于筱溪，閆真真，蔣其輝，吳霞，張余曉，王曉娟，黃方，3

（1 中國石油大學（華東）化學工程學院，山東青島 266580；2 中國石油集團工程技術研究院有限公司井下作業(yè)研究所，北京 102206；3 中國石油大學（華東）重質油國家重點實驗室，山東青島 266580）

引言

蛋白質結晶是生命科學領域的研究熱點之一。蛋白質晶體具有較高的孔隙率和生物相容性[1],在藥物輸送、生物傳感和生物催化等方面有著潛在的應用可能;此外,蛋白質的三維結構是藥物設計的前提[2],X 射線衍射是現(xiàn)階段解析蛋白質三維結構的主要手段之一[3],高質量蛋白質晶體的培養(yǎng)是這一技術的關鍵。由此可見,蛋白質結晶過程對蛋白質工程、藥物設計[4]和藥物輸送等領域都有著舉足輕重的地位。

由于蛋白質分子量大,對環(huán)境極度敏感,蛋白質分子的有序聚集過程難度大且不易控制[5]。諸多研究表明,在結晶體系中加入小分子添加劑有助于蛋白質分子聚集成核[6],離子液體就是其中的一種[7]。離子液體由陽離子和陰離子組成,其生物相容性高,結構具有很大的設計性[8]。將離子液體作為添加劑引入蛋白質結晶過程,能夠顯著提高晶體尺寸,優(yōu)化晶體的衍射質量[9],在蛋白質結晶的研究領域越來越受到關注。Chen 等[10]通過在溶菌酶結晶溶液中添加1,3-丁基咪唑氯化物,得到尺寸大、衍射質量高的溶菌酶晶體。Judge 等[11]證明了用離子液體作為添加劑后,過氧化氫酶、肌紅蛋白、胰蛋白酶、葡萄糖異構酶等晶體的X 射線衍射分辨率優(yōu)于沒有添加離子液體的蛋白質晶體。本文選擇溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br)作為添加劑。作為化學反應中優(yōu)良的綠色替代溶劑，咪唑類離子液體有較高的生物相容性和低毒性[12]。從化學結構上看，[C8mim]Br 的溶解性好，具有類似陽離子表面活性劑的咪唑親水基團和疏水烷基鏈，是一類新型表面活性劑[8]；Zheng 等[13]發(fā)現(xiàn)，咪唑類離子液體的表面活性優(yōu)于同碳鏈長度的傳統(tǒng)表面活性劑。因此[C8mim]Br 在溶液中能夠有序聚集[14]，根據(jù)溶液性質的不同可以形成膠束、液晶、凝膠、囊泡或微乳液等，拓展了傳統(tǒng)表面活性劑的聚集特征[15]。由此可知，離子液體[C8mim]Br 與蛋白質之間的相互作用較為復雜，可能改變蛋白質的構象與聚集狀態(tài)[16]，影響蛋白質的結晶過程。選擇溶菌酶為研究對象，研究了[C8mim]Br 聚集狀態(tài)對溶菌酶結晶的影響，通過測定溶菌酶結晶熱力學與動力學數(shù)據(jù)，采用動態(tài)光散射監(jiān)測溶液中聚集體的變化趨勢，利用ζ-電勢考察離子液體與蛋白質之間的相互作用，對離子液體對蛋白質結晶過程的影響機制進行了探討。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

雞蛋白溶菌酶，購自上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司；溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br)，購自上海成捷化學有限公司，純度99%；溶壁微球菌粉，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；氯化鈉(分析純)；乙酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗設備

倒置熒光顯微鏡，上海徠卡顯微系統(tǒng)貿易有限公司；納米粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；紫外分光光度計，上海島津儀器有限公司；恒溫水浴槽,上海先歐科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶菌酶的結晶 溶菌酶結晶采用分批結晶法：依次吸取100 μl溶菌酶溶液(20、28、36、40 mg/ml)、100 μl 氯化鈉溶液(質量分數(shù)8%)、10 μl 不同濃度的[C8mim]Br 溶液置于96 孔細胞板中，4℃下結晶。所有溶液均在pH4.5、0.1 mol/L 的乙酸鈉緩沖溶液中配制。

