王立暉，劉煥，李赫宇，鄭曉冰，3，姜艷軍，3，高靜

（1河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130；2天津益倍生物科技集團(tuán)有限公司，天津 300457；3化工節(jié)能過程集成與資源利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北工業(yè)大學(xué)，天津 300130）

引言

生物酶催化技術(shù)是生物催化技術(shù)的核心之一，其反應(yīng)過程溫和、環(huán)境友好、催化高效，將其應(yīng)用于食品、精細(xì)化學(xué)品以及其他高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)并逐漸替代部分傳統(tǒng)化學(xué)方法已成為綠色化工的必然趨勢[1-3]。脂肪酶(三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)因其具有較高的化學(xué)選擇性、立體選擇性、區(qū)域選擇性等優(yōu)點(diǎn)，在許多工業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。然而，盡管游離酶具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但由于其熱穩(wěn)定性低、重復(fù)使用困難等問題，限制了其實(shí)際應(yīng)用。酶固定化技術(shù)作為提高酶穩(wěn)定性和循環(huán)使用的最有效方法得到了廣泛研究[6-8]。固定化酶載體的理性設(shè)計(jì)和固定化方法的開發(fā)不僅可以有效利用酶分子與載體的構(gòu)效關(guān)系實(shí)現(xiàn)酶分子的高效固定化，而且有利于提高固定化酶的催化性能并實(shí)現(xiàn)從反應(yīng)體系中的快速分離和重復(fù)使用[9-10]。

磁性分離作為一種簡單便捷的分離方法，在反應(yīng)過程控制中具有獨(dú)特的操作優(yōu)勢，也越來越多地應(yīng)用到化工、環(huán)保和醫(yī)藥等領(lǐng)域[11]。超順磁性粒子是磁性分離技術(shù)中最為熱門的研究內(nèi)容，其優(yōu)勢主要包括：超順磁性懸浮粒子可以實(shí)現(xiàn)催化劑在反應(yīng)體系中的充分混合，有利于反應(yīng)進(jìn)行；可以通過外加磁場控制反應(yīng)進(jìn)程，并實(shí)現(xiàn)定向的分離和回收；在外加磁場消失后粒子表面不會出現(xiàn)剩磁，避免催化劑懸浮粒子的團(tuán)聚甚至沉淀[12]。而基于超順磁性粒子構(gòu)建的磁性核殼粒子作為一種極具發(fā)展前景的多功能材料，在固定化酶方面受到越來越多的關(guān)注，如Fe3O4/介孔二氧化硅[13]、Fe3O4/聚合物[14]、Fe3O4/碳[15]、Fe3O4/MOF[16]核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合材料已成功應(yīng)用于酶的固定化，并對其性能進(jìn)行了詳細(xì)的研究。除此之外，在近年的報(bào)道中，一種以雙連續(xù)型Winsor Ⅲ體系微乳液為基礎(chǔ)開發(fā)的新型樹枝纖維狀二氧化硅納米粒子(DFSP)也得到了極大的關(guān)注[17-19]。這種材料具有較大的比表面積和孔體積、可調(diào)的孔徑、易修飾的孔道表面、良好的生物相容性及穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。將以上兩種材料結(jié)合，設(shè)計(jì)一種具有超順磁性內(nèi)核和豐富表面結(jié)構(gòu)的磁性SiO2納米顆粒，并將這種新型復(fù)合粒子用于酶的固定化，保護(hù)酶分子不受惡劣條件的影響是克服工業(yè)應(yīng)用中的眾多限制的一種有前途的方法。

