曾樹宏，陸為民

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害著人類健康。隨著社會(huì)發(fā)展、醫(yī)學(xué)進(jìn)步以及早癌篩查的推廣，胃癌的發(fā)病率有所下降，但其總體發(fā)病率仍高居全球第三位，病死率居第四位［1-2］。目前胃癌的主要治療手段仍以早期根治性手術(shù)、晚期全身化療為主。有氧糖酵解，即Warburg 效應(yīng)，是腫瘤細(xì)胞的特征性代謝方式，與三羧酸循環(huán)相比，糖酵解步驟少，產(chǎn)生ATP 效率低速率高，可以迅速滿足腫瘤細(xì)胞瘋狂增殖的能量需求；通過將大部分碳流由供能轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣缮锎蠓肿樱梢跃S持腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖生長(zhǎng)所需的物質(zhì)儲(chǔ)備，這使腫瘤細(xì)胞攝取葡萄糖和谷氨酰胺的速率是正常細(xì)胞的200 倍以上［3-5］。

木犀草素（Luteolin）是一種天然黃酮類化合物，木犀草素及其衍生物抗腫瘤研究主要聚焦于誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞，周期、抗血管生成等［6］。近期PALOMBO R等研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素衍生物L(fēng)UT-7-G 對(duì)HKⅡ有特異性抑制作用，導(dǎo)致有氧糖酵解作用下調(diào)，顯示木犀草素衍生物在腫瘤能量代謝方面具有治療潛力［7］。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)研究木犀草素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，通過有氧糖酵解途徑探討其可能作用機(jī)制，為木犀草素應(yīng)用于胃癌治療或協(xié)同增效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

胃癌AGS 細(xì)胞系為江蘇省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)。來源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫（上海），為中分化原位胃腺癌細(xì)胞。

1.2 木犀草素

木犀草素（純度＞99%）購(gòu)自南京道斯夫生物，采用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑，配制為160 mol/L溶液。

1.3 試劑

乳酸（LD）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；葡萄糖測(cè)定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；CCK-8（APExBio）；二甲基亞砜（APExBio）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）；己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）；丙酮酸激酶同工酶M2（PKM2）；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）；半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）；半胱氨酸蛋白酶3 剪切體（Cleaved Caspase-3）；鼠、兔二抗（武漢塞維爾生物科技）。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱（HERA cell 1501 型）；生物安全柜（1300A2 型）；倒置相差顯微鏡（CKX51 型）；多功能酶標(biāo)儀（ELx800 型）；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（北京六一）；凝膠成像儀（CHEMIDOC XRS+）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌AGS 細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2及完全飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中逐漸長(zhǎng)至致密單層時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代。

2.2 IC50測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整濃度為（2～3）×104/mL，輕輕混勻，96 孔板每孔加入180 μL，待測(cè)細(xì)胞密度約為3 600～5 400/孔（邊緣孔用無菌PBS 填充）；將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)96 孔板放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（通常過夜）。將20 μL不同濃度木犀草素培養(yǎng)基溶液加入孔內(nèi)（稀釋倍率以DMSO含量1/1 000 以下為標(biāo)準(zhǔn)）。5%CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，觀察鏡下藥物作用效果。棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK8 工作液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h。在酶標(biāo)儀OD 490 nm 處檢測(cè)各孔的吸光值，收集數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析，繪制量效曲線。

2.3 葡萄糖濃度測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)基，1 000 rpm 離心5 min后，取上清待測(cè)；加入測(cè)定試劑，在酶標(biāo)儀OD 570 nm處檢測(cè)各孔的吸光值，用空白管調(diào)零，測(cè)定各管的吸光光度值（標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度為5.55 mmol/L）；葡萄糖消耗量及消耗率按照公式計(jì)算。

