王秀珍，賈坤平，趙 楠，倪 虹，王 虹，王亞楠，王樹人,3，彭宇飛,3△,吳全娥

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；4.河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050200)

經介入、溶栓等治療后心肌損傷反而愈加嚴重的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[1]，介入和藥物治療雖然取得了一定進展，但是臨床中患者還可能出現(xiàn)血管再狹窄、閉塞等現(xiàn)象。隨著組織工程學的快速發(fā)展，利用生長因子促進血管新生為本病的治療提供了新的研究思路；但是也存在諸多安全隱患，可能使粥樣斑塊內血管生成導致斑塊擴張，腫瘤、糖尿病視網膜病變患者長期應用可能會誘發(fā)腫瘤轉移及加重血管生成源性疾病等。在這種情況下，科研工作者開始考慮具有靶向定植作用的干細胞移植增強局部血管新生，促進側支循環(huán)建立。骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)廣泛應用于骨關節(jié)疾病、肝硬化、腎移植及心血管疾病等的治療中均取得良好效果[2-5]，骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有經誘導可分化為心肌細胞的特點，成為心血管移植的“種子細胞”。受梗死區(qū)域微環(huán)境的影響B(tài)MSCs分化為心肌細胞十分困難，5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)是BMSCs向心肌細胞分化的主要誘導劑，但因為抗腫瘤藥物具有明顯的細胞毒性。故尋找安全、有效的誘導劑是本課題研究的重點，針灸治療有安全性高、無毒和無副作用的特點。因此本課題通過制備MIRI模型，采用電針作為誘導方法探討電針誘導BMSCs分化為血管生長因子的機制研究。

1 材料

1.1 實驗動物

選用4～6周SPF級SD大鼠10只，體質量(100±10)g,用于提取BMSCs；SPF級SD雄性大鼠90只，體質量(200±10)g,用于移植。上述實驗動物由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，合格證號為：SCXK(黑)2016004，通風，普通飼養(yǎng)，實驗過程按照動物倫理學標準執(zhí)行[6]。

1.2 實驗儀器

倒置相差顯微鏡(美國SCILOGEX)；TC2323二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SL)；低溫高速離心機MIKRO 220(德國Hettich公司)；HX-200動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；2135型切片機(德國菜卡公司)；Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；H-500型透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.3 實驗試劑

青霉素鏈霉素溶液(Hyclone公司)；特級胎牛血清(Hyclone公司)；胰酶細胞消化液(Beyotime公司)；CD29(美國eBioscience)；DMSO(中國凱基)；戊二醛(武漢博士德生物有限公司)；抗熒光淬滅劑(中國Solarbio)；全蛋白提取試劑盒；BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國wanleibio)；預染蛋白分子量標準(加拿大Fermentas)。

1.4 BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定

將大鼠頸椎脫臼法處死，剪斷脛骨、股骨兩側骺端，暴露髓腔，采用全骨髓貼壁法進行培養(yǎng)。方法：加入濃度為15%胎牛血清重懸細胞，在溫度37 ℃、濃度5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，標記為第一代(P0)，待P1代細胞融合達80%～90%左右，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代，按1∶2比例傳代，標記為P2代，以此類推，P3 代細胞長滿后，用流式細胞儀鑒定細胞表面抗原。

2 方法

2.1 造模方法

術前禁食、不禁水12 h，1%戊巴比妥那腹腔麻醉，行氣管插管術，呼吸機輔助通氣(通氣頻率約50次/min)，心臟暴露充分，結扎冠狀動脈左前降支，拉緊并固定縫合線。觀察心電圖變化，Ⅱ導聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高、T波高聳和倒置，提示心肌缺血形成；30 min后松開止血鉗，恢復再灌注60 min，再灌注損傷成功標志以Ⅱ導聯(lián)上抬的ST段下降50%或高聳的T波下降為準。