脂肪酶作為一種天然的界面酶，在結(jié)構(gòu)上與標(biāo)準(zhǔn)酯酶有明顯的區(qū)別。大多數(shù)脂肪酶的結(jié)構(gòu)包括一個由疏水表面和親水表面構(gòu)成的多肽鏈[20-21]。在脂肪酶空間結(jié)構(gòu)中，活性口袋“蓋子”的疏水區(qū)域與活性中心周圍的疏水區(qū)域相互作用，使其與反應(yīng)介質(zhì)隔離[22]。然而，在存在疏水結(jié)構(gòu)的情況下，“蓋子”將被打開，使得活性中心易于和底物接觸而呈現(xiàn)為活性增強(qiáng)[23]。這種界面激活作用也已被研究者所熟知并成功實(shí)踐。例如，Gao 等[24]成功合成了用于CALB 固定化的疏水SiO2。其疏水表面使固定化脂肪酶具有良好的穩(wěn)定性。Kalantari 等[25]報(bào)道了增加硅基載體的表面疏水性可以提高酶的活性和穩(wěn)定性。這些研究表明，疏水硅基材料固定化的脂肪酶不僅具有良好的活性，而且具有良好的pH 和熱穩(wěn)定性[26]。將脂肪酶的界面激活作用與上述新型磁性SiO2納米顆粒相結(jié)合，構(gòu)建具有疏水性的磁性SiO2復(fù)合材料應(yīng)用于脂肪酶等界面酶固定化領(lǐng)域，將為制備易分離、高活性、高穩(wěn)定性的固定化酶催化劑提供良好的平臺。

因此，本研究將以Fe3O4微球?yàn)閮?nèi)核，以正硅酸乙酯(TEOS)和1,2-雙(三乙氧基硅烷)乙烷(BTSE)為硅源，利用改進(jìn)的Winsor Ⅲ微乳液雙連續(xù)相體系制備具有超順磁性Fe3O4內(nèi)核和樹枝狀纖維形氧化硅外殼的核殼結(jié)構(gòu)磁性有機(jī)硅納米粒子(MMOSNs)，并將其用于固定化脂肪酶CALB，以獲得固定化酶CALB@MMOSNs。研究磁性載體與酶分子之間的構(gòu)效關(guān)系，固定化脂肪酶的活性、穩(wěn)定性，以及疏水載體對脂肪酶性能的影響，最后將CALB@MMOSNs用于催化合成乙酰丙酸酯。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

Novozym 435 (N435，丙烯酸樹脂固定化念珠菌南極脂肪酶B)和CALB 購自北京高瑞森科技有限公司。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、BTSE、4-硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)、乙二醇和乙酰丙酸(LA)均為分析純，購自阿拉丁科技(上海)股份有限公司。TEOS、檸檬酸鈉、甲醇、環(huán)己烷、月桂酸、辛醇、正月桂醇、異辛烷、三氯化鐵(FeCl3)、正丁醇購自天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司。牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)G-250 購自碧云天生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純，購自天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 核殼結(jié)構(gòu)磁性介孔有機(jī)硅納米花的制備

（1）Fe3O4的制備：在25℃下，將2.60 g FeCl3、1.20 g檸檬酸鈉、80 ml乙二醇置于單口燒瓶中，在水浴鍋中攪拌20 min，使溶液混合均勻后，取3.12 g 無水乙酸鈉加入到混合液中，室溫下反應(yīng)30 min。隨后，將上述混合液轉(zhuǎn)移到100 ml 的聚四氟乙烯反應(yīng)釜里，200℃條件下保溫20 h。最后，所得樣品磁性分離，用超純水和乙醇各洗4次。

（2）核殼結(jié)構(gòu)磁性介孔有機(jī)硅納米花(MMOSNs)的制備：取200 mg Fe3O4、0.16 g CTAB、75 ml 超純水、25 ml 無水乙醇、1 ml 濃氨水(25%)依次添加到250 ml 的三口燒瓶中。超聲1 h 使Fe3O4分散均勻，35℃水浴鍋中保溫30 min。然后，沿?zé)勘诰徛尤?0 ml 正己烷，靜置10 min，使油水雙相分層。滴加500 μl 的TEOS 和BTSE(體積比=1∶1)的混合液，35℃下反應(yīng)70 h。所得樣品磁性分離，用超純水和乙醇各洗4 次。取1 g MMOSNs 置于無水乙醇(200 ml)和HCl(200 μl)的混合液中，反應(yīng)3 h 萃取模板，重復(fù)萃取三次。

（3）核殼結(jié)構(gòu)磁性介孔無機(jī)硅納米花(MMSNs)的制備：在250 ml 的三口燒瓶中，依次加入Fe3O4(180 mg)、CTAB(0.18 g)、超純水(70 ml)、無水乙醇(20 ml)、濃氨水(800 μl，25%)。上述混合液超聲處理1 h 后，35℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。然后，沿?zé)勘诰徛尤?5 ml 正己烷，靜置10 min，使油水雙相分層。滴加1 ml的TEOS，35℃下反應(yīng)70 h。所得樣品磁性分離，用超純水和乙醇各洗滌4 次，室溫干燥。最后，550℃下煅燒5 h，去除制孔劑模板CTAB，制得MMSNs。

