付博文，郭 振，俞鵬飛，李傳宇，張芷齊，周連群*

（1.復(fù)旦大學(xué) 工程與應(yīng)用技術(shù)研究院，上海 200433；2.中國科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163；3.中國科學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215163；4.季華實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528200；5.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥 230026；6.蘇州國科芯感醫(yī)療科技有限公司，江蘇 蘇州215163）

1 引 言

零模波導(dǎo)（Zero-Mode Waveguide，ZMW）器件在諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。近年來，隨著非經(jīng)典光學(xué)和納米光子學(xué)的發(fā)展ZMW被應(yīng)用于脂質(zhì)膜與細(xì)胞膜等的生物膜研究［1］；高濃度溶液中生物大分子相互作用的分析［2］；DNA、RNA測序［3］；分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)［4］等方面。ZMW在多樣的生物體系研究中日益活躍，已成為人們了解和認(rèn)知生物分子工作機(jī)制的有效工具。

由ZMW構(gòu)成的納米結(jié)構(gòu)陣列可用于同時(shí)進(jìn)行大量光學(xué)或電化學(xué)分析，即使當(dāng)目標(biāo)分子在高濃度（μM-mM）的體溶液中存在［5-6］。同時(shí)ZMW結(jié)構(gòu)可以將光學(xué)顯微光譜的觀察體積限制在10-18L到10-21L的范圍內(nèi)［7］，相對于全內(nèi)反射熒光顯微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）10-16L的觀測體積［8］具有更小的觀測范圍，進(jìn)一步降低了背景熒光的干擾，提升了檢測的靈敏度。而且ZMW利用了在截止時(shí)存在于金屬包層波導(dǎo)內(nèi)部的指數(shù)衰減場［9］，當(dāng)用于高濃度檢測時(shí)，相較于傳統(tǒng)近場光學(xué)掃描顯微 鏡（Near-field Scanning Optical Microscope，NSOM）零模波導(dǎo)提供了更強(qiáng)的限制和更好的性能［10］。ZMW陣列作為一種新的生物分析化學(xué)實(shí)用方法，可明確觀察和實(shí)時(shí)追蹤單個(gè)分子的化學(xué)反應(yīng)［11］，允許實(shí)時(shí)觀察高濃度下的分子動(dòng)力學(xué)，還可以與熒光定量分析［12］、熒光共振能量轉(zhuǎn)移［13］、熒光光譜等光學(xué)探針相結(jié)合［14］，并行分析大量的反應(yīng)或結(jié)合事件。此外，ZMW陣列還可以作為多功能器件使用，例如將光學(xué)和電化學(xué)功能結(jié)合在單一的離散結(jié)構(gòu)中實(shí)現(xiàn)電化學(xué)ZMW［15］。

ZMW器件通常是在金屬薄膜中制備納米孔結(jié)構(gòu)，并且將金屬膜沉積在透明的玻璃基底上。在2003年Levene等人率先利用ZWM實(shí)現(xiàn)了較高濃度下的單分子檢測［16］，ZWM器件基底厚度通常在200μm以下，在加工時(shí)會遇到諸多困難［17］，因此國內(nèi)外研究人員先后對基于ZWM的器件的加工工藝與結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改進(jìn)與優(yōu)化。早期ZWM器件多采用鋁作為金屬層材料［18］，但鋁的化學(xué)性質(zhì)相對活潑，具有短的光學(xué)趨膚深度及高的反射特性，因此研究人員開始采用金來代替鋁，金的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，同時(shí)在金表面進(jìn)行修飾的方法多樣且成熟［19］。ZWM微孔陣列最常見的做法是通過正性電子束膠曝光后通過干法刻蝕的方法獲得。這一結(jié)構(gòu)也可以通過直接在金屬層表面使用聚焦離子束進(jìn)行刻蝕，但這種方案對設(shè)備要求較高且產(chǎn)出率低［20］。隨后科研人員又提出了一種使用金屬剝離制備方案，即在電子束曝光時(shí)采用負(fù)性膠，曝光后保留膠柱結(jié)構(gòu)，沉積金屬后進(jìn)行剝離［21］，該方法仍在較小尺寸的孔徑上存在缺陷［22］。Wada等人在近幾年提出了將紫外納米壓印與金屬剝離相結(jié)合的方案，并驗(yàn)證了器件的可行性［23］；Teng等人在最近提出了一種成本較低的工藝方案，先通過傳統(tǒng)光刻制備微米孔，再通過電鍍的方式將孔徑縮小至納米級［24］，但這兩種方法仍在良品率與孔徑的均一度上存在問題［25］。

