石 英，李燕舞，龐紀彩，伏桂華，劉建勝

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061)

鹽度是魚類養(yǎng)殖中重要的水環(huán)境因子之一。魚類養(yǎng)殖過程中，適當?shù)柠}度不僅可以提高魚類的生長[1-4]、繁殖[5]及肌肉的品質(zhì)[1-3,5]，還可以激活自身的抗氧化機制，使體內(nèi)抗氧化酶的酶活性增加[4-6]，增強機體免疫力，降低魚類發(fā)病率，但當鹽度濃度或變化幅度超出魚體耐受范圍，會引發(fā)魚體生理應(yīng)激反應(yīng)并產(chǎn)生大量有害的氧活性自由基，致使機體氧化損傷且免疫力下降[8-11]。目前，有關(guān)鹽度對魚類抗氧化酶活性的研究可見于大麻哈(Oncorhynchusketa)[8]、銀鯧(Pampusargenteus)[9]、花鱸(Lateolabraxjaponicus)[10]和金錢魚(Scatophagusargus)[11]、刀鱭(CoiliamacrognathosBleeker)[12]、虹鱒(O.mykiss)[13]、大鱗鲃(Barbuscapito)[14]、云紋石斑(Epinephelusmoara)[15]、鈍吻黃蓋鰈(Pseudopleuronectesyokohamae)[20]等，而黃河鯉(Cyprinuscarpiohaematoperus)未見有相關(guān)研究報道。魚類鰓上皮細胞的Na+/K+-ATP酶可以通過調(diào)節(jié)細胞膜離子通透性來維持滲透壓的穩(wěn)定[24]，是魚體滲透壓變化的一個重要指標。當水環(huán)境中鹽度適度變化時，Na+/K+-ATP酶會適當提高來控制細胞膜內(nèi)外的Na+、K+離子濃度差、維持細胞內(nèi)外滲透壓平衡，并能為機體的運輸系統(tǒng)(如腎臟、鰓等)提供能量；但當鹽度變化太大時，鰓組織受損，鰓絲Na+/K+-ATP酶活性受抑制[17-23]。鹽度對Na+/K+-ATPase酶活性的報道可見于銀鯧[9]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)[18]、黃條鰤(Seriolaaureovittata)[19,23,27]、鈍吻黃蓋鰈[20]、史氏鱘(Acipenserschrenckii)[21]、珍珠龍膽石斑魚(Pearlgentiangrouper)[29]等。

黃河鯉，隸屬鯉形目鯉科鯉屬，其肉質(zhì)細嫩肥美，營養(yǎng)豐富[7]，因鱗片金黃、各鰭尤其是尾鰭尖部鮮紅又有 “金鱗赤尾”之贊，被譽為我國四大名魚之一。隨著生活質(zhì)量提高，人們對黃河鯉的需求量不斷增加。為了增加養(yǎng)殖面積，不少地區(qū)利用灘涂、鹽堿地等挖掘池塘進行黃河鯉的養(yǎng)殖，但這些地區(qū)的水體鹽度比一般養(yǎng)殖用水高很多，但是過高的鹽度會抑制機體消化酶及抗氧化酶活性[8-10]，破壞鰓腎組織和滲透壓平衡[4]， 影響繁殖性能[6]。本試驗通過研究鹽度脅迫對黃河鯉耐受性、肝臟抗氧化酶活性和鰓絲Na+/K+-ATPase酶活性的影響，旨在為拓展黃河鯉養(yǎng)殖空間和擴大規(guī)模提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用黃河鯉幼魚4月齡，平均體質(zhì)量(8.51±0.69) g，平均體長(7.12±0.29) cm，購自河南興達水產(chǎn)養(yǎng)殖場。試驗在山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院水循環(huán)養(yǎng)殖實驗室進行。

1.2 試驗方法

預(yù)試驗:采用玻璃缸內(nèi)靜態(tài)急性毒性試驗法[16]。根據(jù)黃河鯉疾病防治的常用鹽度適當調(diào)整來進行預(yù)試驗，確定黃河鯉幼魚24 h全致死濃度為和96 h無死亡濃度，以此作為正式試驗時鹽度的上下限。按等對數(shù)間距設(shè)計7個鹽度組：0(對照組)、12.0、13.0、14.1、15.3、16.6、18.0，每個處理組設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)20尾魚，共420尾魚。統(tǒng)計各試驗組黃河鯉魚幼魚在12、24、48、72、96 h的死亡情況。計算分析出12、24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為16.64、16.15、15.59、14.89，安全濃度為4.56。

