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        溴化1-辛基-3-甲基咪唑聚集狀態(tài)對蛋白質結晶的影響研究

        2021-10-04 15:11:16于筱溪閆真真蔣其輝吳霞張余曉王曉娟黃方
        化工學報 2021年9期

        于筱溪,閆真真,蔣其輝,吳霞,張余曉,王曉娟,黃方,3

        (1 中國石油大學(華東)化學工程學院,山東青島 266580;2 中國石油集團工程技術研究院有限公司井下作業(yè)研究所,北京 102206;3 中國石油大學(華東)重質油國家重點實驗室,山東青島 266580)

        引言

        蛋白質結晶是生命科學領域的研究熱點之一。蛋白質晶體具有較高的孔隙率和生物相容性[1],在藥物輸送、生物傳感和生物催化等方面有著潛在的應用可能;此外,蛋白質的三維結構是藥物設計的前提[2],X 射線衍射是現(xiàn)階段解析蛋白質三維結構的主要手段之一[3],高質量蛋白質晶體的培養(yǎng)是這一技術的關鍵。由此可見,蛋白質結晶過程對蛋白質工程、藥物設計[4]和藥物輸送等領域都有著舉足輕重的地位。

        由于蛋白質分子量大,對環(huán)境極度敏感,蛋白質分子的有序聚集過程難度大且不易控制[5]。諸多研究表明,在結晶體系中加入小分子添加劑有助于蛋白質分子聚集成核[6],離子液體就是其中的一種[7]。離子液體由陽離子和陰離子組成,其生物相容性高,結構具有很大的設計性[8]。將離子液體作為添加劑引入蛋白質結晶過程,能夠顯著提高晶體尺寸,優(yōu)化晶體的衍射質量[9],在蛋白質結晶的研究領域越來越受到關注。Chen 等[10]通過在溶菌酶結晶溶液中添加1,3-丁基咪唑氯化物,得到尺寸大、衍射質量高的溶菌酶晶體。Judge 等[11]證明了用離子液體作為添加劑后,過氧化氫酶、肌紅蛋白、胰蛋白酶、葡萄糖異構酶等晶體的X 射線衍射分辨率優(yōu)于沒有添加離子液體的蛋白質晶體。本文選擇溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br)作為添加劑。作為化學反應中優(yōu)良的綠色替代溶劑,咪唑類離子液體有較高的生物相容性和低毒性[12]。從化學結構上看,[C8mim]Br 的溶解性好,具有類似陽離子表面活性劑的咪唑親水基團和疏水烷基鏈,是一類新型表面活性劑[8];Zheng 等[13]發(fā)現(xiàn),咪唑類離子液體的表面活性優(yōu)于同碳鏈長度的傳統(tǒng)表面活性劑。因此[C8mim]Br 在溶液中能夠有序聚集[14],根據(jù)溶液性質的不同可以形成膠束、液晶、凝膠、囊泡或微乳液等,拓展了傳統(tǒng)表面活性劑的聚集特征[15]。由此可知,離子液體[C8mim]Br 與蛋白質之間的相互作用較為復雜,可能改變蛋白質的構象與聚集狀態(tài)[16],影響蛋白質的結晶過程。選擇溶菌酶為研究對象,研究了[C8mim]Br 聚集狀態(tài)對溶菌酶結晶的影響,通過測定溶菌酶結晶熱力學與動力學數(shù)據(jù),采用動態(tài)光散射監(jiān)測溶液中聚集體的變化趨勢,利用ζ-電勢考察離子液體與蛋白質之間的相互作用,對離子液體對蛋白質結晶過程的影響機制進行了探討。

        1 實驗材料和方法

        1.1 實驗材料

        雞蛋白溶菌酶,購自上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司;溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br),購自上海成捷化學有限公司,純度99%;溶壁微球菌粉,購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院;氯化鈉(分析純);乙酸(分析純);氫氧化鈉(分析純),購自國藥集團化學試劑有限公司。