1.3 固定化酶制備條件的優(yōu)化

（1）利用吸附方法制備固定化酶：取10 mg載體，加入1 ml 的酶液，室溫下，搖床上(170 r/min)孵化一定時間，測固定化酶酶活以及蛋白負(fù)載量。

（2）吸附時間的優(yōu)化：取10 mg 載體分散在1 ml的酶液中，室溫下，170 r/min 的搖床上反應(yīng)一定時間。測吸附時間為3、4、5、6、7 h 時上清中剩余的蛋白含量。根據(jù)吸附時間和載體的蛋白含量繪制吸附進(jìn)程曲線，確定最優(yōu)的吸附時間。

（3）初始酶濃度的篩選：將10 mg 載體加入不同濃度(0.21、0.43、0.85、1.7、3.4、6.8 mg/ml)的酶液，室溫下，170 r/min 水浴搖床反應(yīng)5 h，測定固定化酶的蛋白含量和酶活，確定最優(yōu)的初始酶濃度。

1.4 固定化酶負(fù)載量和酶活性的測定

（1）固定化酶負(fù)載量的測定：采用Bradford 法[27]確定固定化酶的蛋白負(fù)載量。將5 ml 的考馬斯亮藍(lán)溶液加入到1 ml 的樣品中，振蕩30 s。在25℃下反應(yīng)5 min，利用分光光度計(jì)，測量混合液在595 nm處的吸光值。參考牛血清蛋白(BSA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算固定化酶的蛋白負(fù)載量。

（2）水解活性的測定：利用4-硝基苯基棕櫚酸酯(p-NPP，5.0 mg/ml)方法測定脂肪酶的水解活性。在3 ml 的PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)溶液中，加入200 μl 的p-NPP 和200 μl 的固定化酶懸浮液(或游離酶)，振蕩30 s。在25℃下反應(yīng)3 min，過濾得上清液利用分光光度計(jì)測量410 nm 處的吸光值，根據(jù)上清液中對硝基苯酚(p-NP)含量，確定固定化酶(或游離酶)的水解酶活。

水解酶活的定義：單位時間(min)釋放單位產(chǎn)物p-NP(1 nmol)所需的酶量，定義為1U。

（3）酯化活性的測定：將固定化酶(10 mg)或游離酶、月桂酸(100 mg、0.5 mmol)、正辛醇(200 μl)加入到5 ml 的環(huán)己烷溶液中。將得到的混合液在40℃的搖床上孵化2 h。利用熱乙醇法測定反應(yīng)前后月桂酸的量，確定固定化酶的酯化活性。

酯化活性的定義：單位時間(h)消耗單位月桂酸(1 μmol)所需的酶量，定義為1 U。

1.5 MMOSNs和CALB@MMOSNs的表征

（1）利用掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)和X 射線光電子能譜(XPS)表征MMOSNs 的形貌結(jié)構(gòu)和元素組成。

（2）利用N2吸附-脫附實(shí)驗(yàn)、傅里葉紅外光譜(FT-IR)和激光共聚焦顯微鏡(CLSM)表征MMOSNs和CALB@MMOSNs的孔徑分布、孔體積、比表面積。

（3）利用磁滯回曲線(VSM)表征Fe3O4、MMOSNs和CALB@MMOSNs的飽和磁性。

1.6 固定化酶的穩(wěn)定性研究

（1）pH穩(wěn)定性測定：室溫下，將固定化酶和游離酶分別在碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=10.0)和乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=4.0)中孵化一定的時間。每隔24 h，利用p-NPP 方法測定脂肪酶殘余水解活性，并計(jì)算酶活回收率，如式(1)。

（2）熱穩(wěn)定性測定：分別將固定化酶和游離酶在60℃環(huán)己烷中浸泡一定時間，每隔12 h，利用熱乙醇法測定其殘余酯化活性，并計(jì)算相對酶活，如式(2)。

（3）有機(jī)溶劑耐受性測定：取適量固定化酶和游離酶在有機(jī)溶劑(甲醇、異辛烷、正己烷、叔丁醇)中孵化3 h，利用熱乙醇法測定其殘余酯化活性，并計(jì)算相對酶活，如式(2)。

