劉珂，秦玲，王娜，張艷芝，鄧會陽，馮金彪

（河南科技大學第一附屬醫(yī)院 河南科技大學臨床醫(yī)學院血液科，中國 洛陽 471003）

原發(fā)性皮膚淋巴瘤（cutaneous lymphomas,CLs）是一類異質性的淋巴增生性惡性腫瘤，皮膚是淋巴瘤最常累及的器官[1]。65%的CL 屬于成熟的T 淋巴細胞（皮膚T細胞淋巴瘤，CTCL），25%來源于成熟的B細胞（皮膚B細胞淋巴瘤，CBCL），其余部分為NK/T 皮膚淋巴瘤。當淋巴管擴散局限于皮膚而不涉及淋巴結、骨髓或臟器時，淋巴瘤主要被歸類為皮膚性淋巴瘤[2,3]。據(jù)估計，每年CTCL的發(fā)病率為0.7～0.8/10 萬，而CBCL的發(fā)病率約為0.3/10 萬。流行病學顯示，特定CL 亞型的患病率存在廣泛的多樣性。T細胞皮膚淋巴瘤主要來源于皮膚歸巢性CD4+CD45RO+T細胞，具有浸潤皮膚的潛能。CLs的發(fā)病機制復雜，其主要特征為惡性程度高，侵襲性強，預后較差等[4,5]。目前關于該類疾病的臨床診斷較為困難，尤其在早期階段，而臨床治療方式多為全身性化放療,對提高患者總體緩解率和生產(chǎn)率十分有限。因此，基于皮膚淋巴瘤的分子靶向研究還具有廣闊的空間和不可忽視的臨床意義。

microRNAs（miRNA）是一類小非編碼RNA，可在轉錄后水平行負調控靶基因，發(fā)揮著重要的生物學作用，如調節(jié)細胞的生長與增殖、細胞凋亡以及造血等功能[6]。由于miRNA 分子量較小，鏈較短，可在石蠟包埋組織中保存完好。因此檢測特異性的miRNA表達豐度，對疾病的診斷、治療以及預后具有巨大的潛能[7,8]。目前miRNA的功能及機制研究集中在B 淋巴細胞瘤，而對T 或NK細胞瘤中的研究較少[9]。NK細胞占淋巴細胞總數(shù)的10～15%左右，NK細胞異?；罨瘏⑴cCLs的發(fā)生發(fā)展，占非霍奇金淋巴瘤（NHLs）的10.5%。相關研究表明miRNAs在調控NK 淋巴瘤細胞增殖、凋亡和化療敏感性中至關重要。

miR-224 是近年來研究較多，在大多數(shù)腫瘤中普遍失調的miRNA 之一，影響重要的細胞生物功能，具有臨床診療和預后評估的臨床價值[10]。大量的研究提示異常表達的miR-224 參與調節(jié)多種腫瘤的病理進程，如肝細胞癌，胰腺導管癌，卵巢癌，乳腺癌，腎癌，結腸癌，結腸癌和前列腺癌等[11,12]。miR-224與腫瘤的侵襲與轉移密切相關，過表達的miR-224通過調控下游增殖、侵襲和遷移及抗凋亡相關的靶基因，包括CDC42、CDH1、PAK2、BCL-2和MAPK1[13]。而在NK/T細胞淋巴瘤中，miRNA-224對細胞生物學行為的影響仍不清楚，因此明確miRNA-224的表達及生物調節(jié)功能對患者評估和靶向治療提供科學依據(jù)。

本研究中，我們以miR-224 可能是參與調控NK 淋巴瘤細胞增殖和凋亡的關鍵分子為切入點，分析miR-224在促進NK/T細胞皮膚淋巴瘤發(fā)生發(fā)展的潛能是否具有相關性。通過組織qRT-PCR和體外細胞實驗方法證實miR-224表達與皮膚淋巴瘤增殖及抗凋亡的關系；基于文獻調研，進一步對篩選的靶基因進行驗證，采用細胞體外轉染實驗結合生長曲線及凋亡流式細胞術等技術方法，確認MERK 信號通路是miR-224 下游調控的靶基因，是miR-224 參與調控淋巴細胞瘤增殖及抗凋亡的關鍵通路，明確miR-224 明確在皮膚淋巴瘤進展過程中的作用，旨在為皮膚淋巴瘤的診斷、預測和治療靶點提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Hyclone 公司。胰蛋白酶-EDTA 消化液購自Solarbio 公司。青霉素及鏈霉素購自美國Invitrogen 公司。BCA蛋白濃度試劑盒和Trizol 試劑購自美國Thermo scientific 公司;所有引物、miR-224 mimic和inhibitor及其陰性對照均由上海吉瑪制藥技術公司提供。CCK-8 試劑盒購自東仁化學科技有限公司。Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自R&D Systems 公司。MERK、p-MERK和GAPDH 抗體購自Abcan 公司。增強型化學發(fā)光（ECL）試劑盒（sc-2048）和PVDF 膜購自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 細胞系及臨床樣本 人正常NK細胞株ZYH168和人NK/T細胞株淋巴瘤細胞SNK6 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。SNK6及ZY-H168細胞使用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。收集本院皮膚科收治的38例NK T細胞皮膚淋巴瘤患者的淋巴瘤及其癌旁組織。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 取處于生長對數(shù)期的SNK6，在RPMI-1640 完全培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。設計miRNA-224 mimic和inhibitor 進行脂質體轉染實驗，具體操作如下：轉染前一天，將細胞分別接種到6 孔板中，接種密度每孔5×105個，當細胞密度達到60%～70%時，參考Lipo2000 說明書步驟，準備A、B 液，A 液：125μl Opti-MEM+5μl Lipo2000；B 液：125μl Opti-MEM+500 pmol miRNA-224 mimics/inhibitors 或其陰性對照，將A 液和B 液混勻，室溫靜止15min 后轉入6 孔板中，6h 后根據(jù)細胞狀態(tài)換成完全培養(yǎng)基。48h 后收集細胞，提取細胞總RNA，進行實時熒光定量PCR，檢測轉染效果。