1.3.2 溶菌酶活性測定 溶菌酶活性檢測方法參考文獻[17]的溶菌酶活性簡易測定，以無菌操作方式，將溶壁微球菌種子菌液按照1∶100 的比例接種至100 ml LB 液體培養(yǎng)基中，進行菌株的擴大培養(yǎng)，在37℃搖床中培養(yǎng)至450 nm 處吸光度值為1.300±0.010 的菌懸液。使用1 cm 光徑4 ml 容量的比色皿，吸取2.5 ml 450 nm 處吸光度值為1.300±0.010的菌懸液，加入0.5 ml 相應酶反應液(溶菌酶溶液、溶菌酶與離子液體的混合溶液)混勻立即計時，于25℃分別記錄10 s 和70 s 時450 nm 處吸光度值A1和A2，并計算其差值的絕對值。檢測前采用相應的緩沖液調零。

1.3.3 溶菌酶溶解度測定 配制一系列已知濃度的溶菌酶系列標準溶液，利用紫外分光光度計，測量其在280 nm 處的吸光值，繪制溶菌酶濃度的標準曲線。配制一系列[C8mim]Br濃度梯度溶菌酶懸浮液，在4℃下溫和攪拌至溶液達到平衡，取200 μl平衡懸浮液離心(14000 r/min、15 min)，用紫外分光光度計檢測上清液在280 nm 處的吸光度值，計算溶菌酶在此條件下的平衡濃度。

1.3.4 溶菌酶結晶動力學測定 配制一系列[C8mim]Br 濃度梯度溶菌酶結晶溶液，迅速降溫至4℃并保持恒溫，每隔2 h 取500 μl 溶液離心(14000 r/min、15 min)，將上清液稀釋20倍，利用紫外分光光度計檢測上清液在280 nm 處的吸光度值，得到溶菌酶溶液濃度隨結晶時間的變化曲線。

1.3.5 結晶溶液中分子聚集狀態(tài)表征 配制一定濃度(大于1 mg/ml)的溶菌酶溶液、[C8mim]Br 溶液以及溶菌酶-[C8mim]Br 混合溶液，通過動態(tài)光散射對溶液中的分子聚集體粒徑進行測定。測定前所有溶劑需采用0.22 μm 膜過濾。將動態(tài)光散射所測量的相關曲線與指數(shù)函數(shù)模型擬合，可計算出擴散系數(shù)(D)，進一步運用Stokes-Einstein 方程[18]，可得流體力學直徑，即聚集體的粒徑。Stokes-Einstein 方程可用式(1)表示:

式中，DH表示流體力學直徑；k表示Boltzmann常數(shù)；f表示粒子摩擦系數(shù)；η表示溶劑黏度；T表示熱力學溫度；D表示擴散系數(shù)。

1.3.6 溶菌酶溶液ζ-電勢測定 配制不同濃度的[C8mim]Br-溶菌酶混合溶液，用0.22 μm 膜過濾，4℃下靜置一周，待溶液體系穩(wěn)定，利用納米粒度分析儀測定溶液中的聚集體表面ζ-電勢。通過Henry方程計算ζ-電勢[19]，Henry方程可用式(2)表示：

式中，z表示ζ-電勢；UE表示電泳遷移率；ε表示介電常數(shù)；η表示黏度；f(ka)表示Henry 函數(shù)，對本研究體系取1.5。

2 實驗結果與討論

2.1 ［C8mim］Br對溶菌酶晶體形貌和數(shù)量的影響

溶菌酶晶體的顯微鏡形貌如圖1所示。圖1（a）為無[C8mim]Br存在時的晶體形貌，晶體表面存在明顯缺陷，且晶體尺寸不均一；加入[C8mim]Br后，晶體表面形貌明顯改善，缺陷減少，晶體尺寸更加均一，如圖1（b）～（f）所示。由此可見，[C8mim]Br 的加入對溶菌酶晶體形貌有改善作用。此外，[C8mim]Br的加入對晶體數(shù)量也有影響。與無添加劑時的結晶過程相比，加入低濃度[C8mim]Br(＜0.06 mol/L)時，晶體數(shù)量略有減少；[C8mim]Br 加入量超過0.1 mol/L 后，晶體數(shù)量明顯減少；當[C8mim]Br 濃度超過0.3 mol/L后，晶體數(shù)量變化不大，如圖2所示。