2.2 分組及移植

將大鼠隨機分為5組，每組6只。分別為假手術組、模型組、電針組、BMSCs組和電針+BMSCs組。假手術組：只穿線不結扎；模型組：造模成功后在缺血區(qū)3點、6點和9點位點注射生理鹽水；電針組：造模成功后，前肢內側離腕關節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間取“內關穴”[7]，用0.30 mm×25 mm針刺，深度約5 mm，雙側“內關”穴接正極，“內關”穴近心端上約1.5 mm處刺入一根毫針接負極，疏密波(疏波2 Hz，密波100 Hz)刺激，強度以局部呈現(xiàn)稍微振動為宜，治療30 min，每日1次；BMSCs組：造模成功后，立即在梗死區(qū)周邊3個點注射BMSCs 25 μL(細胞數(shù)目5×106)；電針+BMSCs組：造模成功后，移植方法同BMSCs組，電針治療同電針組。各組連續(xù)治療14 d，分3 d、7 d和14 d共3個時間點取材。

2.3 指標檢測

2.3.1 BMSCs的鑒定 流式細胞儀檢測以CD29陽性率高于90%鑒定所得細胞為高純度的BMSCs。

2.3.2 電鏡觀察心肌超微細胞結構 各時相點結束后迅速取出心臟，取約1 mm×1 mm×2 mm心肌組織，2.5%戊二醛固定24 h，固定于1%的鋨酸固定液中2 h，乙醇梯度脫水；環(huán)氧樹脂包埋聚合，超薄切片機切片，檸檬酸鉛和醋酸雙氧軸雙重染色，H-500型透射電子顯微鏡拍片。

2.3.3 免疫組化法檢測VEGF、TGF-β1 蛋白含量 取約2 mm×2 mm×2 mm心肌組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、乙醇逐級脫水、二甲苯透明后，加入一抗、二抗，DAB顯色、蘇木素復染，400倍鏡下觀察。

2.3.4 Western blot法檢測Ang-1、bFGF蛋白含量的變化 蛋白質抽提，RIPA裂解緩沖液細胞裂解，SDS-PAGE蛋白電泳分離，轉膜，蛋白印記，孵育一抗、二抗，ECL顯色等。GAPDH作為內參，以Quantity one(Bio-Rad)分析軟件處理圖片。

2.4 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 BMSCs表面抗原的鑒定

流式細胞儀檢測結果顯示CD29陽性率高于90%，提示細胞純度較高，均一性較好，符合后續(xù)實驗要求。見圖1。

圖1 BMSCs表面抗原CD29的鑒定

3.2 各組大鼠心肌超微細胞結構變化

假手術組心肌細胞無水腫，線粒體內嵴清晰且排列致密整齊，結構清晰；模型組心肌細胞線粒體出現(xiàn)腫脹，局部膜崩解、消失，部分出現(xiàn)內嵴溶解；電針組、BMSCs組、電針+BMSCs組心肌線粒體腫脹，內嵴部清晰，溶解現(xiàn)象減輕，電針+BMSCs組減輕尤為顯著。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌超微細胞結構變化(14 d,200×)

3.3 免疫組化檢測VEGF、TGF-β1蛋白含量的變化

3.3.1 各治療組對大鼠VEGF蛋白含量的影響 VEGF定位于胞質上，免疫組化染色后呈“黃褐色”即陽性表達。再灌注后，與假手術組比較，其他各組各個時相點VEGF蛋白含量明顯升高；與模型組比較，各個治療組各時相點VEGF蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中電針+BMSCs組較其他兩治療組VEGF蛋白水平升高更加明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著時間延長，各治療組VEGF蛋白呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；與再灌注3 d比較，7 d、14 d時VEGF蛋白水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與再灌注7 d比較，14 d時VEGF蛋白水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中以電針+BMSCs組療效更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 各組大鼠各時相點VEGF IOD值的變化

圖3 各組心肌組織中VEGF蛋白表達水平(14 d， 400×)

