張永紅， 代雪蓮， 李存濤， 張玉紅

鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州 450007

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)是一種源自表皮角質(zhì)形成細胞的皮膚腫瘤，是人類第二大常見癌癥[1]，在過去幾十年，CSCC發(fā)病率一直在不斷增加。最主要的危險因素是太陽輻射和免疫抑制[2]。雖然大多數(shù)散發(fā)性鱗狀細胞癌可以通過手術(shù)和/或放療治愈，但對于轉(zhuǎn)移性患者，長期預(yù)后非常差，疾病特異性1年生存率為44%～56%。因此，迫切需要更有效的治療策略。MicroRNAs (miRNAs)是一組內(nèi)源性的、非編碼的短RNA分子，由19～24個核苷酸組成[3]。miRNAs通過直接結(jié)合成熟mRNA在序列特異性位點的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTRs)負調(diào)控其靶基因的表達，從而導致mRNA失穩(wěn)和蛋白下調(diào)[4]。一個單獨的miRNA可能同時調(diào)控多個靶基因的表達，因此，miRNAs在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，包括細胞增殖、細胞周期進展、凋亡、代謝、轉(zhuǎn)移、血管生成、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和分化[5-6]。miRNA在各種類型的惡性腫瘤中表達異常，如宮頸癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、腎細胞癌[7]。根據(jù)其靶基因的不同，miRNAs在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中可能是抑癌基因或癌基因[8]。因此，miRNAs可能成為癌癥治療的研究靶點。miR-196-5p已被報道在幾種人類癌癥中發(fā)揮重要作用，如miR-196a-5p通過靶向Smad4調(diào)節(jié)胃癌干細胞特征[9]，miR-196a通過CRISPR/Cas9基因組編輯恢復(fù)胰腺癌細胞中Annexin A1敲除的侵襲性表型[10]。然而，miR-196-5p在CSCC中的表達水平、作用和潛在的分子機制尚不清楚。因此，本研究擬探討miR-196-5p在CSCC中的表達及臨床意義，并評價其在CSCC中的作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

從我院選取CSCC組織和癌旁正常組織標本(距病變位置約為10 cm)保存在液氮中。CSCC A431細胞和人永生化上皮HaCaT細胞均來自上海通派生物科技有限公司；DMEM(Dulbecco′s-modified Eagle′s medium)培養(yǎng)基(中國賽默飛世爾科技公司)；JAK通路抑制劑AG490(美國Selleck公司)；Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(日本Takara公司)；E-cadherin、N-cadherin和GAPDH多克隆抗體(英國Abcam)；siRNA NC、HOXA5 siRNA、miR-196-5p mimics、miR-196-5p inhibitor(GenePharma公司)。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(黑龍江東拓儀器制造有限公司)；酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(美國伯樂公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CSCC A431細胞和人永生化上皮HaCaT細胞用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中，長滿后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 顯微鏡觀察A431細胞密度為95%左右時，加入胰酶進行消化，加入DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，稀釋后的細胞鋪于12孔板，細胞密度達75%時，添加DMEM培養(yǎng)基，將Turbofect、質(zhì)粒、Opti-MEM混勻后靜置15 min，滴加于細胞中，2 h后更換為含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，48 h后收集細胞RNA和蛋白用于檢測。

1.2.3 細胞增殖測定 A431細胞密度為95%左右時，加入胰酶進行消化，將稀釋后的細胞鋪于96孔板中，細胞匯合至75%時，用Turbofect試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，常規(guī)培養(yǎng)箱孵育48 h，加入PBS清洗3次，將10 μL CCK-8工作液加入細胞內(nèi)，孵育2 h，在酶標儀讀取各孔細胞在450 nm處的吸光值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測 首先TargetScan預(yù)測miR-196-5p的潛在靶基因，構(gòu)建HOXA5 wt載體后，通過點突變試劑盒構(gòu)建HOXA5 mut載體。A431細胞密度為95%左右時，加入胰酶進行消化，并接種于12孔板，細胞密度達到70%～75%時，將HOXA5 wt、HOXA5 mut分別與miR-196-5p mimics、mimics NC質(zhì)粒通過Turbofect試劑共轉(zhuǎn)染至A431細胞，48 h后測定熒光素酶活性強度。