急性鹽度脅迫試驗：在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)0(對照組)、3、6、9、12、15為6個鹽度組，每個處理組設(shè)3個平行組，每一平行實驗組放40尾幼魚，共720尾。試驗用魚均在20 min內(nèi)分組完成，以免影響試驗結(jié)果準確性。

1.3 試驗管理

試驗開始前，將黃河鯉置于玻璃缸(0.6 m×0.4 m×0.6 m)中暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)期間，每天投喂三次(8:00、12:00、16:00)，投喂量為魚體重的2%～3%；水質(zhì)條件維持在水溫(23.2±1.0) ℃、pH 7.3±0.2、溶解氧(6.5±1.0) mg/L、鹽度<1、氨氮<0.01 mg/L；每2 d換水一次，換水量為1/4。暫養(yǎng)結(jié)束后挑選體格健壯、規(guī)格相近的個體進行試驗。

試驗所用鹽水為連續(xù)曝氣24 h以上的自來水加速溶海水晶配制而成，配制好后穩(wěn)定24 h，用手持式鹽度計(廣州普析通儀器有限公司生產(chǎn))測定鹽度。試驗開始前2 d停止投喂，在整個試驗期間停食，不換水，不充氣。試驗水質(zhì)與暫養(yǎng)時相同，每天定時監(jiān)測鹽度變化。

1.4 指標測定與方法

試驗開始后0、12、24、48、72、96 h進行采樣。每個處理組隨機迅速撈取9尾(每缸3尾)黃河鯉幼魚置于冰盤上解剖取肝臟和鰓絲，用預(yù)冷的生理鹽水快速沖洗并用脫脂棉擦干，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。準確稱取解凍后組織樣品放入預(yù)冷的離心管中，按照質(zhì)量(g)與體積(mL)比為1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水進行組織勻漿，在4 ℃、3 600 r/min(轉(zhuǎn)子直徑171.5 mm)的條件下離心30 min，取上清液，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行相關(guān)指標的檢測。

黃河鯉幼魚肝臟用于測定抗氧化指標：超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、溶菌酶(LZM)的活性及丙二醛(MDA)含量的測定；鰓絲用于Na+/K+-ATPase酶活性的測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel進行處理，用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行單因素方差分析，P<0.05為具有顯著性差異。試驗結(jié)果用平均值±標準差表示，并用Excel 2013制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟抗氧化性能的影響

2.1.1 急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟SOD活性影響

鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟SOD活性影響見圖1。鹽度脅迫時間對黃河鯉幼魚的SOD活性影響較顯著，不同的鹽度脅迫對各組間個體SOD活性變化同樣存在顯著差異。與對照組相比，各鹽度組黃河鯉幼魚肝臟組織的SOD活性隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在脅迫12 h時顯著升高并達峰值，之后隨著脅迫時間的增加，各鹽度組的SOD活性逐漸下降并在96 h時下降至最低水平，且高鹽度組12和15組的SOD活性均顯著低于對照組。同一脅迫時間不同鹽度組相比：在脅迫6～72 h，各鹽度組的SOD活性呈現(xiàn)升高的趨勢；脅迫96 h時，3和6組的SOD活性顯著高于其他組并維持在較高水平，15組的SOD活性顯著低于其他鹽度組。

圖1 鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟SOD活性影響

2.1.2 急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟CAT活性的影響

急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟CAT活性的影響見圖2。由圖2可知，隨著急性鹽度脅迫時間的延長，各鹽度組的CAT活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。其中，3、6、9鹽度組CAT活性于脅迫48 h時達峰值，當脅迫72 h時又迅速下降，且6鹽度組在脅迫96 h時仍維持較高的CAT活性。12和15鹽度組的CAT 活性在脅迫24 h時分別達最高值，隨后呈下降趨勢，且15鹽度組在脅迫72 h后，CAT活性降至較低水平，與對照組相比無顯著差異，且隨時間變化CAT活性變化不顯著，趨于平穩(wěn)。

圖2 鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟CAT活性的影響

2.1.3 急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟GSH-Px活性的影響

急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟GSH-Px活性的影響見圖3。與對照組相比，各鹽度組在急性鹽度脅迫48 h時的GSH-Px活性均顯著升高至峰值，其中12鹽度組的GSH-Px活性最高達到(25.28±0.38) ng/g，比對照組高出161.02%。當脅迫時間由48 h延長至96 h，9、12、15三個高鹽度組的GSH-Px活性呈下降趨勢，而3、6鹽度組的GSH-Px活性變化不顯著并保持較高水平。