        1.2 實驗設備

        倒置熒光顯微鏡,上海徠卡顯微系統(tǒng)貿易有限公司;納米粒度分析儀,英國馬爾文儀器有限公司;紫外分光光度計,上海島津儀器有限公司;恒溫水浴槽,上海先歐科技有限公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 溶菌酶的結晶 溶菌酶結晶采用分批結晶法:依次吸取100 μl溶菌酶溶液(20、28、36、40 mg/ml)、100 μl 氯化鈉溶液(質量分數(shù)8%)、10 μl 不同濃度的[C8mim]Br 溶液置于96 孔細胞板中,4℃下結晶。所有溶液均在pH4.5、0.1 mol/L 的乙酸鈉緩沖溶液中配制。

        1.3.2 溶菌酶活性測定 溶菌酶活性檢測方法參考文獻[17]的溶菌酶活性簡易測定,以無菌操作方式,將溶壁微球菌種子菌液按照1∶100 的比例接種至100 ml LB 液體培養(yǎng)基中,進行菌株的擴大培養(yǎng),在37℃搖床中培養(yǎng)至450 nm 處吸光度值為1.300±0.010 的菌懸液。使用1 cm 光徑4 ml 容量的比色皿,吸取2.5 ml 450 nm 處吸光度值為1.300±0.010的菌懸液,加入0.5 ml 相應酶反應液(溶菌酶溶液、溶菌酶與離子液體的混合溶液)混勻立即計時,于25℃分別記錄10 s 和70 s 時450 nm 處吸光度值A1和A2,并計算其差值的絕對值。檢測前采用相應的緩沖液調零。

        1.3.3 溶菌酶溶解度測定 配制一系列已知濃度的溶菌酶系列標準溶液,利用紫外分光光度計,測量其在280 nm 處的吸光值,繪制溶菌酶濃度的標準曲線。配制一系列[C8mim]Br濃度梯度溶菌酶懸浮液,在4℃下溫和攪拌至溶液達到平衡,取200 μl平衡懸浮液離心(14000 r/min、15 min),用紫外分光光度計檢測上清液在280 nm 處的吸光度值,計算溶菌酶在此條件下的平衡濃度。

        1.3.4 溶菌酶結晶動力學測定 配制一系列[C8mim]Br 濃度梯度溶菌酶結晶溶液,迅速降溫至4℃并保持恒溫,每隔2 h 取500 μl 溶液離心(14000 r/min、15 min),將上清液稀釋20倍,利用紫外分光光度計檢測上清液在280 nm 處的吸光度值,得到溶菌酶溶液濃度隨結晶時間的變化曲線。

        1.3.5 結晶溶液中分子聚集狀態(tài)表征 配制一定濃度(大于1 mg/ml)的溶菌酶溶液、[C8mim]Br 溶液以及溶菌酶-[C8mim]Br 混合溶液,通過動態(tài)光散射對溶液中的分子聚集體粒徑進行測定。測定前所有溶劑需采用0.22 μm 膜過濾。將動態(tài)光散射所測量的相關曲線與指數(shù)函數(shù)模型擬合,可計算出擴散系數(shù)(D),進一步運用Stokes-Einstein 方程[18],可得流體力學直徑,即聚集體的粒徑。Stokes-Einstein 方程可用式(1)表示:

        式中,DH表示流體力學直徑;k表示Boltzmann常數(shù);f表示粒子摩擦系數(shù);η表示溶劑黏度;T表示熱力學溫度;D表示擴散系數(shù)。

        1.3.6 溶菌酶溶液ζ-電勢測定 配制不同濃度的[C8mim]Br-溶菌酶混合溶液,用0.22 μm 膜過濾,4℃下靜置一周,待溶液體系穩(wěn)定,利用納米粒度分析儀測定溶液中的聚集體表面ζ-電勢。通過Henry方程計算ζ-電勢[19],Henry方程可用式(2)表示:

        式中,z表示ζ-電勢;UE表示電泳遷移率;ε表示介電常數(shù);η表示黏度;f(ka)表示Henry 函數(shù),對本研究體系取1.5。

        2 實驗結果與討論

        2.1 [C8mim]Br對溶菌酶晶體形貌和數(shù)量的影響

        溶菌酶晶體的顯微鏡形貌如圖1所示。圖1(a)為無[C8mim]Br存在時的晶體形貌,晶體表面存在明顯缺陷,且晶體尺寸不均一;加入[C8mim]Br后,晶體表面形貌明顯改善,缺陷減少,晶體尺寸更加均一,如圖1(b)~(f)所示。由此可見,[C8mim]Br 的加入對溶菌酶晶體形貌有改善作用。此外,[C8mim]Br的加入對晶體數(shù)量也有影響。與無添加劑時的結晶過程相比,加入低濃度[C8mim]Br(<0.06 mol/L)時,晶體數(shù)量略有減少;[C8mim]Br 加入量超過0.1 mol/L 后,晶體數(shù)量明顯減少;當[C8mim]Br 濃度超過0.3 mol/L后,晶體數(shù)量變化不大,如圖2所示。

        圖1 溶菌酶晶體顯微鏡形貌圖(比例尺:100 μm)Fig.1 Microgscope photos of lysozyme crystals(scale bars:100 μm)

        圖2 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶晶體數(shù)量Fig.2 Numbers of lysozyme crystals under different[C8mim]Br concentration

        2.2 離子液體對溶菌酶活性的影響

        采用比濁法,以溶壁微球菌為底物檢測離子液體對溶菌酶活性的影響,結果如圖3 所示。定義室溫25℃下,1 mg/ml 的溶菌酶溶液為標準樣,其酶活為1。實驗表明,加入不同濃度的[C8mim]Br 對溶菌酶的活性基本無影響。

        圖3 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶活性Fig.3 Lysozyme activity ratio under different[C8mim]Br concentration

        2.3 [C8mim]Br對溶菌酶溶解度的影響

        蛋白質的溶解度決定了過飽和度,影響著晶體的成核速率和生長速率[20]。測定了添加[C8mim]Br后的溶菌酶溶解度,結果如圖4所示。圖中顯示,當[C8mim]Br濃度<0.1mol/L時,溶菌酶的溶解度幾乎沒有變化;隨著[C8mim]Br濃度的增加(>0.1 mol/L),溶菌酶的溶解度開始增加,[C8mim]Br 濃度超過0.3 mol/L后,溶解度增加趨勢減慢。對溶菌酶而言,整個蛋白質分子由內到外,疏水殘基逐漸減少,親水殘基不斷增多[21]。高濃度[C8mim]Br 在溶菌酶溶液中聚集形成膠束,與溶菌酶相互作用,使溶菌酶的構象發(fā)生一定變化。溶菌酶表面親水殘基增多,疏水性降低[22],因此,在高濃度(>0.1 mol/L)的[C8mim]Br 中,溶解度增大。

        圖4 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶溶解度Fig.4 Solubility of lysozyme under different[C8mim]Br concentration

        2.4 [C8mim]Br對溶菌酶結晶動力學的影響

        不同濃度的[C8mim]Br 下結晶30 h 溶菌酶濃度變化趨勢如圖5 所示,初始狀態(tài)(0 h)時的蛋白質濃度保持一致。由圖5 可知,低[C8mim]Br 濃度下(0.02 mol/L 和0.06 mol/L 時),[C8mim]Br 加入后溶菌酶濃度下降過程比0 mol/L時更快,說明此時[C8mim]Br 對溶菌酶的結晶有促進作用;隨著[C8mim]Br 濃度的增加(>0.1 mol/L),溶菌酶濃度的下降過程比0 mol/L 時更慢,結晶有所緩慢;[C8mim]Br 濃度超過0.3 mol/L后,濃度變化趨勢差別不大,與晶體數(shù)量和溶解度數(shù)據(jù)相對應。由溶解度數(shù)據(jù)可知,高濃度[C8mim]Br 下,溶菌酶溶解度升高。因此,與0 mol/L相比,當初始濃度一致時,過飽和度降低,結晶速率降低。低濃度[C8mim]Br下,盡管過飽和度與0 mol/L相近,但結晶速率存在差異,可能與[C8mim]Br 的存在狀態(tài)有關。由此可見,[C8mim]Br的聚集狀態(tài)對溶菌酶的結晶過程有重要的影響。

        圖5 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶結晶動力學Fig.5 Lysozyme crystallization kinetics under different[C8mim]Br concentration