國內(nèi)外的研究人員對ZMW器件中納米孔陣列的制備做了大量有價(jià)值的研究工作［26］。但在對該器件進(jìn)行定量分析時(shí)主要是對其納米孔陣列底部的微弱熒光進(jìn)行檢測，然而在如何提升納米孔陣列熒光強(qiáng)度，避免孔與孔之間的熒光串?dāng)_仍然缺乏系統(tǒng)的研究。因此，本文在通過實(shí)驗(yàn)確定了構(gòu)建納米孔陣列的工藝方案，并設(shè)計(jì)了聚光微透鏡陣列，這種結(jié)構(gòu)在顯著降低孔與孔之間的熒光串?dāng)_的同時(shí)，還會在孔正下方產(chǎn)生相長干涉對ZMW在進(jìn)行檢測時(shí)的熒光強(qiáng)度起到了明顯的提升。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

ZMW器件結(jié)構(gòu)通常是由透明襯底及表面帶有納米級別直徑通孔的金屬層構(gòu)成，納米孔直徑通常在200 nm以下［16］，可以通過將大量的微孔同時(shí)制備在同一個(gè)芯片上來提高ZMW的檢測通量。

ZMW在觀測來自納米孔底部的熒光信號時(shí)，收集光學(xué)器件通常采用具有較高倍數(shù)視場相對較小的高數(shù)值孔徑物鏡。所以為了能夠從物鏡所限制的區(qū)域中收集到更多的信號，ZMW器件在設(shè)計(jì)時(shí)通常包括密集的納米孔陣列。然而，將反應(yīng)區(qū)域緊密排布在透明玻璃基底上會引起一些影響成像結(jié)果的問題，例如反應(yīng)區(qū)域之間的光學(xué)串?dāng)_，如 圖1（a）所示，仿真結(jié) 果如圖2（a）所示。

圖1 結(jié)構(gòu)改進(jìn)前后效果對比Fig.1 Structural improvement effect comparison

為了改善上述問題，本文在納米孔陣列下方增加了聚光微透鏡陣列，這一結(jié)構(gòu)可通過直接刻蝕石英基底獲得，如圖1（b）所示，增加這一結(jié)構(gòu)有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）可以起到將納米孔內(nèi)所發(fā)出的光進(jìn)行匯聚準(zhǔn)直避免串?dāng)_。（2）可以將入射光匯聚到孔底部，提升激發(fā)時(shí)的照明強(qiáng)度。圖1（b）示意的是理想微透鏡結(jié)構(gòu)。理想微透鏡邊緣具有弧度在刻蝕工藝中角度控制困難且無法與納米孔陣列加工工藝相兼容，透鏡邊緣改為直線可以簡化制作和提高鏡面的均勻性。納米孔布置在微透鏡上表面正中心，考慮到光刻機(jī)在進(jìn)行套刻時(shí)的精度及衍射等問題，將上表面直徑設(shè)定為3.5μm，其邊緣用線性擬合理想微透鏡拋物線函數(shù)y=x2/4f（其中f表示焦距），并綜合考慮多種物鏡焦距以及工藝上的可行性確定透鏡高度為5μm，使用Lumerical FDTD光學(xué)仿真軟件對微透鏡結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，側(cè)壁與垂直夾角約為20°時(shí)得到結(jié)果明顯改善，如圖2（b）所示。