1.2.5 細胞侵襲實驗 用無FBS DMEM培養(yǎng)基稀釋融化的matrigel使其濃度為1 mg/mL，取稀釋后的100 μL matrigel添加于每個上室中，成膠狀后取狀態(tài)良好、密度為5×105/mL的A431細胞添加到Transwell小室中，下室添加完全DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)箱放置48 h，用PBS洗滌2次，取多聚甲醛加入其中固定20 min，再加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min，選取5個視野細胞在顯微鏡下查看細胞侵襲情況，拍照并記數(shù)。

1.2.6 RT-qPCR 取出保存的組織標本和RNA樣品，完全溶解后加入Trizol，提取組織和細胞總RNA，測定RNA濃度和純度后將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。最后以GAPDH為內(nèi)參，cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。2-△△Ct法分析結(jié)果。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.7 Western blot 提取組織和細胞中的總蛋白后，使用BCA試劑盒對蛋白進行定量。取50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，與5%脫脂奶粉配置的封閉液在室溫封閉1 h后，加特異性一抗在4 ℃過夜反應(yīng)，加入TBST清洗5次，加二抗在室溫孵育1 h，最后滴加增強型化學發(fā)光液，進行蛋白曝光和定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用GradPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析。miR-196-5p mimics組與Control組、mimics NC組，miR-196-5p inhibitor組與Control組、inhibitor NC組，pcDNA-HOXA5組與Control組、pcDNA-3.1(+)組，HOXA5 siRNA組與Control組、siRNA NC組、HOXA5 siRNA+AG490組，HOXA5 wt+mimics NC組與HOXA5 wt+miR-196-5pmimics組,HOXA5 mut+mimics NC組與HOXA5 mut+miR-196-5p mimics組等組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達miR-196-5p促進A431細胞增殖、侵襲和EMT

miR-196-5p在CSCC A431細胞中的表達水平明顯高于HaCaT細胞(2.26±1.02比1.28±0.64,t=18.58，P=0.003)，在CSCC組織的表達水平亦明顯高于癌旁正常組織(1.86±0.36比0.97±0.42，t=6.32，P=0.024)。與Control(1.13±0.72)或mimics NC組(1.18±0.09)相比，miR-196-5p mimics組的miR-196-5p表達量(2.21±0.92)明顯升高(t分別為19.25、18.75，均P<0.01)。與Control或mimics NC組相比，miR-196-5p mimics組的細胞增殖能力明顯升高(t分別為7.97、7.85，均P<0.05，圖1A)；細胞侵襲數(shù)目明顯增加(t分別為23.21、23.82，均P<0.05，圖1B)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(t分別為17.27、17.59，均P<0.05，圖1C)，E-cadherin蛋白表達量明顯下降(t分別為11.50、11.86，均P<0.05,圖1C)。

2.2 下調(diào)miR-196-5p抑制A431細胞增殖、侵襲和EMT

與Control(1.28±0.64)或inhibitor NC組(1.16±0.23)相比，miR-196-5p inhibitor組的miR-196-5p表達量(0.34±0.06)明顯降低(t分別為13.86、13.92，均P<0.01)。miR-196-5p inhibitor組的細胞增殖能力明顯低于inhibitor NC組或Control組(t分別為12.97、13.06，均P<0.01，圖2A)，細胞侵襲數(shù)目明顯減少(t分別為10.93、11.26，均P<0.01，圖2B)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(t分別為10.29、10.36，均P<0.01，圖2C)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(t分別為19.26、19.35，均P<0.01，圖2C)。

圖1 過表達miR-196-5p促進A431細胞增殖、侵襲和EMT 1A：CCK-8檢測對A431細胞增殖的影響；1B：細胞侵襲實驗檢測對A431細胞侵襲的影響；1C：Western blot檢測對A431細胞EMT的影響

圖2 下調(diào)miR-196-5p抑制A431細胞增殖、侵襲和EMT 2A：CCK-8檢測對A431細胞增殖的影響；2B：細胞侵襲實驗檢測對A431細胞侵襲的影響；2C：Western blot檢測對A431細胞EMT的影響