圖1 溶菌酶晶體顯微鏡形貌圖（比例尺:100 μm）Fig.1 Microgscope photos of lysozyme crystals(scale bars：100 μm)

圖2 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶晶體數(shù)量Fig.2 Numbers of lysozyme crystals under different[C8mim]Br concentration

2.2 離子液體對溶菌酶活性的影響

采用比濁法，以溶壁微球菌為底物檢測離子液體對溶菌酶活性的影響，結果如圖3 所示。定義室溫25℃下，1 mg/ml 的溶菌酶溶液為標準樣，其酶活為1。實驗表明，加入不同濃度的[C8mim]Br 對溶菌酶的活性基本無影響。

圖3 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶活性Fig.3 Lysozyme activity ratio under different[C8mim]Br concentration

2.3 ［C8mim］Br對溶菌酶溶解度的影響

蛋白質的溶解度決定了過飽和度，影響著晶體的成核速率和生長速率[20]。測定了添加[C8mim]Br后的溶菌酶溶解度，結果如圖4所示。圖中顯示，當[C8mim]Br濃度＜0.1mol/L時，溶菌酶的溶解度幾乎沒有變化；隨著[C8mim]Br濃度的增加(＞0.1 mol/L)，溶菌酶的溶解度開始增加，[C8mim]Br 濃度超過0.3 mol/L后，溶解度增加趨勢減慢。對溶菌酶而言，整個蛋白質分子由內到外，疏水殘基逐漸減少，親水殘基不斷增多[21]。高濃度[C8mim]Br 在溶菌酶溶液中聚集形成膠束，與溶菌酶相互作用，使溶菌酶的構象發(fā)生一定變化。溶菌酶表面親水殘基增多，疏水性降低[22]，因此，在高濃度(＞0.1 mol/L)的[C8mim]Br 中，溶解度增大。

圖4 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶溶解度Fig.4 Solubility of lysozyme under different[C8mim]Br concentration

2.4 ［C8mim］Br對溶菌酶結晶動力學的影響

不同濃度的[C8mim]Br 下結晶30 h 溶菌酶濃度變化趨勢如圖5 所示，初始狀態(tài)(0 h)時的蛋白質濃度保持一致。由圖5 可知，低[C8mim]Br 濃度下(0.02 mol/L 和0.06 mol/L 時)，[C8mim]Br 加入后溶菌酶濃度下降過程比0 mol/L時更快，說明此時[C8mim]Br 對溶菌酶的結晶有促進作用；隨著[C8mim]Br 濃度的增加(＞0.1 mol/L)，溶菌酶濃度的下降過程比0 mol/L 時更慢，結晶有所緩慢；[C8mim]Br 濃度超過0.3 mol/L后，濃度變化趨勢差別不大，與晶體數(shù)量和溶解度數(shù)據(jù)相對應。由溶解度數(shù)據(jù)可知，高濃度[C8mim]Br 下，溶菌酶溶解度升高。因此，與0 mol/L相比，當初始濃度一致時，過飽和度降低，結晶速率降低。低濃度[C8mim]Br下，盡管過飽和度與0 mol/L相近，但結晶速率存在差異，可能與[C8mim]Br 的存在狀態(tài)有關。由此可見，[C8mim]Br的聚集狀態(tài)對溶菌酶的結晶過程有重要的影響。

圖5 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶結晶動力學Fig.5 Lysozyme crystallization kinetics under different[C8mim]Br concentration

2.5 ［C8mim］Br與溶菌酶的作用機制

溶菌酶是一種球形親水性蛋白質[23]，分子量在14×103左右，含有18個陽離子氨基酸和12個陰離子氨基酸[24]。溶菌酶的穩(wěn)定性主要來源于氨基酸殘基之間的氫鍵和疏水作用[25]。因此，可以通過測定溶菌酶溶液中聚集狀態(tài)及其表面電勢來探究離子液體與蛋白質的相互作用[26]。