圖2 仿真結(jié)果對比Fig.2 Comparison of simulation results

從仿真結(jié)果上可以看到檢測區(qū)域間的熒光串?dāng)_明顯減少，透鏡內(nèi)部由于光的反射產(chǎn)生了相長干涉和相消干涉，而相長干涉最為明顯的區(qū)域位于納米孔的正下方，這更利于提升在使用物鏡時(shí)所接收到發(fā)射光的強(qiáng)度。因此這一結(jié)構(gòu)可以使用具有較小數(shù)值孔徑的物鏡，在觀察時(shí)能夠獲得更大的視野，同時(shí)對光學(xué)串?dāng)_的減少也可以將陣列的密度進(jìn)一步提升，從而可以達(dá)到高通量檢測的目的。并且更高的熒光強(qiáng)度也使得相機(jī)在采集圖像時(shí)需要更短的曝光時(shí)間，進(jìn)行每秒多幀的連續(xù)采集，以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子的實(shí)時(shí)觀測。

2.2 結(jié)構(gòu)加工

本文提出的器件主要包括納米孔陣列與微透鏡陣列，納米孔陣列使用電子束正膠的刻蝕方案來進(jìn)行加工，實(shí)驗(yàn)流程如圖3所示。本實(shí)驗(yàn)采用兩英寸康寧7980石英玻璃作為基底，厚度為200±10μm，可見光透過率＞90%。采用丙酮，異丙醇和去離子水，先后依次超聲清洗5 min，以去除表面雜質(zhì)。通過刻蝕方案進(jìn)行納米孔陣列加工時(shí)步驟如下：（1）金屬沉積；使用電子束蒸鍍機(jī)（ULVAC Ei-5z）沉積Ti/Au，厚度10/100 nm（圖a）。（2）電子束曝光：在使用氧等離子體清洗后，旋涂電子束正膠PMMA A4，膠厚約0.25 μm，經(jīng)過前烘后進(jìn)行電子束曝光（Raith eLINE Plus），顯影定影后，取出樣品，烘干表面得到曝光圖案（圖3b）。（3）金屬刻蝕：使用離子束（IBEA-150）對金屬層進(jìn)行刻蝕，將圖案轉(zhuǎn)移至金屬層（圖3c）。（4）除膠：對殘留的電子束膠通過丙酮，異丙醇，去離子水和氧等離子體進(jìn)行清洗得到包含納米孔陣列的樣品（圖3d）。

圖3 納米孔加工工藝Fig.3 Steps of nanopore processing

微透鏡陣列加工步驟如圖4所示。（1）涂膠：在已經(jīng)制得納米孔陣列樣品表面首先旋涂AZ4620，膠厚約5微米，并進(jìn)行前烘（圖4a）。（2）曝光顯影：使用光刻機(jī)（SUSS MA6）進(jìn)行接觸式光刻套刻，顯影定影后，取出樣品，氮?dú)獯蹈杀砻妫?jīng)后烘堅(jiān)膜，在納米孔陣列上方形成掩膜（圖4b）。（3）石英玻璃刻蝕：反應(yīng)離子刻蝕（NLD-570），刻蝕氣體為CF4與Ar，刻蝕功率為150 W，刻蝕壓強(qiáng)為3Pa，刻蝕速率為400~500 nm·min-1，與光刻膠選擇比約為1∶1，得到微透鏡陣列結(jié)構(gòu)（圖4c）。（4）鍍金屬鋁：電子束蒸鍍機(jī)（ULVAC Ei-5z）沉積Al厚度50nm，在微透鏡側(cè)壁覆蓋一層不透明的金屬形成聚光微透鏡（圖4d）。（5）Lift-off：使用丙酮，異丙醇和去離子水清洗樣品，將殘留的AZ4620及其表面覆蓋的金屬剝離，并用氧等離子體清洗得到完整的樣品（圖e）。