2.3 miR-196-5p與HOXA5的靶向和調(diào)控關(guān)系

預(yù)測miR-196-5p和HOXA5之間的結(jié)合位點見圖3。與HOXA5 wt+mimics NC組(1.15±0.32)相比，HOXA5 wt+miR-196-5p mimics組(0.54±0.07)細胞熒光素酶活性明顯降低(t=26.55，P=0.001);與HOXA5 mut+mimics NC組(1.32±0.75)相比，HOXA5 mut+miR-196-5p mimics組(1.29±0.32)細胞熒光素酶活性無明顯變化(t=4.03，P=0.057)。與mimics NC組(1.36±0.98)相比，miR-196-5p mimics組HOXA5表達量(0.56±0.05)明顯降低(t=23.33，P=0.002)；與inhibitor NC組(1.25±0.27)相比，miR-196-5p inhibitor組HOXA5表達量(2.32±0.24)明顯升高(t=16.10，P=0.004)。

2.4 過表達HOXA5抑制A431細胞增殖、侵襲和EMT

HOXA5在CSCC A431細胞中的表達水平明顯低于HaCaT細胞(0.67±0.02比1.23±0.52，t=19.72，P=0.003)，在CSCC組織的表達水平明顯低于癌旁正常組織(0.51±0.36比1.45±0.08,t=7.60，P=0.017)。與Control(1.32±0.72)或pcDNA-3.1(+)組(1.46±0.15)相比，pcDNA-HOXA5 組的HOXA5表達量(2.36±0.83)明顯升高(t分別為47.01、47.56，均P<0.01)。與Control或pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-HOXA5組的細胞增殖能力明顯降低(t分別為26.87、27.23，均P<0.01，圖4A)，細胞侵襲數(shù)目明顯減少(t分別為28.27、28.49，均P<0.01，圖4B)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(t分別為19.80、19.87，均P<0.01，圖4C)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(t分別為21.63、22.42，均P<0.01，圖4C)。

圖3 TargetScan預(yù)測miR-196-5p和HOXA5之間的結(jié)合位點Figure 3 TargetScan predicted binding sites between miR-196-5p and HOXA5.

圖4 過表達HOXA5抑制431細胞增殖、侵襲和EMT 4A：CCK-8檢測對A431細胞增殖的影響；4B：細胞侵襲實驗檢測對A431細胞侵襲的影響；4C：Western blot檢測對A431細胞EMT的影響

2.5 下調(diào)HOXA5激活JAK/STAT通路促進A431細胞增殖、侵襲和EMT

與Control或siRNA NC組相比，HOXA5 siRNA組細胞內(nèi)JAK、STAT蛋白磷酸化水平明顯升高(t分別為18.50、18.68，均P<0.01，圖5A)。與siRNA NC組相比，HOXA5 siRNA的細胞增殖能力明顯升高(t分別為28.40、28.86，均P<0.01)，細胞侵襲數(shù)目明顯增加(t分別為23.32、23.85，均P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯降低(t分別為26.14、27.03，均P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯升高(t分別為15.04、16.23，均P<0.01)；與HOXA5 siRNA組相比，HOXA5 siRNA+AG490組細胞增殖能力明顯降低(t分別為4.45、4.49，均P<0.05)，細胞侵襲數(shù)目明顯減少(t分別為10.43、10.58，均P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯升高(t分別為11.86、12.36，均P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯降低(t分別為14.04、14.76，均P<0.01)，見圖5B～5D。

圖5 下調(diào)HOXA5激活JAK/STAT通路促進A431細胞增殖、侵襲和EMT 5A：Western blot檢測對JAK/STAT通路的影響；5B：CCK-8檢測對A431細胞增殖的影響；5C：細胞侵襲檢測對A431細胞侵襲的影響；5D：Western blot檢測對A431細胞EMT的影響