圖6 表示不同濃度[C8mim]Br 下溶菌酶溶液的平均ζ-電勢。隨著[C8mim]Br濃度的增加，溶菌酶溶液的聚集體ζ-電勢變化呈現(xiàn)出三個階段。第一階段([C8mim]Br濃度0～0.04 mol/L)，隨著[C8mim]Br濃度的升高，溶菌酶表面ζ-電勢升高；第二階段([C8mim]Br 濃度0.04～0.1 mol/L)溶菌酶表面ζ-電勢急劇下降；第三階段([C8mim]Br 濃度0.1～0.7 mol/L)，溶液平均ζ-電勢緩慢下降至穩(wěn)定不變。

圖6 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶聚集體ζ-電勢Fig.6 The ζ-potential of lysozyme under different[C8mim]Br concentration

在第一階段，[C8mim]+濃度低，以單體形式存在，溶菌酶分子表面的疏水殘基與溶液中游離的[C8mim]+發(fā)生相互作用[27]，使得溶菌酶表面ζ-電勢增加，此時，[C8mim]+與溶菌酶分子間主要為疏水作用[28]。在第二階段，溶液中的[C8mim]+濃度升高，更多[C8mim]+通過疏水作用集中在溶菌酶分子表面，此時部分[C8mim]+自發(fā)聚集形成不穩(wěn)定的“半膠束”狀態(tài)[26]，因此溶菌酶表面ζ-電勢出現(xiàn)急劇下降。這一階段[C8mim]+與溶菌酶分子間依然以疏水作用為主。疏水作用對維持蛋白質穩(wěn)定性至關重要[25]，[C8mim]+通過疏水相互作用與溶菌酶的疏水殘基相互融合，使溶菌酶分子表面疏水性略有增加。盡管溶解度幾乎不變，表面疏水性的改變可以促進蛋白質分子間的聚集，提高溶菌酶的結晶速率[29]。因此，當[C8mim]Br 濃度較低(＜0.1 mol/L)時，溶菌酶的結晶過程加快。

第三階段，溶液內[C8mim]+濃度持續(xù)升高至臨界膠束濃度，[C8mim]+自發(fā)聚集成膠束，溶液的平均ζ-電勢持續(xù)降低。由于溶液中游離的Br-濃度增加，與溶菌酶表面的雙電子層發(fā)生靜電作用；此外，實驗測得[C8mim]+膠束自身ζ-電勢約為5 mV，因此，隨著[C8mim]+膠束濃度的升高，溶液的平均ζ-電勢進一步降低。由于溶液中溶菌酶分子數(shù)量保持不變，隨著[C8mim]Br的增加，[C8mim]Br與溶菌酶分子間的相互作用位點達到飽和[30]，因此在最后階段表現(xiàn)出ζ-電勢穩(wěn)定不變，與文獻中報道的趨勢一致[26]。由此可見，[C8mim]Br 與溶菌酶分子間的作用方式與[C8mim]Br的聚集狀態(tài)有關。

蛋白質成核過程是分子進行有序聚集然后形成穩(wěn)定團簇的過程，是蛋白質結晶的決定階段[31]。實驗表明，[C8mim]Br 與溶菌酶之間的相互作用與[C8mim]Br的聚集狀態(tài)有關，因此通過動態(tài)光散射分別考察了溶液中溶菌酶與[C8mim]Br的聚集狀態(tài)，如圖7所示。結果表明，[C8mim]Br溶液在濃度0.15 mol/L時，開始形成直徑約為3 nm 的聚集體，符合球狀膠束特征，與文獻中的臨界膠束濃度相接近[32]，聚集體的尺寸隨著[C8mim]Br的濃度增加而增加，如圖7（a）所示?？梢宰C明，高濃度的[C8mim]Br在溶液中能夠形成膠束聚集體。