總而言之，情境教學(xué)法對小學(xué)數(shù)學(xué)知識的教學(xué)具有十分重要的作用，一線的小學(xué)數(shù)學(xué)教師應(yīng)當(dāng)在實(shí)踐教學(xué)的過程中，積極應(yīng)用多樣的形式構(gòu)建教學(xué)的情境，促進(jìn)學(xué)生在情境之中，深化對數(shù)學(xué)知識的認(rèn)知，提高課堂教學(xué)的效果。

圖4 微透鏡加工工藝Fig.4 Steps of microlens processing

3 結(jié)果與討論

3.1 納米孔陣列制備結(jié)果

在進(jìn)行器件加工之前，為獲得最佳的曝光條件我們首先進(jìn)行了電子束曝光劑量測試，劑量范圍從175~550μC·cm-2，梯度25μC·cm-2，每個(gè)梯度曝光100個(gè)100 nm直徑微孔圖案，共完成50組樣品，電子束曝光后同時(shí)進(jìn)行顯影及刻蝕步驟來避免人為誤差?？涛g完成后通過掃描電鏡對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了廣泛的表征。

在50組樣品中每組不同曝光劑量的100個(gè)孔中抽取15個(gè)孔測量其直徑，并取平均值進(jìn)行孔徑與劑量的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖5所示，50組樣品納米孔尺寸分布直徑特征如圖中條形統(tǒng)計(jì)圖所示（方框中所有點(diǎn)都落在分布直方圖內(nèi)）。通過統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以確定當(dāng)電子束曝光劑量設(shè)定為350μC·cm-2時(shí)會得到100 nm直徑的納米孔，該劑量下掃描電鏡表征結(jié)果如圖6所示。平均為100.3 nm，標(biāo)準(zhǔn)差為2.41 nm，離散系數(shù)為2.4%，表明該工藝具有較好的均一性與穩(wěn)定性。

圖5 樣品納米孔尺寸統(tǒng)計(jì)Fig.5 Nanopore size statistics

圖6 350μC·cm-2劑量下納米孔尺寸Fig.6 Nanopore size at 350μC·cm-2 dose

3.2 微透鏡陣列制備結(jié)果

在進(jìn)行微透鏡陣列制備時(shí)，是在已有納米孔陣列的樣品上進(jìn)行的進(jìn)一步加工，因此選擇AZ4620光刻膠作為掩膜。有角度的微透鏡陣列是在常規(guī)玻璃刻蝕工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)的。初始條件為CF4（10 sccm）+Ar（10 sccm），刻蝕功率70 W，刻蝕壓強(qiáng)1 Pa時(shí)，初始傾角為2.01°。通過對上述刻蝕參數(shù)的調(diào)整時(shí)透鏡傾角不斷增加。但傾角大于30°時(shí)透鏡體積較大，會使得孔與孔之間間距增大，反而降低了檢測效率。圖7（a）為使用熒光染料（FAM，1μg·ml-1）對傾角為13.23°~27.87°樣品填充后在汞燈光源照射下4倍物鏡下的拍攝結(jié)果，圖7（b）為以19.58°的樣品為基準(zhǔn)對不同樣品單位面積平均亮度進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)。圖中可以看出13.23°~21.66°區(qū)間平均光強(qiáng)逐漸增加，當(dāng)角度大于23.59°時(shí)由于刻蝕壓力的增加導(dǎo)致石英表面凹凸不平，部分透鏡無法用于熒光信號的匯聚。影響器件整體性能。

圖7 不同角度微透鏡對比Fig.7 Comparison of different angle microlenses

最終確定刻蝕傾角在19°~23°區(qū)間。當(dāng)刻蝕氣體為CF4（30 sccm）+Ar（40 sccm），刻蝕功率為150 W，刻蝕壓強(qiáng)為3 Pa時(shí)，可以得到傾角在21.1°±0.7°符合預(yù)期的結(jié)果，如圖8所示，其刻蝕速率為400~500 nm·min-1，刻蝕時(shí)間約為10 min。