        2.5 [C8mim]Br與溶菌酶的作用機制

        溶菌酶是一種球形親水性蛋白質[23],分子量在14×103左右,含有18個陽離子氨基酸和12個陰離子氨基酸[24]。溶菌酶的穩(wěn)定性主要來源于氨基酸殘基之間的氫鍵和疏水作用[25]。因此,可以通過測定溶菌酶溶液中聚集狀態(tài)及其表面電勢來探究離子液體與蛋白質的相互作用[26]。

        圖6 表示不同濃度[C8mim]Br 下溶菌酶溶液的平均ζ-電勢。隨著[C8mim]Br濃度的增加,溶菌酶溶液的聚集體ζ-電勢變化呈現(xiàn)出三個階段。第一階段([C8mim]Br濃度0~0.04 mol/L),隨著[C8mim]Br濃度的升高,溶菌酶表面ζ-電勢升高;第二階段([C8mim]Br 濃度0.04~0.1 mol/L)溶菌酶表面ζ-電勢急劇下降;第三階段([C8mim]Br 濃度0.1~0.7 mol/L),溶液平均ζ-電勢緩慢下降至穩(wěn)定不變。

        圖6 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶聚集體ζ-電勢Fig.6 The ζ-potential of lysozyme under different[C8mim]Br concentration

        在第一階段,[C8mim]+濃度低,以單體形式存在,溶菌酶分子表面的疏水殘基與溶液中游離的[C8mim]+發(fā)生相互作用[27],使得溶菌酶表面ζ-電勢增加,此時,[C8mim]+與溶菌酶分子間主要為疏水作用[28]。在第二階段,溶液中的[C8mim]+濃度升高,更多[C8mim]+通過疏水作用集中在溶菌酶分子表面,此時部分[C8mim]+自發(fā)聚集形成不穩(wěn)定的“半膠束”狀態(tài)[26],因此溶菌酶表面ζ-電勢出現(xiàn)急劇下降。這一階段[C8mim]+與溶菌酶分子間依然以疏水作用為主。疏水作用對維持蛋白質穩(wěn)定性至關重要[25],[C8mim]+通過疏水相互作用與溶菌酶的疏水殘基相互融合,使溶菌酶分子表面疏水性略有增加。盡管溶解度幾乎不變,表面疏水性的改變可以促進蛋白質分子間的聚集,提高溶菌酶的結晶速率[29]。因此,當[C8mim]Br 濃度較低(<0.1 mol/L)時,溶菌酶的結晶過程加快。

        第三階段,溶液內[C8mim]+濃度持續(xù)升高至臨界膠束濃度,[C8mim]+自發(fā)聚集成膠束,溶液的平均ζ-電勢持續(xù)降低。由于溶液中游離的Br-濃度增加,與溶菌酶表面的雙電子層發(fā)生靜電作用;此外,實驗測得[C8mim]+膠束自身ζ-電勢約為5 mV,因此,隨著[C8mim]+膠束濃度的升高,溶液的平均ζ-電勢進一步降低。由于溶液中溶菌酶分子數(shù)量保持不變,隨著[C8mim]Br的增加,[C8mim]Br與溶菌酶分子間的相互作用位點達到飽和[30],因此在最后階段表現(xiàn)出ζ-電勢穩(wěn)定不變,與文獻中報道的趨勢一致[26]。由此可見,[C8mim]Br 與溶菌酶分子間的作用方式與[C8mim]Br的聚集狀態(tài)有關。

        蛋白質成核過程是分子進行有序聚集然后形成穩(wěn)定團簇的過程,是蛋白質結晶的決定階段[31]。實驗表明,[C8mim]Br 與溶菌酶之間的相互作用與[C8mim]Br的聚集狀態(tài)有關,因此通過動態(tài)光散射分別考察了溶液中溶菌酶與[C8mim]Br的聚集狀態(tài),如圖7所示。結果表明,[C8mim]Br溶液在濃度0.15 mol/L時,開始形成直徑約為3 nm 的聚集體,符合球狀膠束特征,與文獻中的臨界膠束濃度相接近[32],聚集體的尺寸隨著[C8mim]Br的濃度增加而增加,如圖7(a)所示??梢宰C明,高濃度的[C8mim]Br在溶液中能夠形成膠束聚集體。