2.2 細胞總RNA 提取及qRT-PCR 實驗 將所有待測組織細胞樣本收集至無酶EP 管中，加入適量TRizol 試劑（Invitrogen 公司）裂解,室溫放置5min，加入200μl 氯仿,上下震蕩15s 后,室溫放置5min。12000rpm，4℃離心5min。將上層水相轉移另一新EP 管，加入等量的氯仿混合后12000rpm 離心5 min。轉移上層液體并加入等量預冷的異丙醇，-20℃放置30min 后離心，95%乙醇進行RNA 沉淀后，再使用75%乙醇清洗，加入適量DEPC水，充分溶解后-80℃?zhèn)溆谩?/p>

用紫外分光光度計測定總的RNA 濃度，取A260/280 值在1.8～2.0 之間的樣本。根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書，取1μg的總RNA 進行逆轉錄得到cDNA。配制qRT-PCR 反應體系為20μl，反應條件為95℃預變性30s，95℃預變性5s，60℃預變性30 s，共40 個循環(huán)。以U6 作為對照。引物序列如下，miR-224 上游引物:5'-GAGCCCAAGTCACTAGT GGT-3'；miR-224 下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 上游引物:5'-CTCGCTTCGGCAGC ACA-3',U6 下游引物:5'-CGCTTCAGAATTTGCG TGTCAT-3'。各個樣品做3 個復孔，對所提總RNA樣本行miRNA-224 擴增，以U6 為內參，統(tǒng)計分析miRNA-224的相對表達量。

2.3 細胞增殖實驗 使用CCK-8 試劑盒檢測細胞生長曲線。具體步驟如下：將SNK6細胞接種于96孔板，調整細胞密度2000 個/孔，每組設3 個復孔。分別轉染miRNA-224 mimic和inhibitor及其陰性對照，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，48h和72h。加入10μl的CCK-8 繼續(xù)培養(yǎng)2h 后，使用酶標儀檢測在450nm 下的吸光度，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2.4 細胞凋亡實驗 取處于對數(shù)生長期的SNK6細胞，按2105 個細胞接種到6 孔板中，每組設置3個復孔。將培養(yǎng)過夜后，換成無血清培養(yǎng)液饑餓后進行轉染實驗，參照上述步驟。孵育48h 后，然后用不含EDTA的胰酶收集細胞，再用PBS 充分洗滌細胞兩次。使用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。分別在各組細胞中加入500μl的Annexin V，制成細胞懸液，然后加入5μl Annexin V-FITC 混勻，再加入5μl的Propidium Iodide 充分混合均勻,避光條件下于室溫孵育10 min 后，用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

2.5 Western blot 實驗 將SNK6 接種于六孔培養(yǎng)板內，待細胞融合度達到80～90%時進行細胞轉染實驗，處理同上。轉染48h 后，撤去血清，恒溫箱培養(yǎng)2h 后提取細胞總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒的操作說明書，采用標準蛋白BSA 做標曲，每組待測樣品檢測三次，通過紫外分光光度計檢測562 nm 處的吸光值，根據(jù)標曲計算各組樣品的蛋白濃度，調整后進行Western blot 檢測MERK、p-MERK和GAPDH 內參蛋白，使用發(fā)光底物顯影，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，使用Image J 軟件對各個目的條帶進行灰度分析，統(tǒng)計目標蛋白的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學分析 所有細胞實驗，每組至少設3 個平行樣，每個實驗重復3 次，從而保證數(shù)據(jù)的可信性。采用GraphPad Prism8.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)通過平均值± 標準差（mean ± SD）的形式加以展示。組間顯著性差異通過單因素方差分析進行檢驗。兩組間比較采用配對t 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 miR-224在皮膚淋巴瘤及NK 淋巴瘤細胞中高表達對皮膚淋巴瘤組織及細胞株進行實時熒光定量PCR 檢測，結果顯示：癌旁組織相比與皮膚淋巴瘤部位miR-224 比較，差異有顯著性意義（P＜0.05）；與正常NK細胞株ZY-H168 相比，NK 淋巴瘤細胞株SNK6 中miR-224 高表達（相對表達倍數(shù)比為1：1.859，P＜0.05)。見圖1。

