陳宇航，蔡佳誠(chéng)，曹志龍，林鷺君，李伶俐，楊 凱，李 瀟

自Br?nmark首次提出“骨結(jié)合”理論以來(lái)，口腔種植學(xué)發(fā)展迅速[1]。骨種植體表面處理是影響骨結(jié)合的重要因素[2-3]，開(kāi)發(fā)不同設(shè)計(jì)和表面的鈦基種植體一直是研究的熱點(diǎn)[4]。聚多巴胺是一種多功能的表面改性高分子，具有類似于多巴胺(DOPA，dopamine)的結(jié)構(gòu)，因此可在任何材料表面(包括超疏水表面)進(jìn)行粘附，具有驚人的粘合性能和機(jī)械性能[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥成分可以同時(shí)具有抗菌和促成骨分化能力。黃芩苷是從植物黃芩的干燥根中提取分離出來(lái)的中草藥成分，具有多種藥理作用，如抗菌[6]、消炎[7]，并可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[8]，推測(cè)其可應(yīng)用于制備種植體表面涂層。本研究擬通過(guò)共沉積法制備富含聚多巴胺-黃芩苷的復(fù)合涂層，并探索其對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的生物活性影響，可為構(gòu)建具有生物活性的種植體涂層提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：純鈦片(寶雞鵬潤(rùn)新)；黃芩苷(純度95%，上海麥克林)；鹽酸多巴胺(純度98%，上海麥克林)；CCK-8試劑盒(同仁，日本)；ALP試劑盒(中暉赫彩)；曲拉通X-100(上海麥克林)；DAPI染色試劑(10 μg/mL, Biosharp)；Calcein AM細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(美侖)。

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

主要儀器：Merlin 高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(Zeiss，德國(guó))；倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)；電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(Instron，美國(guó))；接觸角測(cè)試儀(Powereach，上海中晨)；EscaLab Xi+ X射線光電子能譜儀(賽默飛，英國(guó))。

1.2 純鈦片預(yù)處理

商業(yè)圓形純鈦片(直徑10 mm，厚0.3 mm)依次經(jīng)800#、1 000#、1 200#鷹派砂紙打磨，然后用丙酮、乙醇、去離子水超聲清洗，每次15 min，取出后空氣中干燥備用。

1.3 聚多巴胺-黃芩苷涂層的負(fù)載與實(shí)驗(yàn)分組

配制黃芩苷溶液及多巴胺溶液：分別稱取一定量的黃芩苷粉末和鹽酸多巴胺粉末溶于Tris-buffer緩沖液中，使黃芩苷溶液、多巴胺溶液濃度為2 mg/mL，并使用NaOH、HCl調(diào)節(jié)pH值至8.5。

將鈦片分為4組，標(biāo)記為純鈦(Ti)組、黃芩苷(B)組、聚多巴胺(PDA)組、聚多巴胺-黃芩苷(B-PDA)組。將B組鈦片浸泡于足量黃芩苷溶液，PDA組鈦片浸泡于足量多巴胺溶液，B-PDA組鈦片浸泡于比例為1∶1的黃芩苷溶液、多巴胺溶液的混合液。避光保存24 h。

負(fù)載后處理：24 h浸泡后吸棄負(fù)載溶液，去離子水超聲震蕩儀中清洗15 min后，用PBS緩沖液清洗2～3遍。晾干后備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)鈦片的表征測(cè)試

1.4.1 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)觀察試件表面形貌 各組分別取2個(gè)鈦片樣本，經(jīng)噴金處理后進(jìn)行FESEM掃描。

1.4.2 表面接觸角實(shí)驗(yàn)測(cè)試試件表面的親水性 通過(guò)表面接觸角測(cè)試儀動(dòng)態(tài)檢測(cè)去離子水滴在各組鈦合金支架表面的接觸角大小，每組3個(gè)樣本，每樣本選擇2個(gè)不同位置，采集液滴影像并計(jì)算接觸角。

1.4.3 鈦片表面元素分析 通過(guò)X射線光電子能譜儀對(duì)樣品表面的元素組成進(jìn)行分析，每組3個(gè)樣本，采用Al Kα射線為激發(fā)源。

1.5 生物學(xué)評(píng)價(jià)

