吳菲，葉鵬，杜宏

（1.南陽市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 南陽 473000；2.南陽市中心醫(yī)院乳腺外科，河南 南陽 473000；3.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210000）

隨著對(duì)糖尿?。―M）研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者體內(nèi)的甲狀腺激素（TH）的分泌也存在異常情況，其中以游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）水平下降最為常見[1]。研究[2,3]認(rèn)為甲狀腺激素水平低下，尤其是FT3 下降與糖尿病腎?。―KD）的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，DM患者的甲狀腺激素異常越來越受到人們的關(guān)注。

高血糖是糖尿病患者的主要臨床特征。HbA1c的代謝周期長于甲狀腺激素的代謝周期，因此可較好地反映一段時(shí)間內(nèi)血糖對(duì)甲狀腺激素水平的影響。既往研究指出，持續(xù)高血糖即血糖控制不佳的T2DM患者T3水平下降,待血糖控制良好后，T3逐漸上升[4]。盡管HbA1c與DM 并發(fā)癥具有密切的關(guān)系,但它只能解釋部分糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)變化,以HbAlc 作為血糖控制唯一指標(biāo)并不能有效減少糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[5]。目前已有越來越多的研究[6]表明血糖波動(dòng)可能為獨(dú)立于HbAlc的糖尿病慢性并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素。血糖波動(dòng)性又稱血糖變異性，是指血糖水平在其波峰和低谷之間變化的不穩(wěn)定狀態(tài)[7]。岳欣等[8]在臨床中發(fā)現(xiàn)初診T2DM患者存在T3、FT3水平下降，rT3水平上升，且與血糖波動(dòng)情況有關(guān)。說明DM患者的甲狀腺激素異常不僅與高血糖有關(guān)，與血糖波動(dòng)也有著密不可分的關(guān)系。

因此，文章旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析持續(xù)高血糖及血糖波動(dòng)與甲狀腺激素的關(guān)系及其機(jī)制，從而來填補(bǔ)有關(guān)這一方面研究的空缺。

2 材料與方法

2.1 材料 清潔級(jí)6～8 周齡C57 雄性小鼠34 只，體重20～24g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，采用SPF 級(jí)屏障系統(tǒng)小鼠實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，許可證號(hào)為SCXK（蘇）2016-0010。小鼠飼養(yǎng)籠中給予充足的水和飼料，自由進(jìn)食。小鼠常規(guī)飼料由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，普通胰島素注射液由美國禮來公司提供。鏈脲佐菌素（STZ）購于美 國sigma公司。FT3、FT4、TSH 試劑盒及小鼠HbA1c、ID1 ELISA 試劑盒均購于廈門慧嘉生物有限公司。0.1mol/l 檸檬酸鈉緩沖液配制：將2.10g 檸檬酸加入雙蒸水100ml 配成檸檬酸母液，稱為A液；將2.94g 檸檬酸二鈉加入雙蒸水100ml 配成檸檬酸鈉母液，稱為B 液；將A 液和B 液按1:1的比例混合，然后稀釋為100ml。STZ 溶液配制：將STZ溶于0.1mol/l的檸檬酸鈉緩沖液中，新鮮配制成濃度為10mg/ml的溶液。避光配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 方法