圖1 qRT-PCR 檢測miRNA-224在皮膚淋巴瘤及NK 淋巴瘤細胞中的相對表達量。*P<0.05。

3.2 miR-224對NK 淋巴瘤細胞增殖的影響在NKTL細胞株SNK6 中，miR-224 mimic及inhibitor轉染48h 后，通過實時定量PCR 檢測所有相關實驗樣本中miR-224 變化。結果顯示，相對于陰性對照組，miR-224 mimic 轉染后miR-224水平升高，而在miR-224 inhibitor 轉染組，miR-224 呈現(xiàn)低表達。提示miR-224 mimic和inhibitor 均成功轉染，可以進行后續(xù)實驗。見圖2。

圖2 qRT-PCR 檢測miRNA-224 mimic和inhibitor 轉染后相對表達量。**P<0.01。

為了闡明miR-224表達在皮膚淋巴瘤中的生物學機制，我們研究miR-224 上調或下調后會影響NK 淋巴瘤細胞的增殖和抗凋亡能力。miR-224 mimic、inhibitor及相關陰性對照物轉染SNK6細胞后，采用CCK-8 法分別檢測各組在24、48及72h的生長曲線。結果顯示：與陰性對照相比，在SNK6細胞中，miR-224 mimic 增強了細胞增殖，而miR-224 inhibitor 則抑制了細胞增殖。這些結果表明，在轉染48及72h，miR-224 正調控細胞生長增殖，與陰性對照組比較，具有統(tǒng)計學意義；而miR-224 inhibitor 組在轉染48和72h 后，細胞增殖能力減弱，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 miRNA-224 mimic、inhibitor對SNK6細胞生長曲線的影響

3.3 miRNA-224對NK 淋巴瘤細胞凋亡的影響通過細胞轉染實驗，將miR-224 mimic 轉入SNK6細胞48 小時后，miR-224 模擬物轉染組的細胞凋亡率(9.29±1.71）%，較陰性mimic對照組（18.27±2.01）%低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示miR-224 過表達可抑制SNK6細胞的凋亡。見表1。

表1 miR-224 模擬物和抑制劑對SNK6細胞凋亡的影響

miR-224 inhibitor 轉染SNK6細胞后的48 小時，miR-224 抑制物 組細胞的凋亡 率（9.29±1.71）%，較陰性inhibitor對照組（18.27±2.01）%低，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。提示抑制miR-224的表達可促進SNK6細胞的凋亡。

3.3 miR-224 調控NK 淋巴瘤細胞的機制研究 近年來有關miR-224在腫瘤中的研究較多,對腫瘤發(fā)生的調節(jié)機制及作用靶點的探究中,有研究表明miR-224的靶基因主要是主要涉及參與腫瘤增殖、遷移、侵襲及凋亡，如CDC42、CDH1、PAK2、BCL-2及API-5 凋亡蛋白抑制因子5 等。有研究表明，MERK1 作為miR-224 下游靶基因參與增強多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力并且能夠抵抗凋亡。因此我們進一步分析了外源性miR-224 是否影響NK 淋巴瘤細胞中MERK 信號通路。我們對轉染了miR-224 模擬物和抑制物的SNK6細胞中的MERK1 含量及活性進行分析。見圖4，Western blot 檢測結果顯示，與對照組相比，在miR-224模擬組中總MERK1的蛋白水平無顯著變化，而p-MERK1 顯著上調。此外，miR-224 抑制劑組下調p-MERK1蛋白表達，與抑制物對照組相比具有統(tǒng)計學意義。這表明miR-224 可能通過誘導MERK 信號通路促進皮膚淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。

圖4 Western blot 檢測miR-224 mimic及inhibitor處理SNK6 后，細胞內p-MERK、MERK、的表達情況。

我們進一步對各蛋白條帶用軟件進行灰度相對分析，結果可見圖5。與對照組相比，miR-224 mimic 作用2 小時后可顯著上調胞內p-MERK-1蛋白的表達水平（1.829±0.383 vs.1.000±0.261）,具有顯著性差異（**P<0.01）。與對照組相比，miR-224 inhibitor 作用2 小時后可顯著上調胞內p-MERK-1蛋白的表達水平（0.526±0.210 vs.1.000±0.324），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