2.4 乳酸濃度測(cè)定

配置酶工作液：試劑一（酶稀釋液）和試劑二（酶儲(chǔ)備液）按100∶1 體積比混合，現(xiàn)配現(xiàn)用（2～8 ℃，24 h 內(nèi)有效）。配置顯色劑：試劑四粉末1 支倒入1 瓶試劑三液體中，待粉末全部溶解，移入離心管中充分顛倒混勻，再重新移入瓶中，反復(fù)2～3 次，使二者充分混合（2～8 ℃避光保存，2 周有效），按照下面的次序依次配入。

①空白管：雙蒸水20 μL + 酶工作液1 mL + 顯色劑200 μL；②標(biāo)準(zhǔn)管：不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品20 μL（依次稀釋為1、2、3、4、5、6 mmol/L）+酶工作液1 mL+顯色劑200 μL；③測(cè)定管：待測(cè)樣品20 μL + 酶工作液1 mL+顯色劑200 μL。

混勻，37 ℃水浴精準(zhǔn)反應(yīng)10 min 后，每管加入終止液2 mL。在酶標(biāo)儀OD 570 nm 處檢測(cè)各孔的吸光值，用空白管調(diào)零，測(cè)定各管的吸光光度值。計(jì)算各管乳酸濃度。

2.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌AGS 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105/mL，接種于6 孔板中，組別設(shè)置及加藥情況同上，培養(yǎng)48 h，棄舊培養(yǎng)基，PBS 清洗，每皿加RIPA 裂解液100 μL，充分混勻裂解，吸取總蛋白勻漿，超聲裂解后，4 ℃，12 000 rpm 離心20 min，收集上清，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度，計(jì)算上樣量。將提取的蛋白樣品與5 × SDS 蛋白上樣緩沖液按4∶1 體積比混勻，99 ℃煮蛋白10 min，按計(jì)算的上樣量，加入合適濃度的SDS-PAGE 膠中進(jìn)行電泳分離。電泳完畢后切膠轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后，5%奶粉封閉1 h，分別加 入 相 應(yīng) 一 抗（β-actin、HK Ⅱ、PKM2、GLUT1、Caspase-3、Cleaved Caspase-3），4 ℃孵 育 過 夜，TBST 洗膜4 次，每次10 min，加入相應(yīng)種屬來源的二抗中，常溫緩慢搖床60 min。二抗取出后，TBST 洗膜4 次，每次10 min，ECL 特超敏液顯影曝光檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Western Blot 采用Image Lab 軟件分析灰度值，數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件分析；數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，滿足正態(tài)分布和方差齊性的多組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 法；方差不齊者采用Dunnetts'T3 檢驗(yàn)。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 木犀草素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞系的體外抑制作用

觀察木犀草素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞體外抑制作用并進(jìn)行檢測(cè)分析，計(jì)算木犀草素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞的IC50值為55.64 μmol/L，因此確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)鞠菟氐?、中、高濃度分別為20、40、80 μmol/L。結(jié)果表明，木犀草素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞的增殖具有明顯抑制效果。見表1和圖1。

表1 木犀草素干預(yù)后各濃度胃癌AGS細(xì)胞存活率（±s）

表1 木犀草素干預(yù)后各濃度胃癌AGS細(xì)胞存活率（±s）

濃度（μmol/L）1.25 2.5 5 10 20 40 80 160細(xì)胞存活率（%）102.47±2.05 103.47±1.49 101.40±1.59 98.10±0.87 84.64±1.04 67.19±4.03 31.81±1.72 12.90±0.50

圖1 木犀草素干預(yù)后胃癌AGS細(xì)胞存活率

3.2 木犀草素誘導(dǎo)胃癌AGS細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在AGS 細(xì)胞系中，20、40 μmol/L 與空白對(duì)照組相比，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，劑量升至80 μmol/L 時(shí)，凋亡率為（49.74±3.09）%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2和圖2。