3.3.2 各治療組對大鼠TGF-β1蛋白含量的影響 TGF-β1定位于胞質中，免疫組化染色后呈“黃褐色”即陽性表達。在灌注后，與假手術組比較，其他各組各時相點TGF-β1蛋白含量明顯升高；再灌注3 d、再灌注7 d時，與模型組比較，各個治療組各時相點TGF-β1蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中電針+BMSCs組較其他兩治療組TGF-β1蛋白水平升高更加明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著時間延長，各治療組TGF-β1蛋白呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢；與再灌注3 d比較，7 d、14 d時TGF-β1蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與再灌注7 d比較，14 d時電針+BMSCs組TGF-β1蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖4。

表2 各組大鼠各個時相點TGF-β1 IOD值的變化

圖4 各組心肌組織中TGF-β1蛋白表達水平(14 d，400×)

3.4 Western blot 法檢測Ang-1、bFGF蛋白含量的變化

3.4.1 各組Ang-1蛋白含量的變化 再灌注后，與假手術組比較，其他各組各個時相點Ang-1蛋白含量明顯升高；與模型組比較，各個治療組各時相點Ang-1蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中電針+BMSCs組較其他兩治療組Ang-1蛋白水平升高更加明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著時間延長，各治療組Ang-1蛋白呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；與再灌注3 d、7 d比較，14 d時Ang-1蛋白水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中以電針+BMSCs組療效更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖5。

表3 各組大鼠各個時相點Ang-1蛋白含量變化

注：1.假手術組;2.模型組;3.電針組;4.BMSCs組;5.電針+BMSCs組。圖5 Ang-1蛋白表達(14 d)

3.4.2 各組bFGF蛋白含量的變化 再灌注后，與假手術組比較，其他各組各個時相點bFGF蛋白含量明顯升高；與模型組比較，各個治療組各時相點bFGF蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中電針+BMSCs組較其他兩治療組bFGF蛋白水平升高更加明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著時間延長，各治療組bFGF蛋白呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；與再灌注3 d、7 d比較，14 d時bFGF蛋白水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中以電針+BMSCs組療效更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4、圖6。

表4 各組大鼠各個時相點bFGF蛋白含量變化

注：1.假手術組;2.模型組;3.電針組;4.BMSCs組;5.電針+BMSCs組。圖6 bFGF蛋白表達(14 d)

4 討論

心肌缺血再灌注損傷可歸屬于中醫(yī)學的“胸痹” “心痛” “厥心痛”“真心痛”等范疇，縱觀古今文獻，胸痹心痛之病因病機多“本虛標實，虛實夾雜”,《素問》曰：“生病起于過用”，本虛者，多因七情、飲食和勞倦等太過導致人體正氣虛耗，而發(fā)內傷疾患。若再以年老、肥胖等多種原因的長期綜合作用，就有可能導致胸痹心痛的發(fā)生。在本虛的基礎上，調攝失宜，致寒凝、痰濁、瘀血和氣滯等上沖胸中，痹阻心脈而發(fā)??；若積極的中醫(yī)藥或者現(xiàn)代醫(yī)學的介入治療能夠實現(xiàn)血管再通，但是血管再通后還可能出現(xiàn)血管再狹窄、閉塞等現(xiàn)象，因此現(xiàn)代科研工作者從促進血管新生為切入點開展本病的研究。BMSCs具有強大的分化能力，可以明顯增加新生血管數(shù)量，減小心肌梗死面積及減少瘢痕形成[8-12]，但受梗死區(qū)域微環(huán)境的影響移植后BMSCs存在遷移率低、歸巢數(shù)量少等問題，因此必須尋找一種有效的誘導方法，針灸治療具有無毒、無副作用的特點。內關穴“內”相對于“外”而言，“關”有要塞，聯(lián)絡等意，《說文解字》曰:“以木橫持門戶也”，《靈樞·經脈》曰：“心胸內關謀 ”；《標幽賦》曰：“胸滿腹痛刺內關”；《針灸逢源》記載內關主治“心中驚悸” “心氣虛損” “心驚發(fā)狂” “心中虛惕” “心虛膽寒” “五癇口中吐沫”等心系病證?！夺樉纳駮吩唬骸靶母姑洕M”；《針灸大成》曰：“內關主心痛”，內關穴治療缺血性心肌病具有經絡特異性且電刺激能夠增強治療效果[13-15]。因此本課題選用電針內關穴，觀察其誘導BMSCs分化為血管生長因子的機制研究。

