李佳洋，沈沐瑤，孫菁，王馨詣，郭海英*，徐道明，朱媛媛

（1. 南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023；2. 鹽城第一人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224006；3. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；4. 南通第六人民醫(yī)院，江蘇 南通 226001）

骨質疏松（osteoporosis，OP）是一種常見的全身性骨病，其表現(xiàn)為骨量下降、骨微結構破壞，進而導致骨脆性增加，易發(fā)生骨折［1］，絕經后骨質疏松（postmenopausal osteoporosis，PMOP）主要病因為雌激素的缺乏［2］，本病嚴重影響患者生活質量。由于西藥治療骨質疏松存在一定不良反應，開展中醫(yī)藥治療骨質疏松的研究具有一定意義，目前對OP的中醫(yī)療法多以滋補肝腎等治法為主，本課題組結合“絡病學說思想”提出“正虛絡瘀”的骨質疏松病機關鍵，并確立了“培本補元、通絡固疏”的治則。培本固疏方在臨床中治療骨質疏松療效較佳。本研究通過去卵巢法建立絕經后骨質疏松模型，觀察培本固疏方對其骨生物力學指標、血清炎性因子、JNK/p38通路的影響，以探索培本固疏方治療PMOP的機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康6 月齡未孕SPF 級雌性SD 大鼠36 只，體質量（290 ± 20）g，購于上海西普爾-必凱公司，許可證：SCXK（滬）2018-0006。本實驗大鼠飼養(yǎng)在南京中醫(yī)藥大學清潔級動物實驗中心，經過南京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會監(jiān)督并批準，倫理號：201905A002。

1.2 藥物與試劑

以人的6.3倍用量計算大鼠用藥等效劑量，制備藥物。于南京中醫(yī)藥大學百草堂購入人參、龜甲、鹿角、仙桃草，按比例配伍煎煮濃縮制成相應生藥濃度的制劑，低、中、高劑量組分別為1.060 5、2.121、4.242 g/mL；阿侖膦酸鈉（阿拉?。┡c相應量生理鹽水配制成相應濃度的溶液（0.21 mg/mL）；青霉素G鈉鹽（索萊寶）；水合氯醛（阿拉?。?；大鼠TNF-α、大鼠IL-1β 試劑盒（翼飛雪）；JNK、p38抗體（abcam）。

1.3 研究方法

1.3.1 模型建立

用去卵巢法獲得PMOP 大鼠模型。將SD 大鼠隨機分為兩組假手術組（Sham，n= 6）與手術組（OVX，n=30）。過程于無菌環(huán)境操作，麻醉后固定大鼠使其呈俯臥位，OVX 組在雙側背部做切口，翻出卵巢并切除，分層縫合。Sham 組同樣在雙側背部切口，但不切除卵巢，而是僅切除卵巢旁少量脂肪。手術后給予后肢肌內注射青霉素8萬U/只，密切觀察7 d。

1.3.2 分組及干預

將OVX 組大鼠隨機分為5 組，每組6 只，即模型組（Model）、培本固疏方低劑量組（Low）、培本固疏方中劑量組（Medium）、培本固疏方高劑量組（High）和阿侖膦酸鈉組（Alen）。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，每2 周進行稱重。手術后第5 周開始對大鼠分組干預，各組均連續(xù)灌胃8 周。假手術組與模型組均給予生理鹽水1 mL/200 g；培本固疏方低、中、高劑量組分別給予培本固疏方低、中、高劑量制劑1 mL/（200 g·d）（中劑量組相當于人類臨床用量100 g 生藥/d）；阿侖膦酸鈉組給予阿侖膦酸鈉 溶 液1 mL/（200 g·d）（相 當 于 人 類 臨 床 用 量10 mg/d）。

1.3.3 標本采集及測定

大鼠末次給藥結束，禁食24 h 后稱重、取材，麻醉方法同造模，腹主動脈抽血處死，收集標本。MEIX-90 雙能X 線骨密度儀檢測L5腰椎密度；三點彎曲試驗儀檢測左側股骨屈服載荷、斷裂載荷、剛度；HE切片染色法觀察右側股骨微結構；ELISA 法檢測血清TNF-α、IL-1β；Western Blot 法檢測右側股骨JNK、p38。

1.4 統(tǒng)計學處理

本實驗結果均為定量資料，采用均數±標準差（±s）表示，用SPSS 22.0進行統(tǒng)計。組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，組間多重比較采用LSD 法，若方差不齊，組間多重比較采用tamhane 法，P≤0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨密度

與假手術組相比，模型組L5腰椎骨密度顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，低劑量組骨密度上升，但差異無統(tǒng)計學意義，培本固疏方中、高劑量組與阿侖膦酸鈉組骨密度均顯著升高（P＜0.01），三者間差異無統(tǒng)計學意義。見表1和圖1。