圖8 微透鏡加工結(jié)果Fig.8 Microlens processing result

3.3 器件功能驗(yàn)證

圖9是SEM表征完整結(jié)構(gòu)的圖像，左圖顯示了整體陣列結(jié)構(gòu)其中的一部分。右圖顯示出了來自陣列中的單個(gè)頂部包含納米孔的微透鏡結(jié)構(gòu)。圖10是FIB表征結(jié)果，左圖為FIB切割的剖面圖，從右圖放大的結(jié)果可以看到納米孔具有約100 nm的直徑和深度。

圖9 掃描電鏡表征結(jié)果Fig.9 SEM characterization results

圖10 微透鏡切面表征結(jié)果Fig.10 Microlens section characterization results

本文采用了一種高通量的檢測方法，通過明場光照明，利用光透過率來驗(yàn)證刻蝕出的ZMW結(jié)構(gòu)的均一性。與SEM表征相比，這種方法的好處在于可以獲得大量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在一張圖片中可以捕獲更多數(shù)量的納米孔陣列，并進(jìn)行相互比較。圖11（a）為使用Zeiss Axiocam CMOS相機(jī)在明場光照射下一組不同劑量的曝光100nm直徑納米孔圖案的照片，將被照射時(shí)能夠通過結(jié)構(gòu)的光進(jìn)行了量化。圖中的每個(gè)正方形中都是由16行組成的陣列，每行100個(gè)納米孔。當(dāng)沿著陣列向下移動(dòng)時(shí)，電子束系統(tǒng)的曝光劑量逐漸減少，導(dǎo)致形成越來越小的納米孔。

圖11 透射光測試結(jié)果Fig.11 Result of transmitted light test

接下來本文對常規(guī)ZMW器件與改進(jìn)后增加了微透鏡的樣品進(jìn)行了比較，通過熒光微球（Fluospheres Carboxylate-Modified Micro‐spheres，0.1μm）填充兩組樣品中的納米孔。外部的激發(fā)光為汞燈光源，通過濾光片調(diào)波長至488 nm，光斑直徑大小隨物鏡變化，4倍物鏡約7.0 mm，10倍物鏡約2.8 mm，20倍物鏡約1.4 mm，并通過物鏡將光照射到ZMW的金屬層的納米孔檢測區(qū)域。由于消逝波在孔內(nèi)的傳播距離很短，觀測體積會被有效的限制。

在有限的觀測體積中存在的熒光基團(tuán)將被激發(fā)并發(fā)出熒光，可以使用與激發(fā)相同的顯微鏡物鏡重新收集熒光。二向色鏡和附加濾光片用于將激發(fā)光與發(fā)射光分開。通過熒光光源激發(fā)從樣品底部觀察熒光微球發(fā)出的激發(fā)光，并通過CMOS相機(jī)拍攝進(jìn)行量化，曝光時(shí)間均為0.05 s（20 fps），為得到更為精確的對比結(jié)果，所拍攝的圖片格式為16bit tif。圖12為拍攝結(jié)果與統(tǒng)計(jì)后通過ImageJ量化結(jié)果，圖12（a）為無微透鏡樣品的拍攝結(jié)果，圖12（b）為包含微透鏡樣品的拍攝結(jié)果，圖12（c）為10倍物鏡下選取包含相同數(shù)目反應(yīng)區(qū)域的灰度值曲線量化對比結(jié)果，圖12（d）為10倍物鏡下對20組樣品相同區(qū)域內(nèi)熒光強(qiáng)度均值的統(tǒng)計(jì)對比。圖12（a）~12（b）中從左到右依次為4倍（Olympus UPLFLN4XPH NA0.13）、10倍（Olympus UPLFLN10X2PH NA0.3）與20倍物鏡（Olympus LUCPLFLN20XPH NA0.45）下的拍攝結(jié)果。