（4）儲藏穩(wěn)定性測定：室溫下，分別將固定化酶和游離酶存儲30 d，每隔5 d 測其剩余的酯化活性，并計(jì)算相對酶活，如式(2)。

1.7 固定化酶在LA和十二醇酯化反應(yīng)中的應(yīng)用

（1）乙酰丙酸酯的合成反應(yīng)：以脂肪酶為催化劑，催化乙酰丙酸(LA)和醇反應(yīng)生成乙酰丙酸酯，其反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。

圖1 LA和醇的酯化反應(yīng)Fig.1 The esterification reaction of LA and alcohol

（2）測定方法：利用熱乙醇法，分別測量反應(yīng)前后LA的量，確定LA轉(zhuǎn)化率。

（3）溫度對LA 轉(zhuǎn)化率的影響：在無溶劑體系中，分別加入一定量的LA 和十二醇，在不同溫度下(45、50、55、60℃)反應(yīng)一定的時間，利用熱乙醇法，測定LA轉(zhuǎn)化率，確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度。

（4）LA/十二醇摩爾比對LA 轉(zhuǎn)化率的影響：在最優(yōu)的反應(yīng)溫度下，加入不同摩爾比的LA/十二醇(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，反應(yīng)一定的時間，測定反應(yīng)前后LA的量，計(jì)算LA的轉(zhuǎn)化率，確定最優(yōu)的LA/十二醇摩爾比。

（5）時間對LA 轉(zhuǎn)化率的影響：在最優(yōu)的反應(yīng)溫度下，將最優(yōu)摩爾比下的LA 和十二醇反應(yīng)一定時間，測定不同時間(0、1、5、10、15、20、22、24 h)下LA的轉(zhuǎn)化率。

1.8 固定化酶的重復(fù)使用性

分別以相同初始酶活的固定化酶和N435 為催化劑，催化LA 和十二醇的酯化反應(yīng)，測定其重復(fù)使用性。具體的實(shí)驗(yàn)過程如下：(1)在上述最優(yōu)的反應(yīng)條件，進(jìn)行LA 和十二醇的酯化反應(yīng)，利用熱乙醇法測定反應(yīng)前后LA 的量，計(jì)算LA 的轉(zhuǎn)化率。(2)每次反應(yīng)結(jié)束后，用正己烷洗滌去除未反應(yīng)的底物，投入下一循環(huán)使用。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 MMOSNs和CALB@MMOSNs的表征

通過SEM、TEM 表征Fe3O4和MMOSNs 納米粒子的形貌結(jié)構(gòu)。圖2(a)、(b)分別為Fe3O4的SEM 和TEM 圖，由圖可知Fe3O4具有較好的單分散性，粒徑約為150 nm。圖2(c)、(d)分別為MMOSNs 的SEM 圖和TEM 圖。由圖可知，MMOSNs 是粒徑約為200 nm的球形納米粒子，具有由Fe3O4內(nèi)核(150 nm)和有機(jī)硅外殼(25 nm)構(gòu)成的明顯核殼結(jié)構(gòu)，而且有機(jī)硅層具有明顯的樹枝狀纖維形孔道結(jié)構(gòu)，豐富的表面形貌將為后期脂肪酶的負(fù)載提供良好的場所。

圖2(e)、(f)為核-殼結(jié)構(gòu)磁性無機(jī)硅納米花(MMSNs)的SEM 和TEM 圖，如圖所示，MMSNs 同樣具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)，F(xiàn)e3O4作為內(nèi)核(150 nm)，在其表面包覆了介孔無機(jī)硅外殼(50 nm)，并表現(xiàn)出與MMOSNs類似的樹枝狀纖維形孔道結(jié)構(gòu)。

圖2 Fe3O4(a)、MMOSNs(c)和MMSNs(e)的SEM圖片；Fe3O4(b)、MMOSNs(d)和MMSNs(f)的TEM圖片F(xiàn)ig.2 SEM images of Fe3O4(a),MMOSNs(c)and MMSNs(e);TEM images of Fe3O4(b),MMOSNs(d)and MMSNs(f)