表1 各組去卵巢大鼠L5腰椎骨密度的影響比較（±s）

表1 各組去卵巢大鼠L5腰椎骨密度的影響比較（±s）

注：與Sham比較，#P ＜0.01；與Model比較，*P ＜0.01。

組別Sham Model Low Medium High Alen n 6 6 6 6 6 6 BMD（g/cm2）0.270±0.028 0.205±0.018#0.207±0.013 0.253±0.028*0.255±0.023*0.267±0.052*

圖1 各組去卵巢大鼠L5腰椎骨密度的影響比較

2.2 骨生物力學

與假手術組相比，模型組屈服載荷、斷裂載荷、剛度均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，低、中、高劑量組、阿侖膦酸鈉組的屈服載荷均顯著上升（P＜0.01）；低、中劑量組斷裂載荷上升但無統(tǒng)計學意義，高劑量組、阿侖膦酸鈉組斷裂載荷顯著上升（P＜0.01，P＜0.001）；低、高劑量組剛度上升但差異無統(tǒng)計學意義，中劑量組、阿侖膦酸鈉組斷裂載荷均上升（P＜0.05）。見表2和圖2。

首先，從表中可以看到在《中國日報》和《紐約時報》中出現(xiàn)最多的是物質過程、關系過程和言語過程。這三個過程主要是一種客觀的描述，這也間接反映了新聞報道的客觀性與真實性。

圖2 各組去卵巢大鼠股骨生物力學的影響比較

表2 各組去卵巢大鼠股骨生物力學的影響比較（±s，n=6）

表2 各組去卵巢大鼠股骨生物力學的影響比較（±s，n=6）

注：與Sham 比較，#P ＜0.01；與Model 比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

組別Sham Model Low Medium High Alen屈服載荷（N）97.500±4.970 56.833±7.305#69.833±2.639 75.167±1.941**82.167±3.125**90.000±1.673**斷裂載荷（N）123.000±5.933 94.167±9.827#99.167±9.827 103.667±7.062 111.000±14.199**116.667±7.501***剛度0.341±0.043 0.219±0.063#0.257±0.051 0.278±0.025*0.273±0.066 0.295±0.033*

2.3 骨組織形態(tài)學

假手術組骨組織結構完整，大量成熟骨組織，骨小梁（TB）粗細均勻，結構完整，排列致密有序；模型組骨小梁可見面積減少，分布錯亂且有斷裂、暴露骨髓腔（BM）現(xiàn)象；各個干預組骨小梁逐漸完整，且培本固疏方各組療效與濃度相關，高劑量優(yōu)于中、低劑量；阿侖膦酸鈉組骨組織結構完整，骨細胞排列較整齊，骨小梁致密，形態(tài)結構改善，連續(xù)性好。見圖3。

圖3 各組去卵巢大鼠骨微結構的影響比較（HE，×200）

2.4 血清TNF-α、IL-1β

與假手術組相比，模型組血清TNF-α、IL-1β 含量顯著升高（P＜0.01），與模型組相比，低劑量組含量降低但差異無統(tǒng)計學意義，其他各藥物組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 含量顯著降低（P＜0.01），其中培本固疏方中劑量組、高劑量組與西藥組之間差異無統(tǒng)計學意義。見表3和圖4。

圖4 各組去卵巢大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響比較

表3 各組去卵巢大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響比較（±s，n=6）

表3 各組去卵巢大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響比較（±s，n=6）

注：與Sham比較，#P ＜0.01；與Model比較，*P ＜0.01。

組別Sham Model Low Medium High Alen TNF-α（ng/L）23.870±4.516 145.302±5.169#98.015±4.207 75.520±7.668*38.103±6.173*28.920±4.585*IL-1β（ng/L）6.388±0.901 35.501±3.258#28.150±2.392 19.125±1.583*9.750±0.972*9.139±0.975*

2.5 骨組織JNK、p38

與假手術組相比，模型組右側股骨組織中JNK、p38 蛋白表達量均升高（P＜0.05），與模型組相比，低劑量組骨組織JNK 含量降低但無統(tǒng)計學意義，中、高劑量組、阿侖膦酸鈉組骨組織JNK 含量均有所下調（P＜0.05），低、中劑量組骨組織p38 含量下降但無統(tǒng)計學意義，高劑量組、阿侖膦酸鈉組骨組織p38 含量下降（P＜0.05）。見表4和圖5。

圖5 各組去卵巢大鼠骨組織JNK、p38的影響比較

表4 各組去卵巢大鼠骨組織JNK、p38的影響比較（±s，n=6）

表4 各組去卵巢大鼠骨組織JNK、p38的影響比較（±s，n=6）

注：與Sham比較，*P ＜0.05；與Model比較，#P ＜0.05。

組別Sham Model Low Medium High Alen JNK 0.250±0.095 1.057±0.190*1.000±0.400 0.803±0.199#0.687±0.129#0.457±0.101#p38 0.180±0.104 1.033±0.351*0.640±0.030 0.622±0.458 0.503±0.116#0.287±0.130#