圖5 Western blot 灰度半定量分析miR-224 mimic及inhibitor對SNK6細胞的p-MERK1/t-MERK1與內參蛋白的灰度值比。**P<0.01。

4 討論

miR-224在體外具有促進腫瘤增殖、侵襲遷移的作用，并與化療反應相關。先前的報道顯示，miR-224在絕大多數(shù)腫瘤中表達增高，可以促進細胞演進、增殖、分化，是腫瘤細胞增殖的正調節(jié)因子[13]。在本研究中，我們的體內外實驗結果均表明，miR-224 可促進NK 淋巴瘤細胞的增殖、抑制凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)可通過促進MERK 活性來增強細胞增殖和抗凋亡能力。miR-224 可作為NKTL皮膚淋巴瘤的腫瘤促進因子，因此皮膚淋巴瘤的診斷可以通過miR-224 進行預測。NFkB通路被認為是多種腫瘤重要的耐藥機制，有絲分裂原活化蛋白激酶MAPKs 是一系列的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，它們在細胞增殖、分化、遷移、凋亡和炎癥反應等多種細胞過程中發(fā)揮關鍵功能。MAPK 級聯(lián)的激活需要四個序列元件，包括小GTPases（Ras和Rac 原癌基因）、MAPK 激酶激酶（Raf 或MEKK）、MAPK 激酶（MEK）和MAPKs。在哺乳動物中，MAPKs 家族主要包括c-Jun NH2 末端激酶JNK、p38 MAPK和胞外信號調節(jié)激酶ERK，每種MAPK具有不同的細胞定位、亞型和功能。在皮膚淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中，MAPKs通路能夠被許多不同的細胞外刺激激活，如細胞因子、生長因子、神經(jīng)體液介質和機械應激[14]。異?；罨腗ERK 信號通路的抑制是皮膚淋巴瘤臨床診療的重要靶點。

相關研究表明，MAPKs 信號通路在NK 淋巴細胞異?；罨衅鹬匾饔?。有報道稱MAPK通路受到miR-224的直接調控，其作用是促進腫瘤細胞增殖、侵襲，提高腫瘤細胞抗凋亡能力。這與我們的研究一致，miR-224在皮膚淋巴瘤組織中呈現(xiàn)低水平，且預后不良；進一步的體外實驗表明，相較于人正常NK細胞系，miR-224在淋巴瘤細胞株SNK6 中呈現(xiàn)高水平。上調miR-224在SNK6細胞中的含量可促進細胞生長，而下調miR-224 將抑制SNK6的增殖。miR-224表達上調可激活MERKs 信號通路，這可能是決定皮膚淋巴瘤生物學行為的關鍵事件[15]。目前，關于miR-224在皮膚淋巴瘤中的作用研究有限，在miR-224 介導MERKs 信號對皮膚淋巴瘤的影響尚不清楚。

皮膚NK/T細胞淋巴瘤可分為原發(fā)性和繼發(fā)性,具有高度的侵襲性,通常預后較差。據(jù)報道,MERK-1的磷酸化是miRNAs 一種重要的轉錄因子與腫瘤形成有關。然而p-MERK-1 介導的皮膚淋巴瘤發(fā)生仍然知之甚少。在目前的研究中,miRNAs 是根據(jù)先前報道的NKTL 生物學相關性篩選的。在一項比較YT細胞和正常NK細胞的研究中,miR-9和miR-189 被選為NKTL 中預期高表達和低表達的代表性miRNAs[16]。miR-146a和miR-155與外周血細胞中的LMP1/NF-kB 關系密切。此外，miR-106a 參與T細胞淋巴瘤和白血病的研究。這些發(fā)現(xiàn)表明，在NK/T細胞皮膚淋巴瘤中，某些miRNAs 可作為有效的抑癌或促癌因素[17,18]。在本文的研究中，我們發(fā)現(xiàn)AB23A 能夠顯著下調活化成纖維細胞內的MAPK和ERK 磷酸化，進一步發(fā)現(xiàn)核轉錄因子CREB的DNA 結合活性受到抑制，提示AB23A通過調控MER/ERK1/2/CREB 活化的信號通路減弱纖維化程度。

綜上所述，miR-224在NK/T細胞皮膚淋巴瘤及NK 淋巴瘤細胞株SNK6 中高表達。體外研究顯示，miR-224 高表達促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。深入研究miR-224 促進NK 淋巴瘤細胞增殖活化及抗凋亡的作用機制，結果提示miR-224 介導的MAPK 活性得到有效增加。miR-224 能夠調控磷酸化MAPK的表達，進而促進NK 淋巴瘤細胞的增殖和抗凋亡活性，為抵抗NK/T細胞皮膚淋巴瘤治療提供新的手段和思路。