        圖7 [C8mim]Br溶液中聚集體粒徑分布(a);結晶溶液中聚集體粒徑分布(b)Fig.7 Particle size distribution of aggregates in[C8mim]Br solution(a);Particle size distribution of aggregates in crystallization solution with protein and[C8mim]Br(b)

        如圖7(b)紅色曲線所示,溶菌酶純溶液中分子聚集體尺寸約為5 nm,與溶菌酶二聚體的尺寸相當。加入0.02 mol/L [C8mim]Br 后,聚集體尺寸略有增加[圖7(b)黑色曲線],說明有少量基團聚集在溶菌酶表面,導致溶菌酶聚集體尺寸變大,與ζ-電勢的結果相吻合。

        圖7(b)藍色與綠色曲線分別表示加入0.15 mol/L與0.3 mol/L[C8mim]Br后溶液中的聚集狀態(tài)。溶液中出現(xiàn)了3 nm左右和6 nm左右的兩種聚集體。3 nm處的峰表示溶菌酶單體[33],而6 nm 處的峰表示溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復合物。高濃度下,[C8mim]+自發(fā)形成的膠束可以與溶菌酶分子發(fā)生相互作用形成溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復合物,使得部分溶菌酶分子解聚為單體,因此出現(xiàn)了兩種類型的聚集體。

        圖8 所示為成核階段溶液聚集體的尺寸變化。曲線A 和B 分別表示加入0.3 mol/L [C8mim]Br 以及無[C8mim]Br 時的聚集體尺寸變化,可以看出加入0.3 mol/L[C8mim]Br后的聚集體尺寸明顯增大,約為無[C8mim]Br 時的聚集體尺寸兩倍。根據(jù)蛋白質結晶兩步成核理論,溶液中的溶質分子會首先聚集形成無序聚集體,當聚集體達到一定程度之后,會重新排列成有序狀態(tài),形成有序排列的晶核[34]。研究表明,對溶菌酶成核過程,聚集體的基本單元為八聚體[35]。結合圖7(b)的結果,可以推測,在無[C8mim]Br存在時,溶液中的溶菌酶分子首先形成聚集體,隨后重新排列形成晶核;與之相對,加入0.3 mol/L[C8mim]Br后,溶液中的溶菌酶首先解聚與[C8mim]Br膠束形成溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復合物,隨后以溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復合物為基本單元形成聚集體,進而成核。因此,與無[C8mim]Br 存在時相比,成核過程速率較慢,晶核數(shù)量較少。曲線C 和D 分別表示溶液中只含有溶菌酶與[C8mim]Br(不含沉淀劑)時聚集體的尺寸變化,可以看出隨著時間的增加,聚集體的尺寸穩(wěn)定不變,說明溶菌酶-[C8mim]Br膠束復合物可以較長時間保持穩(wěn)定,且單獨離子液體[C8mim]Br 并不能作為溶菌酶結晶過程的沉淀劑。

        圖8 成核階段聚集體尺寸變化Fig.8 Aggregates change during induction period

        3 結論

        本文研究了以離子液體[C8mim]Br 為添加劑時溶菌酶的結晶過程。[C8mim]Br作為添加劑能明顯改善溶菌酶晶體形貌。[C8mim]Br對結晶過程的影響隨添加的濃度改變。[C8mim]Br濃度較低(<0.1 mol/L)時對溶菌酶的結晶過程有促進作用,而高濃度[C8mim]Br(>0.1 mol/L)可以減緩溶菌酶的結晶過程。研究表明,當濃度超過0.15 mol/L 時,[C8mim]Br可以在溶液中形成膠束聚集體,故[C8mim]Br 的作用機制與[C8mim]Br 的聚集狀態(tài)有關。當[C8mim]Br 濃度較低時(<0.1 mol/L),[C8mim]Br 以單分子形式與溶菌酶發(fā)生疏水作用,促進溶菌酶分子聚集,提高結晶速率。當[C8mim]Br濃度增加時,[C8mim]Br開始與溶菌酶分子形成復合聚集體,并以該聚集體為基本單元形成無序聚集體,進而成核,故晶核數(shù)量減少,成核速率減慢。

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