通過X 射線光電子能譜(XPS)，根據(jù)元素的結(jié)合能分析載體MMOSNs 表面元素和化學(xué)鍵的種類，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。根據(jù)圖3(a)可知，結(jié)合能在103、154、285 和533 eV 處的特征峰分別對應(yīng)Si 2p、Si 2s、C ls 和O 1s，證明MMOSNs 表面主要有O、C、Si三種元素。如圖3(b)所示，對C 1s 高分辨率的XPS譜圖進(jìn)行分峰處理，284.4 和285.1 eV 處的特征峰依次對應(yīng)C—Si 和C—C，并且C—Si 和C—C 鍵均來源于有機(jī)硅源BTSE[28]。同理對Si 2p 的XPS 譜圖[圖3(c)]進(jìn)行分峰處理，102.6和103.4 eV處的特征峰分別對應(yīng)Si—C 和Si—O，其中Si—C 鍵同樣來源于BTSE[29]。由此可以證明有機(jī)MMOSNs 載體成功制備。

圖3 MMOSNs的XPS表征Fig.3 XPS characterization of the MMOSNs

利用N2吸附-脫附實(shí)驗(yàn)表征MMOSNs 和CALB@MMOSNs 的孔道結(jié)構(gòu)，如圖4(a)所示，MMOSNs具有典型的Ⅳ型吸附-脫附等溫線，P/P0在0.6～0.9 范圍內(nèi)有H1 型回滯環(huán)，說明載體具有明顯的介孔結(jié)構(gòu)[30-31]。由圖4(b)孔徑分布圖可看出MMOSNs 的孔徑為6.339 nm，與CALB 分子(3 nm×4 nm×5 nm)[24]匹配良好，有利于后期酶分子的固定化。除此之外，通過BET、BJH 分析可知，MMOSNs的比表面積、孔體積依次是347.9 m2/g和0.6392 cm3/g。相比于MMOSNs 的孔體積和比表面積，CALB@MMOSNs 的孔體積(0.1080 cm3/g)和比表面積(103.7 m2/g)明顯要小，這是由于酶分子被負(fù)載在表面纖維形介孔孔道中占據(jù)了一定的空間，從而間接證明CALB@MMOSNs的成功制備。

圖4 MMOSNs、CALB@MMOSNs的N2吸附-脫附曲線(a)和孔徑分布(b)Fig.4 Nitrogen adsorption-desorption isotherms(a)and pore size distribution profile(b)of the MMOSNs and CALB@MMOSNs

對Fe3O4、MMOSNs和CALB@MMOSNs進(jìn)行飽和磁性研究，由圖5 可以看出，MMOSNs 的飽和磁性(38.63 emu/g)較Fe3O4(62.81 emu/g)有所降低，這是由于Fe3O4的表面包裹了一層無磁性的有機(jī)硅[32-33]。而固定化以后得到的CALB@MMOSNs 的飽和磁性(28.32 emu/g)相對于MMOSNs和Fe3O4的飽和磁性也略有降低。此外由圖還可以看出三種粒子均表現(xiàn)出超順磁性，有利于固定化酶在反應(yīng)體系中形成懸浮液而促進(jìn)反應(yīng)，以及后期外加磁場的條件下實(shí)現(xiàn)反應(yīng)控制和快速分離。

圖5 Fe3O4、MMOSNs和CALB@MMOSNs的磁滯回曲線（1 Oe=79.5775 A/m）Fig.5 The hysteresis loops of Fe3O4,MMOSNs and CALB@MMOSNs

通過異硫氰酸熒光素(FITC)修飾CALB 分子，得到FITC-CALB。以MMOSNs 為載體，負(fù)載FITCCALB，在激光共聚焦顯微鏡下表征固定化酶，如圖6 所示，被標(biāo)記的脂肪酶分子在一定波長的激發(fā)作用下顯示綠色的熒光，從而證明酶分子被成功固定在載體MMOSNs上[30]。