3 討論

近年研究表明,在人類許多惡性腫瘤中miRNA發(fā)揮了關(guān)鍵重要。如在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中，microRNA-376a通過直接靶向特異性蛋白1抑制細胞增殖和侵襲[11]。miR-144通過靶向RUNX1可能抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移[12]。microRNA-365靶向多種癌基因，抑制侵襲性子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖、侵襲和自我更新[13]。miR-196-5p最初被鑒定為一種靶向annexin A1促進食管癌細胞增殖和防止凋亡的致癌miRNA[14]。miR-196a-5p在宮頸癌和非小細胞肺癌等惡性腫瘤組織中存在異常表達，其表達水平與這些癌癥的進展相關(guān)[15]。例如，miR-196a-5p在口腔癌組織中明顯過表達，通過NME4-JNK-TIMP1-MMP軸加速了口腔癌細胞遷移和侵襲[16]。miR-196a-5p在CRC樣本中上調(diào)，并通過增強CRC細胞的侵襲和對鉑衍生物的敏感性來發(fā)揮促癌作用[17]。與以上研究結(jié)果一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)miR-196 -5p在CSCC組織和A431細胞中表達量明顯升高，且過表達miR-196-5p促進A431細胞增殖和侵襲，而下調(diào)miR-196-5p則抑制A431細胞增殖和侵襲，這些結(jié)果證實miR-196-5p在A431細胞發(fā)展過程中發(fā)揮了明顯的致癌作用，尤其是促轉(zhuǎn)移作用。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是一個可逆過程，被認為是癌癥轉(zhuǎn)移級聯(lián)過程中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在此過程中，細胞抑制E-cadherin，表達間充質(zhì)蛋白如N-cadherin、纖連蛋白等，使細胞失去黏附，獲得遷移和侵襲能力[18]。本研究評估m(xù)iR-196-5p在A431細胞EMT過程中的作用，結(jié)果顯示，在A431細胞上調(diào)miR-196-5p表達可通過下調(diào)E-cadherin、上調(diào)N-cadherin促進EMT，而沉默miR-196-5p則可通過上調(diào)E-cadherin、下調(diào)N-cadherin表達而抑制A431細胞EMT。以上研究提示，促進EMT對miR-196-5p在A431細胞中的促轉(zhuǎn)移有重要作用。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)miR-196-5p和HOXA5具有靶向和負調(diào)控作用。包含HOXA5的HOX家族在維持人體軸向細胞生長和定位中起著重要作用，它們的異常表達可能會阻礙胚胎的正常生長并引發(fā)惡性腫瘤的發(fā)作[19]。有文獻報道，microRNA-196a通過靶向HOXA5促進非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲[20]。本研究結(jié)果與其一致，發(fā)現(xiàn)二者在A431細胞中也具有靶向關(guān)系。檢測HOXA5在CSCC組織和A431細胞中的表達量及其生物學功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOXA5在CSCC組織和A431細胞中明顯下調(diào)，過表達HOXA5抑制A431細胞增殖、侵襲和EMT，而siRNA下調(diào)HOXA5表達明顯促進A431細胞增殖、侵襲和EMT,表明HOXA5在A431細胞中發(fā)揮了明顯的抑癌作用。許多信號轉(zhuǎn)導途徑，包括PI3K/AKT、絲裂原活化蛋白激酶和Wnt,參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和EMT過程[21-22]。有文獻報道shRNA靶向沉默ZEB2表達通過Wnt/β-catenin信號通路降低肺癌細胞增殖活性[23]。本研究表明下調(diào)HOXA5激活了A431細胞內(nèi)的JAK/STAT信號通路，且通過該通路促進癌細胞的增殖、侵襲和EMT;提示miR-196-5p靶向HOXA5可能通過JAK/STAT信號通路促進A431細胞的EMT過程，從而促進CSCC的增殖和侵襲，但本研究只選擇了A431細胞進行研究，miR-196-5p及其HOXA5對其它CSCC細胞發(fā)展是否具有同樣的生物學功能尚不清楚，仍需進一步深入研究。

綜上所述，本研究表明miR-196-5p靶向HOXA5激活JAK/STAT信號通路，促進CSCC A431細胞的增殖、侵襲和EMT，為深入理解CSCC的發(fā)病機制提供了理論依據(jù)。

致謝感謝鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院胡蓉老師在實驗研究中給予的諸多幫助。