本實驗結果顯示CD29陽性率大于90%，表明細胞純度較高、均一性良好，可用于后續(xù)實驗。電鏡下發(fā)現(xiàn)電針+BMSCs組心肌線粒體腫脹，內嵴部清晰，溶解現(xiàn)象減輕，說明損傷程度明顯減輕，隨著治療時間的延長，心肌線粒體損傷逐漸修復。血管內皮生長因子(VEGF)是目前公認的最強有力的血管生成因子，具有特異性的促進內皮細胞的分裂、增殖遷移等特點，它能夠迅速而有效地促進血管新生[16]，Sarkar等[17]研究表明將VEGF-A165注入心衰患者的心室中，數(shù)周后冠脈CT示側支循環(huán)建立。Hedman等[18]將VEGF基因的腺病毒經冠脈注射，半年后觀察患者再灌注損傷明顯改善，血管再狹窄未復發(fā)。也有學者分別從心肌組織存活數(shù)量、血管密度和血管生成的表達，側面證實VEGF具有促進血管新生的作用[19-22]。轉化生長因子(TGF-β1)是在機體內活性最強、最廣泛的一種多肽生長因子。近年來對MIRI研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1具有參與心肌修復與重塑的作用，調節(jié)I/R后細胞生物學反應的作用[23]。有研究顯示TGF-β1在缺血的早期就能夠激活TGF-β1-Smad2, 3通路調控炎性細胞增殖，進而阻止炎癥因子對梗死區(qū)域的浸潤[24]。因此，TGF-β1對于梗死區(qū)域的炎癥改變具有明顯的干預作用，能夠加速炎癥愈合。但也有研究認為，TGF-β1是一個很強的促纖維化因子，顯著提高膠原合成能力，從而導致細胞外基質沉積，心肌纖維化形成，纖維化的發(fā)生造成心室重塑、心功能減退[25-26]。本課題實驗研究結果顯示免疫組化染色后VEGF、TGF-β1呈“黃褐色”即陽性表達。電針+BMSCs組治療效果明顯優(yōu)于其他治療組(P<0.05)，在14 d時VEGF表達呈現(xiàn)高表達；與再灌注3 d比較，7 d、14 d時TGF-β1蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與再灌注7 d比較，14 d時電針+BMSCs組TGF-β1蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，推測電針+BMSCs組在早期上調VEGF、TGF-β1的水平，對缺血心肌起到修復作用，到后期下調TGF-β1水平，減輕心肌纖維化，防止心室重塑。

血管生成素(Ang-1)是另一類血管形成相關因子，可特異性地與內皮細胞膜上的Tie-2受體結合調控血管生成和血管成熟[27],Ang-1具有抗炎、維持血管穩(wěn)定和提高細胞活力的作用[28-29]。梁云亮等[30]用Ang-1水平評估急性心梗患者行PCI術后預后情況，結果顯示1年后急性心梗患者血清中Ang-1濃度明顯高于正常對照組。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)廣泛用于損傷區(qū)域肉芽組織修復、組織重建等，具有調控細胞生長，改善其微環(huán)境，從而促進組織的再生與修復的作用。楊梅[31]研究顯示bFGF可以明顯改善大鼠的心功能。本課題組Western blot 法檢測結果顯示Ang-1、bFGF蛋白水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中以電針+BMSCs組療效更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示電針+BMSC組能夠改善缺血區(qū)微環(huán)境，促進血管新生及側支循環(huán)建立，促進梗死區(qū)組織的再生與修復。

綜上所述，電針誘導的BMSCs移植可以明顯促進缺血區(qū)邊緣血管內皮細胞生長，其機制可能增加VEGF、Ang-1及bFGF蛋白水平，動態(tài)調控TGF-β1水平有關,說明電針誘導BMSCs移植能夠動態(tài)促進血管修復。