圖6 固定化酶激光共聚焦顯微鏡圖片F(xiàn)ig.6 CLSM image of the FITC-labeled CALB@MMOSNs

2.2 CALB@MMOSNs的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 固定化酶條件的篩選 根據(jù)圖7(a)可看出，不同CALB 初始濃度條件下載體所對應(yīng)最大蛋白吸附量不同，但均能在5 h 之內(nèi)基本達(dá)到平衡。在5 h條件下繼續(xù)研究初始酶濃度對負(fù)載量和酶活的影響，如圖7(b)所示，隨著CALB 初始濃度增加，CALB@MMOSNs 的負(fù)載量也逐漸增加，但是CALB@MMOSNs 的酶活卻呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。當(dāng)CALB 初始濃度較低時，載體表面吸附位點(diǎn)相對酶分子過剩，吸附平衡后負(fù)載量較少，導(dǎo)致固定化酶活性較低[34-35]；隨著初始濃度升高，負(fù)載量逐漸達(dá)到飽和甚至過飽和，載體孔道內(nèi)酯肪酶分子過多導(dǎo)致過于擁擠甚至發(fā)生團(tuán)聚，造成有效活性位點(diǎn)的減少，并阻礙酶分子和底物間的傳質(zhì)，造成固定化酶表觀活性降低[9，36]。綜上所述，最優(yōu)的初始酶濃度以及吸附時間分別為4.80 mg/ml 和5 h。此時，固定化酶的負(fù)載量、酶活分別是177.49 mg/g和27.39 U/mg，酶活回收率為23.19%。

圖7 MMOSNs在不同酶濃度下的吸附進(jìn)程曲線(a)；初始酶濃度對載體的蛋白負(fù)載量及CALB@MMOSNs酶活的影響(b)Fig.7 Adsorption process of CALB at different concentrations on the MMOSNs(a)and effect of initial lipase concentration on CALB loading and specific activity of CALB@MMOSNs(b)

2.2.2 CALB@MMOSNs穩(wěn)定性的研究

（1）pH 穩(wěn)定性 為了探究以疏水材料MMOSNs 為載體制備固定脂肪酶的pH 穩(wěn)定性，將CALB@MMOSNs 分別于pH=4.0 和pH=10.0 的緩沖溶液中孵化一定時間，并與CALB@MMSNs(核-殼結(jié)構(gòu)無機(jī)硅為載體制備的固定化酶)以及游離酶的性能進(jìn)行對比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8 所示。由圖8(a)中可知，在酸性緩沖溶液(pH=4.0)中浸泡120 h后，游離酶降低為初始酶活的12.27%，此時CALB@MMOSNs和CALB@MMSNs 的活性仍可保留初始酶活的48.85%和40.00%。同理，如圖8(b)所示，在堿性緩沖溶液(pH=10.0)中浸泡120 h后，游離酶降低為初始酶活的23.48%，此時CALB@MMOSNs 和CALB@MMSNs 分別保留初始酶活的74.28%和65.00%。酶分子的催化作用得益于其活性中心的高級結(jié)構(gòu)，而組成酶活性中心的氨基酸側(cè)鏈存在不同的功能基團(tuán)以決定對底物的結(jié)合和催化。而這些必須基團(tuán)往往是良好的質(zhì)子供體或受體，其解離狀態(tài)容易受到環(huán)境pH的影響。相較于游離酶，CALB@MMOSNs 和CALB@MMSNs 的pH 穩(wěn)定性均有明顯提高，這是由于載體表面復(fù)雜的孔道結(jié)構(gòu)為酶分子提供了相對穩(wěn)定的微環(huán)境。在極端的條件下，可以更好地維持酶分子的空間構(gòu)象而有效保持酶活[9]。除此之外，相較于CALB@MMSNs，CALB@MMOSNs 具有更好的pH穩(wěn)定性，這歸功于MMOSNs 載體與脂肪酶分子之間具有較強(qiáng)的疏水作用力，以及表面的疏水微環(huán)境，可以使脂肪酶分子維持剛性結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)界面激活，充分發(fā)揮活性[29-30]。

圖8 游離酶、CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs在pH=4.0(a)和pH=10.0(b)的緩沖溶液中的穩(wěn)定性Fig.8 The stabilities of free lipase,CALB@MMSNs and CALB@MMOSNs at pH=4.0(a)and pH=10.0(b)