圖3 急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟GSH-Px活性的影響

2.1.4 急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟LZM活性的影響

急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟LZM活性的影響見圖4。由圖4可見，各鹽度組的LZM活性在不同的脅迫時間均顯著高于對照組；且隨著脅迫時間的延長，各鹽度組的LZM活性總體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。各鹽度組的LZM活性達峰值的脅迫時間不同，3、6和9組在脅迫48 h時達峰值，而12和15鹽度組則在脅迫72 h達最高值。

圖4 鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟LZM活性的影響

2.1.5 急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟MDA含量的影響

急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟MDA的影響見圖5。各鹽度組的MDA含量在脅迫6 h時均達峰值隨后呈現(xiàn)下降趨勢。隨著脅迫時間的延長，3和6鹽度組的MDA含量一直維持在較低水平，而12和15鹽度組的MDA含量雖有下降但仍顯著高于3和6鹽度組。

圖5 急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚肝臟MDA含量的影響

2.2 鹽度脅迫對黃河鯉魚幼魚鰓絲Na+/K+-ATPase酶活性的影響

鹽度脅迫對黃河鯉幼魚鰓絲Na+/K+-ATPase酶活性的影響見圖6。鹽度變化和脅迫時間對黃河鯉鰓絲Na+/K+-ATPase酶活性影響較顯著。同一鹽度組在不同的脅迫時間，隨著鹽度脅迫時間的延長，3鹽度組的鰓絲Na+/K+-ATPase酶活性一直處于升高趨勢，而其他各組均呈先升高后下降的變化趨勢，其中6鹽度組在脅迫72 h時Na+/K+-ATPase酶活性達峰值后維持較高水平，9、12和15鹽度組的Na+/K+-ATPase酶活性則在脅迫48 h達峰值后隨脅迫時間延長顯著下降。

圖6 鹽度脅迫對黃河鯉幼魚鰓絲Na+/K+-ATPase酶活性的影響

3 討論

3.1 急性鹽度脅迫對黃河鯉幼魚抗氧化酶活性的影響

魚類受到鹽度脅迫會產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性自由基[17]，自由基的過量積累會使機體細胞氧化受損，但當鹽度在魚類耐受范圍內(nèi)，魚類自身的抗氧化機制會被激活，能夠清除體內(nèi)氧自由基，增強機體的免疫力，維持體內(nèi)動態(tài)平衡[8-11]。機體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基主要是靠SOD、CAT、GSH-Px等自由基解毒酶進行清除，從而保持其產(chǎn)生與積累的相對平衡。SOD是魚類抗氧化系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的一種金屬酶，也是一種高度誘導(dǎo)酶，主要清除超氧陰離子，機體受脅迫產(chǎn)生的大量活性氧自由基誘導(dǎo)SOD活性升高，歧化產(chǎn)生大量的過氧化氫，而CAT則將過氧化氫催化分解為水和分子氧[10-12]。GSH在抗氧化系統(tǒng)中是一類非常重要的非酶抗氧化劑，可作為SOD產(chǎn)生過氧化氫的底物[22]。SOD、CAT、GSH-Px活性的高低反映了魚體抗氧化性能的高低。本試驗結(jié)果表明鹽度濃度和脅迫時間均對黃河鯉幼魚肝臟SOD、CAT、GSH-Px均有顯著影響，這與大麻哈[8]、銀鯧[9]、花鱸[10]、金錢魚[11]和刀鱭[12]等的研究結(jié)果一致。本試驗中，在同一鹽度濃度組隨著脅迫時間的延長，黃河鯉幼魚肝臟SOD、CAT和GSH-Px的活性變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)先升高后又下降的趨勢，并逐漸趨于平穩(wěn)。這可能是急性鹽度脅迫打破了生物體內(nèi)的平衡，導(dǎo)致體內(nèi)自由基快速增多，機體快速啟動抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮其防御作用。LZM是一類能水解粘多糖的堿性蛋白酶，對進入體內(nèi)異物等能夠起到破壞和消除的作用，增強機體的免疫調(diào)節(jié)能力[17]。有研究表明，軍曹魚[5]、云紋石斑[15]、許氏平鲉(Sebastesschlegeli)[25]等的溶菌酶活力隨著鹽度的升高有先升高后下降的趨勢。本試驗中，隨著脅迫時間的延長，各鹽度組的LZM的活力達峰值的時間有所不同，但都有先升高后下降的趨勢。由此可見，在脅迫初期溶菌酶的活力升高以應(yīng)對鹽度變化的應(yīng)激，隨著脅迫時間的延長魚體自身的免疫調(diào)節(jié)機制紊亂，抵抗能力下降，從而導(dǎo)致溶菌酶活力下降。丙二醛(MDA)是生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量大小是反映機體抗氧化能力的重要參數(shù)，可以反映機體脂質(zhì)過氧化速率和強度，也能間接反映組織過氧化損傷程度[15,28]。張宇婷等[14]對大鱗鲃鹽度脅迫表明，隨著脅迫時間的延長，各鹽度組的肝臟MDA含量有先升后降并趨于平穩(wěn)的趨勢。本試驗中，各鹽度組在0～96 h的脅迫時間里MDA含量也呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，與上述研究結(jié)果一致。但是，本試驗中以脅迫6 h時各鹽度組MDA達最大值，這可能是由于急性鹽度脅迫使機體在較短時間(6 h)來不及進行抗氧化機制調(diào)節(jié)致使代謝負載過重所致。隨著脅迫時間的延長，各鹽度組的MDA含量均有下降，表明機體抗氧化調(diào)節(jié)機制發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。