圖2 木犀草素干預(yù)后各組胃癌AGS細(xì)胞的流式細(xì)胞雙參數(shù)散點(diǎn)圖

表2 木犀草素干預(yù)后各組胃癌AGS細(xì)胞凋亡率（±s）

表2 木犀草素干預(yù)后各組胃癌AGS細(xì)胞凋亡率（±s）

注：與0 μmol/L比較，****P ＜0.000 1。

濃度（μmol/L）0 20 40 80凋亡率（%）6.53±1.30 10.39±0.89 11.38±1.06 49.74±3.09****

3.3 木犀草素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞有氧糖酵解水平的影響

通過對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸濃度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算葡萄糖消耗率及乳酸產(chǎn)量，對(duì)木犀草素對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞的有氧糖酵解水平進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，隨著木犀草素濃度增大，葡萄糖消耗率不斷減少，乳酸產(chǎn)量也不斷減少（P＜0.01）。見表3。

表3 木犀草素干預(yù)后各組細(xì)胞葡萄糖消耗率及乳酸產(chǎn)量（%）

3.4 木犀草素對(duì)各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

為進(jìn)一步揭示木犀草素對(duì)胃癌細(xì)胞的促凋亡影響，本研究對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Cleaved Caspase-3進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，隨著木犀草素濃度增大，Caspase-3 表達(dá)越來越低，Cleaved Caspase-3 表達(dá)越來越高，其促凋亡作用越明顯（P＜0.05）。隨著木犀草素濃度升高，HKⅡ、PKM2、GLUT1 表達(dá)越來越低，呈現(xiàn)濃度依賴性（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.000 1）。結(jié)果見圖3和表4。

表4 木犀草素干預(yù)后各組細(xì)胞相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）

表4 木犀草素干預(yù)后各組細(xì)胞相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）

注：與0 μmol/L比較，**P ＜0.01，***P ＜0.001，****P ＜0.000 1。

濃度（μmol/L）0 20 40 80 Caspase-3/Cleaved Caspase-3 1.00±0.01 0.73±0.08***0.43±0.04****0.06±0.02****HKⅡ/β-actin 1.00±0.02 0.96±0.03 0.93±0.02 0.78±0.05**PKM2/β-actin 1.00±0.04 0.93±0.05 0.65±0.09***0.34±0.05****GLUT1/β-actin 1.00±0.03 0.82±0.06***0.41±0.07****0.21±0.04****

圖3 木犀草素干預(yù)后各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)量

4 討論

細(xì)胞代謝是一切生命體生存的基礎(chǔ)，細(xì)胞從環(huán)境獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過一系列的反應(yīng)，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為支持細(xì)胞各種功能的代謝產(chǎn)物。在正常氧條件下，正常細(xì)胞主要通過線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）的三羧酸循環(huán)（TCA cycle）產(chǎn)生ATP；而腫瘤細(xì)胞即使氧氣充足的情況下，也依賴糖酵解產(chǎn)生ATP來提供能量，大部分的碳鏈用于合成生物大分子，以維持腫瘤細(xì)胞高速增殖速率［8］。

腫瘤細(xì)胞特征性的有氧糖酵解現(xiàn)象，即為“Warburg現(xiàn)象”，由Otto Warburg首次提出［9］。動(dòng)物細(xì)胞在正常情況下，對(duì)血液中葡萄糖的攝取受到嚴(yán)格的控制。各類生長(zhǎng)因子，比如胰島素（Insulin）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF），是指導(dǎo)細(xì)胞攝取葡萄糖的主要信號(hào)；與受生長(zhǎng)因子調(diào)控的增殖的正常細(xì)胞不同的是，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞為了補(bǔ)償糖酵解這種低效的產(chǎn)能方式，通過基因的突變激活自主攝取葡萄糖的能力，從而使獲得的葡萄糖比它們自身氧化代謝所需的葡萄糖多得多，因此腫瘤是一種消耗性疾?。?0-12］。本研究中，實(shí)驗(yàn)證實(shí)木犀草素可誘導(dǎo)胃癌AGS 細(xì)胞凋亡，其凋亡機(jī)制可能與木犀草素下調(diào)有氧糖酵解途徑有關(guān)。