（2）熱穩(wěn)定性 由圖9 可知，在60℃的環(huán)己烷溶液中浸泡60 h 后，游離酶、CALB@MMOSNs 和CALB@MMSNs 的酶活分別降低為初始酶活的25.00%、74.07%和65.00%。這種現(xiàn)象主要是因?yàn)槊阜肿釉谳^高溫度下容易發(fā)生熱變性，活性中心長時間暴露在較高溫度后分子內(nèi)部原有的構(gòu)象發(fā)生變化，次級鍵(如氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華引力等)也被破壞，酶分子從原來有秩序的卷曲緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o秩序的松散伸展?fàn)罱Y(jié)構(gòu)而導(dǎo)致失活。但是相較于游離酶，固定化酶中的酶分子被限制在匹配良好的載體孔道結(jié)構(gòu)內(nèi)，孔道對酶分子空間結(jié)構(gòu)的限制效應(yīng)可以有效保持良好的活性構(gòu)象避免因溫度變化而導(dǎo)致的失活[37]。除此之外，CALB@MMOSNs的疏水性較強(qiáng)，避免了水分在載體上的聚集，表現(xiàn)為熱穩(wěn)定性優(yōu)于無機(jī)載體構(gòu)建的CALB@MMSNs。

圖9 游離酶、CALB@MMOSNs和CALB@MMSNs在60℃環(huán)己烷中的熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stabilities of free lipase,CALB@MMOSNs and CALB@MMSNs in cyclohexane at 60℃

（3）有機(jī)溶劑耐受性 測定了游離酶、CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs在不同有機(jī)溶劑中的耐受性，結(jié)果如圖10 所示。在有機(jī)溶劑中浸泡后，CALB@MMSNs 和CALB@MMOSNs 的溶劑耐受性明顯優(yōu)于游離酶，分析原因主要有以下兩點(diǎn)：(1)游離酶在有機(jī)溶劑中易團(tuán)聚，阻礙了底物和酶分子間的傳質(zhì)，表現(xiàn)為酶活降低，通過將酶分子負(fù)載在載體上，可有效避免酶分子聚集，從而減小傳質(zhì)阻力[38]；(2)載體的樹枝狀纖維形表面將酶分子束縛在孔道結(jié)構(gòu)內(nèi)，避免在惡劣環(huán)境中酶分子高級結(jié)構(gòu)的變化，從而增強(qiáng)CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs的有機(jī)溶劑耐受性。在有機(jī)溶劑中浸泡后(除甲醇外)，固定化酶的活性提高，這是因?yàn)橹久窩ALB分子的活性中心存在一個疏水域，與疏水性的有機(jī)溶劑中相互作用發(fā)生“界面活化”，使得CALB 達(dá)到最佳的活性構(gòu)象，因此表現(xiàn)出超活的現(xiàn)象[39]。但是由于甲醇的極性較強(qiáng)，破壞了酶分子表面的必需水，造成酶活降低。

圖10 游離酶、CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs的有機(jī)溶劑耐受性Fig.10 The effect of organic solvents on the activity of free lipase,CALB@MMSNs and CALB@MMOSNs

（4）儲存穩(wěn)定性 如圖11所示，CALB@MMOSNs和CALB@MMSNs 在儲存30 d 后酯化活性均可保留初始酶活的86.00%左右，而游離酶卻降低為初始酶活的57.50%。CALB@MMOSNs和CALB@MMSNs的儲存穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶，一方面因?yàn)檩d體孔道結(jié)構(gòu)對CALB 空間構(gòu)象的束縛作用，在長期儲存過程中保持了其活性構(gòu)象[40]；另一方面由于酶分子分散在固定化酶表面，可以有效避免使用和回收過程中的酶分子團(tuán)聚導(dǎo)致的失活。

圖11 游離酶、CALB@MMSNs和CALB@MMOSNs的長時間儲存穩(wěn)定性Fig.11 The storage stabilities of free lipase,CALB@MMSNs and CALB@MMOSNs

2.2.3 CALB@MMOSNs 在制備乙酰丙酸十二酯中的應(yīng)用 為了探究CALB@MMOSNs 的催化性能，將其用于催化LA 和十二醇的酯化反應(yīng)合成乙酰丙酸十二酯。同時，優(yōu)化酯化反應(yīng)條件(溫度、LA/十二醇摩爾比和時間)，結(jié)果如圖12所示。

圖12 溫度(a)、LA/十二醇摩爾比(b)和時間(c)對LA和十二醇酯化反應(yīng)的影響Fig.12 Effect of temperature(a),LA/n-lauryl alcohol molar ratio(b)and time(c)on esterification reaction