2.2.1 動(dòng)物分組與建模 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后隨機(jī)分為模型組22 只，對(duì)照組（C 組）12 只。糖尿病小鼠模型：模型組小鼠禁食不禁水12h 后（晚上9 點(diǎn)禁食，早上9 點(diǎn)注射STZ），尾靜脈測(cè)空腹血糖，稱體重，然后按50mg/kg/d 腹腔注射STZ，再繼續(xù)禁食2 小時(shí)，連續(xù)注射五天。對(duì)照組給予同等量的檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。一周后模型組小鼠隨機(jī)血糖均超過16.7mmol/l，DM 模型造模成功。血糖波動(dòng)小鼠模型：將模型組小鼠分為持續(xù)高血糖組（D 組）10 只及血糖波動(dòng)組（DF 組）12 只，血糖波動(dòng)組小鼠每日09：00 腹腔注射葡萄糖注射液2g/kg，注射葡萄糖0.5h 后，血糖達(dá)到峰值，此時(shí)注射胰島素0.5u-1u，血糖在1.5h 內(nèi)降至最低值，14：00時(shí)血糖恢復(fù)到注射葡萄糖前其血糖水平，一天內(nèi)形成一次高峰與低谷。造模期間隨機(jī)監(jiān)測(cè)小鼠的血糖，血糖較低或偏高時(shí)立即給予適量的葡萄糖或胰島素。D 組和C 組則給予腹腔注射等體積的生理鹽水。在造模六周后尾靜脈采血測(cè)全天（8:00、8:30、10:00、14:00、14:30、16:00、20:00）血 糖，分 別計(jì)算三組小鼠血糖水平標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及平均血糖波動(dòng)幅度（MAGE）。

2.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 六周末監(jiān)測(cè)全天血糖后禁食12h,于次日處死小鼠，處死前尾靜脈檢測(cè)空腹血糖及稱量體重，內(nèi)眥取血后離心得血清，使用小鼠FT3、FT4、TSH 試劑盒檢測(cè)甲狀腺激素水平，小鼠HbA1c 試劑盒檢測(cè)其糖化血紅蛋白，麻醉后取肝臟組織，勻漿后取上清，小鼠ID1 試劑盒檢測(cè)肝臟組織的ID1 活性。

2.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS23.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間較采用單因素Anova 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三組小鼠的一般特征 D 組與DF 組小鼠精神狀態(tài)差，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，失去光澤，脫發(fā)和煩渴，多尿和多食的癥狀均較明顯。三組間小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

3.2 三組小鼠血糖水平和血糖波動(dòng)參數(shù)的比較六周造模期間，每周末監(jiān)測(cè)三組小鼠全天血糖，并分別計(jì)算平均值，可以看出，DF 組小鼠的血糖在8:30 時(shí)升至最高水平，在10:00 降至最低水平，14:00血糖恢復(fù)至初始水平，血糖在1 天內(nèi)形成了明顯的高峰和低谷。與DF 組相比，D和C 組小鼠的血糖變化趨勢(shì)則相對(duì)平穩(wěn)，見圖1。

圖1 三組小鼠血糖波動(dòng)情況

同時(shí)，與C 組相比，D 組小鼠的HbA1c水平明顯升高，而DF 組的HbA1c與C 組相比無顯著性差異。DF 組和D 組小鼠血糖標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和平均血糖波動(dòng)幅度（MAGE）均明顯高于C 組，DF 組與D組相比，SD和MAGE水平也明顯升高，見表1。

表1 三組小鼠一般特征的比較

3.3 三組小鼠甲狀腺激素水平的比較 D和DF 組小鼠與C 組相比，F(xiàn)T3水平均明顯降低，各組間FT4和TSH水平無顯著差異；D 組與DF 組相比，各項(xiàng)甲狀腺激素指標(biāo)均無明顯變化，見表2。

表2 三組小鼠甲狀腺激素水平的比較

3.4 三組小鼠肝臟ID1水平的比較 DF 組和D 組小鼠ID1 均低于C 組（P＜0.01）；D 組、DF 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 三組小鼠肝臟ID1水平的比較

