唐翼龍，易志強(qiáng)，劉麗萍，張娜，靳廷麗，丁晨，胡強(qiáng)

（江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029）

在目前的艾滋病防制工作中，Western Blot 法（免疫印跡檢測(cè)法）已成為一種廣泛應(yīng)用的、用于診斷HIV 病毒感染狀態(tài)的方法。其檢測(cè)程序?yàn)椋嚎贵w初篩、抗體復(fù)檢、免疫印跡檢測(cè)[1]。其中，篩查抗體的方法有酶聯(lián)免疫法，化學(xué)發(fā)光法等；抗體確證的方法有普通免疫印跡法（WB）、條帶/線性免疫印跡法(RIBA/LIBA)。這些經(jīng)典的HIV 抗體檢測(cè)方法為我國(guó)的艾滋病防制做出了重要貢獻(xiàn)，但檢測(cè)抗體的方法有其局限性[2]：對(duì)于早期HIV 感染病例，因?yàn)榭贵w還沒(méi)有產(chǎn)生，使用此類方法去篩查血液樣本，有漏檢的風(fēng)險(xiǎn)[3]；在艾滋病病程晚期,因病人的免疫系統(tǒng)崩潰，抗體產(chǎn)量不夠或者抗體親和力不佳[4,5]，使用Western Blot 法檢測(cè)病人的樣本，會(huì)得出“HIV 抗體不確定”的結(jié)果，且隨訪觀察病人血清也不再陽(yáng)轉(zhuǎn)，這會(huì)貽誤病人的抗病毒治療；另外，對(duì)于孕產(chǎn)婦，常有干擾抗體導(dǎo)致Western Blot法檢測(cè)不確定的情況，這種情況下，做不做母嬰阻斷成了難題。本項(xiàng)目研究Pooling PCR 法的比較優(yōu)勢(shì)，以及在醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的臨床應(yīng)用中在特定條件下常規(guī)替代Western Blot 法的可行性，現(xiàn)將研究情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象與材料在南昌市轄區(qū)內(nèi)選定某省級(jí)綜合性醫(yī)療機(jī)構(gòu)，自2015年1 月至2018年12 月，在病人HIV 抗體篩查有反應(yīng)時(shí)，立即采集血漿樣本（全血樣本經(jīng)EDTA 抗凝劑處理）送檢。

1.2 儀器與試劑 羅氏公司的cobas AmpliPrep/TaqMan 全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng),及配套的試劑cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test,v2.0；MP公司的蛋白免疫印跡儀，及配套的HIV BLOT 2.0試劑。

1.3 方法 該醫(yī)療機(jī)構(gòu)將復(fù)檢有反應(yīng)的、能采集到血漿的樣本（剔除已報(bào)告病例和未采集到血漿的病例）按檢測(cè)流程全部送達(dá)江西省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行免疫印跡法(Western Blot，過(guò)夜孵育）檢測(cè)艾滋病病毒抗體，同時(shí)檢測(cè)病毒載量，并觀察低載量樣本稀釋后的核酸檢測(cè)情況。

2 結(jié)果

2.1 送檢樣本的免疫印跡檢測(cè)及載量檢測(cè)總體情況 2015年1 月-2018年12 月，剔除已報(bào)告病例和未采集到血漿的病例后，該醫(yī)療機(jī)構(gòu)有165 份樣本經(jīng)抗體法（免疫印跡）確證陽(yáng)性。這165 個(gè)病例的病毒載量檢測(cè)值中，最低值為3330copies/ml，最高值為15800000 copies/ml,中位數(shù)為151000 copies/ml，幾何均數(shù)為159969 copies/ml，見(jiàn)表1。

表1 165例HIV 感染者抗病毒治療前的樣本的病毒載量值分布情況

2.2 載量值較低的樣本稀釋后的檢測(cè)情況 從165例樣本中選取6 份載量值較低的樣本經(jīng)50 倍、100 倍稀釋后做病毒載量檢測(cè)，均能檢測(cè)出核酸陽(yáng)性，見(jiàn)表2。

表2 低病毒載量值樣本經(jīng)稀釋處理后的核酸檢測(cè)情況

2.3 Pooling PCR 法與Western Blot 法的檢測(cè)效能比較 HIV 抗體陽(yáng)性的樣本，其核酸檢測(cè)結(jié)果全部陽(yáng)性；在高危人群中，能觀察到抗體陰性但核酸陽(yáng)性即感染早期病例的存在[6]；在艾滋病晚期病例中,常有HIV 抗體不確定但高病毒載量病例的情況。見(jiàn)表3。