首先探究了溫度對LA 轉(zhuǎn)化率的影響。由圖12(a)可知，隨著反應(yīng)溫度由45℃升高到50℃，LA轉(zhuǎn)化率增大。主要有以下兩個原因：(1)LA和十二醇為吸熱反應(yīng)，溫度升高可增強(qiáng)底物分子熱運(yùn)動，促進(jìn)產(chǎn)物合成[41]；(2)在一定的范圍內(nèi)，升高溫度，可以使酶分子快速達(dá)到最佳的活性構(gòu)象，從而增大酶活，LA 的轉(zhuǎn)化率也隨之增大[42]。當(dāng)溫度由50℃升高至60℃時，LA 的轉(zhuǎn)化率卻出現(xiàn)下降，這是由于溫度過高會造成脂肪酶變性失活而導(dǎo)致LA 轉(zhuǎn)化率降低。因此，選擇50℃為最優(yōu)的反應(yīng)溫度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其次，探究了LA/十二醇摩爾比對LA 轉(zhuǎn)化率的影響。由圖12(b)可知，當(dāng)LA/十二醇的摩爾比由1∶5增加1∶10時，LA 的轉(zhuǎn)化率增加。這是由于酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，適量增加十二醇可促進(jìn)酯形成，同時可作為溶劑加強(qiáng)底物間的相互碰撞[43-44]。然而，當(dāng)LA/十二醇的摩爾比由1∶10 增加到1∶25 時，LA的轉(zhuǎn)化率降低，這是因?yàn)楦邼舛鹊恼既芤簳姑阜肿影l(fā)生不可逆的變性。最后，測定了反應(yīng)不同時間時LA 轉(zhuǎn)化率，由圖12(c)可知，隨著反應(yīng)時間從0 h 延長到22 h，LA 轉(zhuǎn)化率逐漸增加。反應(yīng)22 h 后，酯化反應(yīng)達(dá)到平衡，此時最大的LA 轉(zhuǎn)化率為85.05%。綜合以上實(shí)驗(yàn)可知，CALB@MMOSNs 催化合成乙酰丙酸十二酯的最優(yōu)條件是：溫度50℃、LA/十二醇的摩爾比1∶10、反應(yīng)時間22 h。

2.2.4 CALB@MMOSNs 的重復(fù)使用性 將相同初始酶活的CALB@MMOSNs、CALB@MMSNs 和N435應(yīng)用于催化合成乙酰丙酸十二酯，探究它們的重復(fù)使用性。由 圖 13可知，CALB@MMOSNs、CALB@MMSNs 重復(fù)使用9 個循環(huán)后，LA 的轉(zhuǎn)化率分別保持了68.94%和58.60%。然而，N435 作為催化劑重復(fù)使用9 次后轉(zhuǎn)化率僅為29.83%。這是因?yàn)橄噍^于樹枝狀纖維形材料(MMOSNs 和MMSNs)，基于大孔樹脂材料的N435 容易在反應(yīng)的過程中造成酶分子的泄漏，而且大孔結(jié)構(gòu)不能很好地保護(hù)酶分子的構(gòu)象，從而導(dǎo)致固定化酶活性降低導(dǎo)致LA轉(zhuǎn)化率降低[29]。除此之外，CALB@MMOSNs 的疏水表面不僅可以避免水分子聚集，還可以有效實(shí)現(xiàn)CALB 的界面活化，從而表現(xiàn)出比無機(jī)硅載體制備的CALB@MMSNs更好的重復(fù)使用性。

圖13 CALB@MMOSNs、CALB@MMSNs和N435在酯化反應(yīng)中的重復(fù)使用性Fig.13 Reusability of CALB@MMOSNs,CALB@MMSNs and N435 for esterification reaction

3 結(jié)論

本研究在改進(jìn)Winsor Ⅲ體系雙連續(xù)微乳液相的基礎(chǔ)上，加入超順磁性Fe3O4，制備了單分散核殼結(jié)構(gòu)磁性有機(jī)硅載體MMOSNs。通過研究載體與酶分子之間的構(gòu)效關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了CALB@MMOSNs 的高效制備并用于催化酯化反應(yīng)。與無機(jī)硅制備的CALB@MMSNs 和游離CALB 相比，CALB@MMOSNs表現(xiàn)出了更好的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了多批次重復(fù)使用。通過核殼結(jié)構(gòu)磁性樹枝狀纖維形有機(jī)載體的設(shè)計(jì)構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了磁性分離、高效固定化和界面激活的有效集成，為固定化脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用提供了新的技術(shù)路線。