低了32.26%和25.94%,而nirK基因豐度分別增加了212.17%和135.95%。水分及溫度和水分的交互作用對0—20、20—40 cm層nirS和nirK及20—40 cm的nifH基因豐度有顯著影響(表6)。

圖3 溫度和水分變化對表層土壤氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因豐度的影響Fig.3 Effects of temperature and moisture on nitrogen cycle related functional gene abundance at topsoil

表6 溫度和水分對表層土壤氮循環(huán)功能基因豐度及氮含量影響的雙因素方差分析

2.3.2泥炭地表層土壤氮含量變化及其與氮循環(huán)相關(guān)微生物豐度的關(guān)系

圖4 溫度和水分對表層土壤氮含量的影響Fig.4 Effects of temperature and moisture on nitrogen contents at topsoil

表7 表層土壤氮循環(huán)相關(guān)功能基因豐度與土壤氮含量的相關(guān)分析

3 討論

3.1 泥炭地不同深度土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物及有效氮含量對溫度變化的響應(yīng)

3.1.1泥炭地土壤氮循環(huán)微生物對溫度升高的響應(yīng)

3.1.2泥炭地土壤有效氮含量對溫度升高的響應(yīng)

3.2 溫度和水分變化對泥炭地表層土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物及有效氮含量的影響

3.2.1泥炭地表層土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物對溫度和水分變化的響應(yīng)

溫度和水分能夠影響土壤中細菌群落的多樣性[42],短期和長期的變化都可能改變土壤細菌的結(jié)構(gòu)和組成[43]。我們發(fā)現(xiàn)在增溫條件下,淹水處理使表層土壤nirS和nirK基因豐度降低,可能是因為淹水造成了過度還原的條件,使反硝化底物濃度降低,反硝化微生物活性受到抑制,此研究結(jié)果與劉若萱在水田土壤中的研究結(jié)果一致,即淹水處理使反硝化微生物nirS和nirK基因豐度降低[18]。溫度和水分交互作用對表層土壤nirS和nirK基因豐度有顯著影響,說明溫度和水分對土壤氮循環(huán)nifH、nirK、nirS功能基因豐度的影響不是單方面的,而是二者交互作用的結(jié)果。溫度和水分的變化會影響土壤微生物活性及其好氧厭氧狀態(tài),當土壤含水量發(fā)生變化時,會引起土壤孔隙度大小發(fā)生改變,微生物的活性及其利用有機物的能力受到影響。

3.2.2泥炭地表層土壤有效氮含量對溫度和水分變化的響應(yīng)

4 結(jié)論