1.5.1 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn) (1)將實(shí)驗(yàn)所需試劑、加樣槍及槍頭放入超凈工作臺(tái)，紫外燈消毒30 min；(2)將處理好的鈦片分為4組：經(jīng)拋光后的純鈦片(Ti組)、黃芩苷組(B組)、聚多巴胺組(PDA組)、聚多巴胺-黃芩苷組(B-PDA組)，于121 ℃高溫高壓滅菌后置于24孔板中，每組設(shè)置5個(gè)平行孔；(3)光鏡下觀察細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs，在超凈工作臺(tái)上，棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶的原培養(yǎng)基，加入2 mL PBS磷酸緩沖液沖洗2～3次，加入1 mL胰蛋白酶消化細(xì)胞1～2 min；(4)將培養(yǎng)瓶置于光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，輕輕震蕩，待細(xì)胞變圓、間隙變大且懸浮時(shí)馬上加入1 mL α-MEM培養(yǎng)基終止消化，多次輕柔吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，離心機(jī)1 000 r/min離心5 min；(5)棄去上清液后加入一定量的α-MEM培養(yǎng)基，將離心管內(nèi)的細(xì)胞輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；(6)以1×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞鋪板，鋪板后應(yīng)注意將孔板搖勻；(7)分別于1、2、4 h吸出培養(yǎng)基，用PBS小心沖洗除去未粘附的細(xì)胞，每孔加入CCK-8試劑300 μL(動(dòng)作應(yīng)輕柔以免避免產(chǎn)生氣泡)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h；(8)將孔板取出，每孔吸取100 μL液體至新的96孔板中，避光，調(diào)設(shè)酶標(biāo)儀參數(shù)，設(shè)置450 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度值(OD值)。

1.5.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)、種板步驟與細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)步驟(1)～(6)相同。種板后將48孔板放入CO2孵箱培養(yǎng)，分別培養(yǎng)1、3、7 d后取出樣品，吸出培養(yǎng)基，用PBS小心沖洗除去未粘附的細(xì)胞，每孔加入CCK-8試劑300 μL(動(dòng)作應(yīng)輕柔以免產(chǎn)生氣泡)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h。后續(xù)步驟與1.5.1步驟(8)相同。

1.5.3 DAPI染色實(shí)驗(yàn) 將樣品放于24孔板中，每孔1個(gè)樣品，取BMSCs細(xì)胞懸液，以2×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，共培養(yǎng)24 h后去離子水漂洗2～3遍，轉(zhuǎn)移至新的24孔板，每孔加入適量多聚甲醛固定5 min后，吸棄固定液并用去離子水漂洗2～3遍，加入DAPI試劑染色20 min。吸棄染色液，去離子水漂洗2遍后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5.4 ALP活性檢測(cè) 將樣品放于24孔板中，每孔一個(gè)樣品，取BMSCs細(xì)胞懸液，以2×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，共培養(yǎng)7、14 d后取出樣品，去離子水漂洗2遍后放于新24孔板，每孔加入曲拉通X-100細(xì)胞裂解液60 μL，裂解30 min，吹打收集裂解液后12 000×g高速低溫離心20 min，收集上清液按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 理化性能

2.1.1 表面形貌分析 掃描電鏡觀察各組樣品表面結(jié)構(gòu)(圖1)，可見(jiàn)除Ti組外各組表面有大量微球狀結(jié)構(gòu)。Ti組表面未見(jiàn)明顯微球。B組表面可見(jiàn)大量微球，相互間有所融合；PDA組微球數(shù)量明顯減少，形成微納米級(jí)的網(wǎng)狀表面結(jié)構(gòu)。B-PDA組表面較均勻，微球數(shù)量與PDA組相似，表面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加均勻。高倍鏡下可見(jiàn)B組微球結(jié)構(gòu)清晰，相互融合處可見(jiàn)少量裂紋；PDA組網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)可見(jiàn)不平整表面，B-PDA組的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為致密，中間孔隙較PDA組少。

圖1 各組鈦片表面場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡形貌

2.1.2 親水性分析 通過(guò)接觸角測(cè)試儀檢測(cè)4組鈦片的接觸角(圖2)。Ti組、B組、PDA組、B-PDA組的平均接觸角分別為(72.07±13.02)°、(68.30±15.57)°、(45.02±19.73)°、(51.37±8.70)°?？梢?jiàn)Ti組與B組的接觸角較大，親水性較差，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；PDA組及B-PDA組親水性較好，與Ti組、B組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而PDA組的平均接觸角最小，與B-PDA組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖2 各組接觸角

A：B組的N1s區(qū)域；B：PDA組的N1s區(qū)域；C：B-PDA組的N1s區(qū)域；D：B組的O1s區(qū)域；E：PDA組的O1s區(qū)域；F：B-PDA組的O1s區(qū)域

2.2 生物學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 BMSCs粘附實(shí)驗(yàn) BMSCs粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表1)，BMSCs在各組支架上均具有粘附能力，其中1、2 h時(shí)PDA組的細(xì)胞數(shù)目較其余三組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2 h時(shí)B組及B-PDA組的細(xì)胞數(shù)目較Ti組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4 h時(shí)Ti組比B-PDA組的細(xì)胞數(shù)目多，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ti組與B-PDA組的細(xì)胞數(shù)目比B組、PDA組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組鈦片表面骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附的CCK-8吸光度值