在10倍物鏡下的進(jìn)行結(jié)果對比，無微透鏡樣品僅拍攝到微弱的熒光變化，包含微透鏡的樣品具有較高的熒光強(qiáng)度。從圖12（c）可看到改進(jìn)后的結(jié)構(gòu)熒光區(qū)域與非熒光區(qū)域的灰度值區(qū)分明顯，邊界清晰，提升了數(shù)據(jù)分析時(shí)信號提取的能力，通過ImageJ對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行信噪比計(jì)算改進(jìn)前SNR=5.43，改進(jìn)后SNR=53.76，信噪比提升了9倍。從圖12（d）對多組樣品分析可以得出改進(jìn)前平均灰度值3 368.87，改進(jìn)后平均灰度值52 178.89，信號強(qiáng)度提升了14.5倍（含微透鏡樣品最小灰度值仍大于無微透鏡樣品主要是由于其受現(xiàn)有加工工藝限制表面金屬膜厚度為50 nm，未能完全阻擋來自非激發(fā)區(qū)域的背景熒光）。同時(shí)ZMW器在實(shí)際應(yīng)用時(shí)很多熒光物質(zhì)并不是恰好落在納米孔的中心區(qū)域，會產(chǎn)生很多強(qiáng)度不同的熒光信號，較弱的信號往往會被忽略掉，而從圖12（d）表明改進(jìn)后結(jié)構(gòu)熒光強(qiáng)度離散系數(shù)從18.43%降低到1.86%，離散系數(shù)降低了89.91%。改進(jìn)后的熒光強(qiáng)度具有更好的均一性，說明這一結(jié)構(gòu)對更加微弱的熒光信號檢測能力進(jìn)一步提升。

圖12 兩組樣品分別在4倍、10倍、20倍物鏡下的結(jié)果對比Fig.12 Comparison of the two sets of samples under 4x，10x，and 20x objective lenses

以上結(jié)果還表明在本文的測試條件下只包含納米孔的ZMW器件需要在20倍物鏡下才能拍攝到可以定量分析的圖片，而改進(jìn)后的結(jié)構(gòu)僅需要4倍物鏡。當(dāng)使用4倍物鏡時(shí)器件檢測的區(qū)域大小為使用20倍物鏡的25倍，當(dāng)陣列間距為10μm時(shí)可以將陣列數(shù)量從10 000提升至250 000，有效提升檢測時(shí)的通量。因此改進(jìn)后的結(jié)構(gòu)可以使相機(jī)在較短的曝光時(shí)間對微弱熒光信號進(jìn)行清晰的成像。使得同一密度的樣品可以在倍率更小，數(shù)值孔徑更低，視野更寬的物鏡下進(jìn)行檢測和分析，如果當(dāng)采用像元尺寸更大，靈敏度更高EMCCD或sCMOS相機(jī)進(jìn)行拍攝以及激發(fā)效率更高的激光器做光源時(shí)可以進(jìn)一步提升整體檢測性能。

4 結(jié) 論

本文為增強(qiáng)熒光信號強(qiáng)度，解決熒光串?dāng)_的問題，設(shè)計(jì)并研制了一種改進(jìn)的零模波導(dǎo)器件。通過將微透鏡陣列與納米孔陣列結(jié)合，利用微透鏡的光學(xué)性質(zhì)增強(qiáng)信號強(qiáng)度，減小熒光信號的發(fā)散角。熒光測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明增加了微透鏡陣列的樣品相對于改進(jìn)前熒光強(qiáng)度提升了14.5倍，信噪比提升了9倍，且熒光強(qiáng)度分布更為均一。同時(shí)通過本文提出的結(jié)合微納加工工藝的制備流程所制得的器件納米孔陣列尺度可控，離散性低，經(jīng)SEM表征和透射光量化測試其離散系數(shù)具有相似的取值范圍和變化趨勢，優(yōu)化刻蝕參數(shù)后在熔融石英玻璃表面獲得了性能良好的微透鏡陣列結(jié)構(gòu)，且該器件可以優(yōu)化陣列排布密度提升檢測通量，增加表面金屬膜厚度降低進(jìn)一步背景熒光干擾。以上結(jié)果表明，本文提出的改進(jìn)的零模波導(dǎo)器件熒光強(qiáng)度提升明顯，熒光串?dāng)_問題得到有效改善，加工方案穩(wěn)定可靠，為改進(jìn)ZMW器件的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。