圖7 [C8mim]Br溶液中聚集體粒徑分布(a);結晶溶液中聚集體粒徑分布(b)Fig.7 Particle size distribution of aggregates in[C8mim]Br solution(a);Particle size distribution of aggregates in crystallization solution with protein and[C8mim]Br(b)

如圖7（b）紅色曲線所示，溶菌酶純溶液中分子聚集體尺寸約為5 nm，與溶菌酶二聚體的尺寸相當。加入0.02 mol/L [C8mim]Br 后，聚集體尺寸略有增加[圖7(b)黑色曲線]，說明有少量基團聚集在溶菌酶表面，導致溶菌酶聚集體尺寸變大，與ζ-電勢的結果相吻合。

圖7（b）藍色與綠色曲線分別表示加入0.15 mol/L與0.3 mol/L[C8mim]Br后溶液中的聚集狀態(tài)。溶液中出現(xiàn)了3 nm左右和6 nm左右的兩種聚集體。3 nm處的峰表示溶菌酶單體[33]，而6 nm 處的峰表示溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復合物。高濃度下，[C8mim]+自發(fā)形成的膠束可以與溶菌酶分子發(fā)生相互作用形成溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復合物，使得部分溶菌酶分子解聚為單體，因此出現(xiàn)了兩種類型的聚集體。

圖8 所示為成核階段溶液聚集體的尺寸變化。曲線A 和B 分別表示加入0.3 mol/L [C8mim]Br 以及無[C8mim]Br 時的聚集體尺寸變化，可以看出加入0.3 mol/L[C8mim]Br后的聚集體尺寸明顯增大，約為無[C8mim]Br 時的聚集體尺寸兩倍。根據(jù)蛋白質結晶兩步成核理論，溶液中的溶質分子會首先聚集形成無序聚集體，當聚集體達到一定程度之后，會重新排列成有序狀態(tài)，形成有序排列的晶核[34]。研究表明，對溶菌酶成核過程，聚集體的基本單元為八聚體[35]。結合圖7（b）的結果，可以推測，在無[C8mim]Br存在時，溶液中的溶菌酶分子首先形成聚集體，隨后重新排列形成晶核；與之相對，加入0.3 mol/L[C8mim]Br后，溶液中的溶菌酶首先解聚與[C8mim]Br膠束形成溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復合物，隨后以溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復合物為基本單元形成聚集體，進而成核。因此，與無[C8mim]Br 存在時相比，成核過程速率較慢，晶核數(shù)量較少。曲線C 和D 分別表示溶液中只含有溶菌酶與[C8mim]Br(不含沉淀劑)時聚集體的尺寸變化，可以看出隨著時間的增加，聚集體的尺寸穩(wěn)定不變，說明溶菌酶-[C8mim]Br膠束復合物可以較長時間保持穩(wěn)定，且單獨離子液體[C8mim]Br 并不能作為溶菌酶結晶過程的沉淀劑。

圖8 成核階段聚集體尺寸變化Fig.8 Aggregates change during induction period

3 結論

本文研究了以離子液體[C8mim]Br 為添加劑時溶菌酶的結晶過程。[C8mim]Br作為添加劑能明顯改善溶菌酶晶體形貌。[C8mim]Br對結晶過程的影響隨添加的濃度改變。[C8mim]Br濃度較低(＜0.1 mol/L)時對溶菌酶的結晶過程有促進作用，而高濃度[C8mim]Br(＞0.1 mol/L)可以減緩溶菌酶的結晶過程。研究表明，當濃度超過0.15 mol/L 時，[C8mim]Br可以在溶液中形成膠束聚集體，故[C8mim]Br 的作用機制與[C8mim]Br 的聚集狀態(tài)有關。當[C8mim]Br 濃度較低時(＜0.1 mol/L)，[C8mim]Br 以單分子形式與溶菌酶發(fā)生疏水作用，促進溶菌酶分子聚集，提高結晶速率。當[C8mim]Br濃度增加時，[C8mim]Br開始與溶菌酶分子形成復合聚集體，并以該聚集體為基本單元形成無序聚集體，進而成核，故晶核數(shù)量減少，成核速率減慢。