2.2.2 BMSCs增殖實(shí)驗(yàn) OD值提示(表2)，BMSCs在各組鈦片上生長(zhǎng)1、3、7 d均能持續(xù)增殖，B-PDA組的增殖速度最快，B組次之，與Ti組、PDA組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在1、7 d時(shí)，Ti組與PDA組增殖速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在3 d時(shí)，PDA組增殖最慢，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組鈦片表面骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的CCK-8吸光度值

2.2.3 DAPI染色結(jié)果 DAPI染色后倒置熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)4組的細(xì)胞形態(tài)(圖4)。鈦片上細(xì)胞核呈明亮的藍(lán)色，形態(tài)為圓形或橢圓形，細(xì)胞核體積基本一致。細(xì)胞呈梭形，均有伸出絲狀足，且四組的細(xì)胞密度均較為密集，細(xì)胞形態(tài)良好，負(fù)載聚多巴胺或黃芩苷與純鈦組相比，細(xì)胞形態(tài)改變不明顯。

圖4 DAPI染色后各組鈦片表面BMSCs形態(tài)( ×100)

2.2.4 BMSCs中ALP活性檢測(cè) 在第7天時(shí)，B-PDA組的細(xì)胞內(nèi)ALP活性高于Ti組、B組、PDA組(P<0.05)；第14天時(shí)，B組、B-PDA組的細(xì)胞內(nèi)ALP活性均顯著高于Ti組、PDA組(P<0.05)，而PDA組的細(xì)胞內(nèi)ALP活性較另外三組低(P<0.05)(表3)。

表3 培養(yǎng)7、14 d各組BMSCs的ALP活性

3 討 論

口腔種植體常用的材料是鈦基金屬，屬于惰性金屬，存在生物活性差、缺乏骨誘導(dǎo)等特點(diǎn)，與機(jī)體骨組織之間主要為機(jī)械結(jié)合[9]。對(duì)骨種植體表面進(jìn)行處理是影響骨結(jié)合的重要因素[4]，短時(shí)間內(nèi)使植入體與周圍骨組織發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的“骨整合”是保證植入體種植成功的關(guān)鍵[10]。因此，許多研究通過(guò)物理改性、化學(xué)改性或生物化學(xué)改性等方法，改變純鈦金屬表面的生物活性，增強(qiáng)種植體與機(jī)體的骨結(jié)合[11]。

另外，有研究表明，黃芩苷具有影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動(dòng)、促進(jìn)新骨形成和減少骨吸收的作用[7]。從本實(shí)驗(yàn)CCK-8檢測(cè)的OD值可見(jiàn)，BMSCs在各組材料上都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)粘附增殖。在粘附實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)2 h后實(shí)驗(yàn)組OD值高于對(duì)照組，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；4 h后實(shí)驗(yàn)組(B-PDA組)的OD值與對(duì)照組(Ti組)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)?？赡苁怯捎趯?shí)驗(yàn)組能促進(jìn)細(xì)胞更快地粘附，而在4 h時(shí)細(xì)胞密度接近飽和，使對(duì)照組的OD值接近實(shí)驗(yàn)組。這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組可能對(duì)BMSCs的粘附有一定的促進(jìn)作用。在增殖實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)1、3、7 d后的實(shí)驗(yàn)組(B-PDA組)的OD值均比對(duì)照組高(P<0.05)，提示負(fù)載聚多巴胺-黃芩苷復(fù)合涂層可促進(jìn)BMSCs的增殖。而PDA組在粘附、增殖方面均體現(xiàn)出抑制作用，考慮可能是制備PDA涂層時(shí)仍有部分多巴胺單體未完全聚合殘留于鈦片表面，而多巴胺單體對(duì)細(xì)胞具有一定的抑制作用，也因此影響了PDA組的粘附、增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[21]，這可能也是導(dǎo)致ALP實(shí)驗(yàn)中PDA組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較另外三組偏低的原因。

ALP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，在7 d時(shí)，B-PDA組的細(xì)胞內(nèi)ALP活性高于Ti組、B組、PDA組(P<0.05)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組可促進(jìn)BMSCs的成骨向分化；在14 d時(shí)，B組、B-PDA組的細(xì)胞內(nèi)ALP活性均顯著高于Ti組、PDA組(P<0.05)，進(jìn)一步提示影響B(tài)MSCs成骨向分化的主要涂層物質(zhì)為黃芩苷，這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致[22]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)共沉積法負(fù)載聚多巴胺-黃芩苷的復(fù)合涂層可改善純鈦金屬表面的親水性，提高其生物相容性，并促進(jìn)BMSCs的成骨向分化。然而本實(shí)驗(yàn)仍未深入探討該涂層影響B(tài)MSCs增殖分化的信號(hào)通路，以及不同濃度的黃芩苷、聚多巴胺負(fù)載的對(duì)比?？梢宰鳛槲磥?lái)研究深入的方向，為今后種植體表面處理、中藥涂層負(fù)載的方法提供新的思路。