由此可見，本試驗中黃河鯉幼魚能夠耐受6以下的鹽度，且抗氧化性能有所升高；鹽度過高的養(yǎng)殖環(huán)境會抑制黃河鯉幼魚的抗氧化酶活性，降低機體抗氧化能力。

3.2 鹽度脅迫對黃河鯉幼魚鰓絲Na+/K+-ATPase活性的影響

魚類通過滲透壓調(diào)節(jié)來控制體內(nèi)的水-鹽平衡，當水體鹽度過高時，魚類的鰓絲細胞收縮，鰓小片會變細，且間距增大來適應(yīng)因鹽度變化導(dǎo)致的耗氧量的增加[27,29]，并且消耗更多能量來維持體內(nèi)滲透壓平衡[3,26]。魚類鰓上皮細胞的Na+/K+-ATP酶可以通過調(diào)節(jié)細胞膜離子通透性來維持滲透壓的穩(wěn)定[20]，是魚體滲透壓變化的一個重要指標。趙峰等[21]研究表明，當史氏鱘在鹽度為10、20、25下進行馴化時，鰓 Na+/K+-ATP酶活力顯著高于對照組，且隨著脅迫時間的延長鰓Na+/K+-ATP酶活力呈現(xiàn)抑制—激活—適應(yīng)的趨勢，史氏鱘為了維持體內(nèi)滲透平衡主動進行滲透壓的調(diào)節(jié)。曹丹煜[18]對軍曹魚鹽度脅迫研究結(jié)果表明，低鹽度(10 g/L)組和高鹽度(35 g/L)組在48 h時鰓Na+/K+-ATP酶活力達到最大值，之后隨著脅迫時間的延長Na+/K+-ATP活力呈下降趨勢并趨于平穩(wěn)，與對照組(30 g/L)相比在各脅迫時間點均有顯著差異。在銀鯧[9]、刀鱭[12]、黃條鰤[19,23,27]、黃蓋鰈[20]等的相關(guān)研究中也指出，鹽度變化加大了魚體內(nèi)外離子濃度差，魚類可以通過提高Na+/K+-ATP酶活力來增強滲透壓調(diào)節(jié)功能。本研究中，鹽度≤6時，隨著脅迫時間的延長黃河鯉幼魚鰓絲ATP酶活力升高的趨勢，并逐漸趨于平穩(wěn)，表明了魚體通過自我調(diào)節(jié)對此鹽度表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性，與上述研究結(jié)果一致。本試驗中，當鹽度超過15時，黃河鯉的Na+/K+-ATP酶活力呈現(xiàn)先升高后迅速下降的趨勢，可能是由于鹽度超過了機體耐受性，開始時機體尚能通過提高鰓絲ATP酶活力來進行滲透調(diào)節(jié)，但隨著脅迫時間的延長鰓絲細胞組織萎縮受損嚴重，影響了鰓絲細胞正常的滲透調(diào)節(jié)機制。

4 小結(jié)

綜上所述，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，適度的提高養(yǎng)殖水體的鹽度可以提高黃河鯉幼魚肝臟中抗氧化酶和鰓絲Na+/K+-ATP酶的活力，增強機體的抗氧化性能和穩(wěn)定細胞內(nèi)外滲透壓平衡，不同的酶在被激活時的鹽度和時間上有差異，且當鹽度變化超過機體耐受性則會抑制黃河鯉幼魚的酶系統(tǒng)，可能會導(dǎo)致其免疫力下降，較易發(fā)生病害或死亡，從而影響經(jīng)濟效益。因此，在黃河鯉養(yǎng)殖過程中要控制鹽度在安全范圍內(nèi)。