3 討論

PMOP與雌激素缺乏的關系較緊密［2］，炎性反應是骨質疏松病理過程的重要機制。中醫(yī)藥療法由于療效較佳與不良反應少等優(yōu)勢，日漸被患者群體所接受［3］。本病主要以腎脾虧虛為本，兼以肝郁、痰凝、血虛等［4］?！蹲x醫(yī)隨筆》［5］中論述：“經絡之中，必有推蕩不盡之瘀血……元氣終不能復”，說明久虛當兼見血瘀，進而導致元氣虧虛。筆者針對老年人的生理特點，提出PMOP“正虛絡瘀”的中醫(yī)病機，自擬固本培元、祛瘀固疏的培本固疏方治療。培本固疏方組方為人參、鹿角、龜甲、仙桃草，臨床療效較好，但其治療OP的機制尚未發(fā)掘。人參具有抗炎、抗氧化作用，可抑制破骨細胞增殖，抑制骨吸收［6-7］，在骨質疏松治療中，人參常組成復方應用。龜甲與鹿角是較常用的補腎中藥，林嘉輝等［8］發(fā)現(xiàn)龜鹿聯(lián)合用藥，可下調豚鼠軟骨細胞的JNK、p38 水平，使其凋亡得到抑制。目前對于仙桃草應用于骨質疏松的研究較少，但其有效成分中槲皮素、木犀草素等已被證實具有抗骨質疏松能力，高壓氧聯(lián)合仙桃草可促進鈣沉積，促進成骨細胞的分化［9］。因此筆者推測，培本固疏方治療骨質疏松，是通過調節(jié)炎性因子，調控JNK/p38通路進行的。

c-jun 氨基活化激酶通路（JNK）、p38 絲裂原蛋白活化激酶通路（p38）是MAPK 通路的兩大組成部分，與OP 進程相關，可被IL-1、TNF-α 激活，產生級聯(lián)反應，JNK（MEKK1/TAK1-MEK47-p-JNK-c-Jun，

CaMK，Semaphorin-3D……），p38（TAK1-MEK3/6-p-p38-NFATc1，MITF，TRAP，CTSK，p65，RANK，STAT1，MIG，MK2），進而誘導破骨前體細胞分化，導致骨量下降［10］。

骨生物力學性能是評價骨骼質量的有力指標［22］。三點彎曲實驗中，骨骼受載荷外力作用而產生位移，彈性階段中，骨組織位移隨載荷呈線性成比例增加，撤銷載荷后骨組織可恢復原狀態(tài)，屈服載荷指彈性階段所能承受的最大載荷。而塑性階段骨組織已產生結構上的損壞而永久性的變形，當載荷達到極限程度，骨組織發(fā)生斷裂而產生骨折，斷裂載荷指骨斷裂前所能承受的最大載荷。剛度是反映骨組織抵抗變形的能力，用彈性階段的“載荷-位移曲線”的斜率來表示，當斜率越大，骨組織受力產生的位移越小，說明骨強度越大。

目前，PMOP 的國內外研究中，去卵巢大鼠為學術界公認且較多使用的造模方式，而動物模型的造模干預持續(xù)時長并無統(tǒng)一標準，多使用3～6 月齡雌性未孕大鼠，且6月齡大鼠的PMOP 模型復制效果優(yōu)于3月齡大鼠，研究持續(xù)時間多為2～3 個月［23］。鄧琳課題組［24］的研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠的腰椎骨密度較對照組從第6 周即開始下降但無統(tǒng)計學意義，第10 周測量發(fā)現(xiàn)去勢組骨密度較對照組降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，有研究認為術后8 周血清骨代謝指標即出現(xiàn)改變，術后12 周變化更加突出［25］。本研究在保證造模效果的前提下，綜合考慮實驗成本、結果準確性、大鼠骨形成周期等因素，選取了手術后4 周后為干預開始節(jié)點，持續(xù)干預8周后測取實驗數據。

本研究結果顯示，低劑量培本固疏方對大鼠未產生明顯的骨質疏松改善作用，而中劑量組與高劑量組大鼠骨密度明顯提高，同時骨生物力學反映了各中藥劑量組均能不同程度地改善模型大鼠的骨骼質量，染色切片顯示其骨微結構明顯改善，證實了培本固疏方對骨質疏松大鼠的治療效果。筆者進一步檢測了大鼠血清中炎性標志因子TNF-α、IL-1β 與骨組織JNK、p38蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)培本固疏方中、高劑量組可以顯著下調大鼠TNF-α、IL-1β、JNK和p38的含量。

綜上所述，本研究建立了大鼠PMOP 模型，模型組大鼠骨密度降低，骨生物力學指標下降，病理切片見骨小梁排列稀疏、不規(guī)律，提示造模成功，其發(fā)病機制與JNK/p38 通路上調，TNF-α、IL-1β 異常分泌有關。通過培本固疏方治療后，中藥各劑量組大鼠骨密度增加，載荷能力、剛度明顯提高，同時血清中炎性因子TNF-α、IL-1β 含量減低，骨組織中JNK、p38 蛋白表達水平下調。說明培本固疏方治療OP，可能是通過抑制TNF-α、IL-1β 而實現(xiàn)的，JNK/p38 通路在當中起到重要作用。