4 討論

目前關(guān)于糖尿病小鼠造模有多種方法,在此研究中,我們通過給小鼠腹腔注射STZ 成功地導(dǎo)致了糖尿病狀態(tài)[9]，即模型組出現(xiàn)了明顯的多飲、多食、多尿癥狀，活動(dòng)減弱，一般狀態(tài)較差。就血糖控制而言，D 組的HbA1c 最高，而DF 組與C 組沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這是因?yàn)樵谥谱餮遣▌?dòng)模型的過程中給DF 組小鼠注射了胰島素，因此，DF 組小鼠的糖化血紅蛋白水平控制在正常范圍內(nèi),但血糖波動(dòng)水平明顯高于C 組。體內(nèi)血糖值在高峰與低谷之間波動(dòng)的不穩(wěn)定狀態(tài)即為血糖波動(dòng),血糖波動(dòng)幅度的增大可加重糖代謝的障礙[10]。目前評(píng)估血糖波動(dòng)的指標(biāo)很多，包括MAGE、平均血糖（MBG）、SD 等，其中常用的指標(biāo)是SD、MAGE，均是評(píng)估血糖穩(wěn)定性的簡易參數(shù)。本研究通過監(jiān)測(cè)小鼠的全天血糖并使用Service[11]提出的方法計(jì)算得出MA GE、SD，發(fā)現(xiàn)三組小鼠的血糖波動(dòng)幅度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中以DF 組小鼠的血糖波動(dòng)最為明顯，說明通過錯(cuò)時(shí)給予葡萄糖及胰島素的方法可以成功地建立血糖波動(dòng)小鼠模型。

流行病學(xué)資料顯示，DM患者甲狀腺功能異常的發(fā)生率是非DM患者的2～3 倍[12],并且大多數(shù)D M患者的甲狀腺激素水平主要表現(xiàn)為FT3水平降低[13]。與既往研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠具有明顯的低FT3 血癥，提示糖尿病狀態(tài)可導(dǎo)致小鼠甲狀腺激素異常，但對(duì)其機(jī)制目前說法不一。糖尿病已經(jīng)被認(rèn)為是一種炎癥性疾病，隨著患者體內(nèi)的白介素-1 (IL-1)、IL-6 等細(xì)胞因子的增多，影響了T3 等合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放過程[14]。另外，也有人提出碘泵功能的障礙也可以導(dǎo)致甲狀腺功能紊亂。由此可見，糖尿病中甲狀腺激素的異?？赡苁嵌喾N因素綜合的結(jié)果。本文從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了糖尿病的甲狀腺激素異常的機(jī)制與肝臟脫碘酶的活性受到了抑制有關(guān)，并將其歸因于糖尿病的糖代謝紊亂[15]。根據(jù)其催化機(jī)制，反應(yīng)和抑制動(dòng)力學(xué)及底物特異性不同，脫碘酶可以分為三種類型，即脫碘酶1,2,3型(ID1,ID2和ID3)[16]。其中，脫碘酶1（ID1）控制FT4 向FT3的轉(zhuǎn)化，從而提供血漿中大部分循環(huán)的FT3[17]。ID1 存在于許多組織中，包括肝臟，腎臟和甲狀腺，研究報(bào)道，肝臟中ID1 活性比其他組織大約高3 倍[18]。本研究發(fā)現(xiàn)D 組小鼠的肝臟ID1 活性較C 組明顯降低，而大部分T3 是來源于外周組織如肝臟的ID1對(duì)T4的脫碘轉(zhuǎn)化而來的[19]，因此進(jìn)一步證實(shí)了高血糖[20]導(dǎo)致肝臟ID1 活性的下降是血清中FT3 下降的重要途徑之一。

同時(shí)，本研究還探究了血糖波動(dòng)對(duì)小鼠甲狀腺激素及ID1 活性的影響，DF 組小鼠的FT3、ID1活性也較C 組有所下降，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明了血糖波動(dòng)也可以抑制ID1 活性，從而抑制FT4 向FT3的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致FT3 降低。此外，DF 組的HbA1c與C 組相比并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明兩組之間只有血糖波動(dòng)的差異，因此我們可以認(rèn)為即使控制了糖尿病小鼠的糖化血紅蛋白水平，血糖水平的波動(dòng)仍然可以導(dǎo)致ID1 活性的降低和FT3水平的降低。

總之，本研究結(jié)果揭示，糖尿病小鼠的高血糖可通過抑制肝臟脫碘酶的活性使FT3水平降低，同時(shí)，即使控制了糖化血紅蛋白水平，血糖水平的波動(dòng)仍然可以導(dǎo)致FT3水平的下降。