2.4 Pooling PCR 法的特異性問(wèn)題 Pooling PCR 法本質(zhì)上就是一個(gè)檢測(cè)核酸的方法，只是涉及的樣本的集合（混合）和分拆；先檢測(cè)混合樣本，混合樣本中發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣本后再逐級(jí)分拆定位，最終識(shí)別出感染HIV 病毒的病例。在《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（2015 版》中，已介紹了Pooling PCR 法在血液篩查及高危人群中的應(yīng)用；在《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷（WS 293-2019)》的6.1.1 章節(jié)的“d”子項(xiàng)中已列明“有流行病學(xué)史或艾滋病相關(guān)臨床表現(xiàn)，兩次HIV 核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性”即可做出HIV 感染診斷。以上可見(jiàn)，Pooling PCR 法的特異性方面已不是問(wèn)題。

2.5 Pooling PCR 法與Western Blot 法的檢測(cè)成本比較 如果某地區(qū)艾滋病病毒感染率為萬(wàn)分之十，某醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測(cè)10000 份血樣,以識(shí)別出其中全部HIV 感染者為最終目的，使用Western Blot 法的理論最大試劑總成本為56800 元，投下去5680 元可以識(shí)別出一個(gè)HIV 感染者；如使用Pooling PCR 法配套國(guó)產(chǎn)試劑檢測(cè),用100 份樣本組成一個(gè)集合樣本，集合樣本中檢出核酸陽(yáng)性后再逐級(jí)拆分，最終識(shí)別出HIV 核酸陽(yáng)性的病人血樣，其最大核酸試劑總成本為51000 元，投下去5100 元可以識(shí)別出一個(gè)感染者[8],見(jiàn)表4。

3 討論

本研究165 個(gè)已感染HIV 但尚未開(kāi)始抗病毒治療的病例中，載量最低值為3330copies/ml，最高值為15800000copies/ml。低于5000copies/ml 者有4例，占比為2.42%，按照現(xiàn)行HIV 感染者核酸法5000copies/ml 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，這部分低病毒載量病例有漏診的風(fēng)險(xiǎn)。其實(shí)現(xiàn)今的核酸檢測(cè)多為閉蓋式的，實(shí)驗(yàn)室PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)得到控制，是否可以下調(diào)HIV 感染核酸診斷的載量閾值，后續(xù)可以做擴(kuò)大樣本的研究。6例低病毒載量樣本經(jīng)100 倍稀釋后仍然能夠被檢出，所以，一級(jí)集合大小設(shè)定為100 份樣本技術(shù)上是可行的。本研究表明，在一級(jí)集合大小為100 份樣本且人群HIV流行率不高于10‰0的情況下，以發(fā)現(xiàn)1 個(gè)HIV 感染者所需耗費(fèi)的平均試劑成本計(jì)算，Pooling PCR法的成本略低于Western Blot 法。相對(duì)于酶聯(lián)法、化學(xué)發(fā)光法、免疫印跡法等檢測(cè)抗體的方法而言，檢測(cè)核酸的方法是更敏感的，它的窗口期僅為1周[7]，能發(fā)現(xiàn)早期HIV 感染者。自2015年開(kāi)始，Pooling PCR 法已在獻(xiàn)血員的篩查中得到了全國(guó)性廣泛應(yīng)用[9,10],發(fā)現(xiàn)了不少抗體窗口期病例，為降低輸血的殘余風(fēng)險(xiǎn)做出了很大貢獻(xiàn)。Pooling PCR 法的優(yōu)勢(shì)也在于：它能發(fā)現(xiàn)和確診晚期HIV 感染者，有利于艾滋病人盡早獲得治療。這種方法尤其適用于孕產(chǎn)婦樣本的檢測(cè)。對(duì)于孕產(chǎn)婦群體，常有干擾抗體導(dǎo)致免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果為不確定的情況，這增加了孕產(chǎn)婦的心理負(fù)擔(dān)。如果對(duì)所有HIV 抗體不確定的孕婦立即進(jìn)行母嬰阻斷,可能會(huì)導(dǎo)致很多的孕婦接受不必要的抗HIV 病毒治療，對(duì)孕婦、胎兒產(chǎn)生一些不必要的毒副作用。本研究表明，使用Pooling PCR 法以100 份樣本做一個(gè)一級(jí)混合樣，其臨床應(yīng)用時(shí)的診斷敏感性并不會(huì)低于檢測(cè)抗體的方法。另外，在當(dāng)?shù)厝巳旱母腥韭蕿?0‰0以下時(shí)，以發(fā)現(xiàn)HIV 感染者數(shù)計(jì)算的人均試劑成本略低于Western Blot 法的成本。所以,使用Pooling PCR 法替代Western Blot 法，用于艾滋病病毒感染的診斷，在經(jīng)濟(jì)上是可行的，在實(shí)際工作中是必要的。綜上可見(jiàn)，在人群的HIV 感染率為10‰0以下時(shí)，在規(guī)模較大的醫(yī)療衛(wèi)生單位、獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室、專業(yè)體檢公司，Pooling PCR 法可以替代Western Blot 法，其特別有利于艾滋病病毒感染早期、晚期病例的診斷以及排除抗體不確定孕產(chǎn)婦的HIV 感染。