李南星，張麟

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350）

引言

哮喘是一種慢性支氣管疾病[1]。其發(fā)生是由于先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細胞與上皮細胞共同作用，導(dǎo)致支氣管超反應(yīng)性(哮喘患者平滑肌細胞對冷空氣和運動等非特異性刺激的反應(yīng)趨勢)、黏液分泌過多、氣道壁重塑和氣道狹窄[2]。在易感患者中，會反復(fù)出現(xiàn)呼吸短促、喘息和胸悶等癥狀[1,3]。目前全球哮喘患者約有3億[1-2,4]，每年有25萬～35萬人死于哮喘[5-6]，導(dǎo)致對哮喘疾病的大量醫(yī)療支出。該病在發(fā)達國家成人中的發(fā)病率約為10%[3]。哮喘疾病已經(jīng)對世界經(jīng)濟和社會發(fā)展造成極大負面影響，是人類社會面臨的一個健康難題和挑戰(zhàn)。

嗜酸性粒細胞炎癥是哮喘中主要的炎癥類型，由其導(dǎo)致的哮喘約占全部嚴重哮喘的40%～60%[6-8]。1853 年，Charcot 報道了哮喘患者氣道中的細胞外雙錐體晶體，Leyden 在1872 年也有類似報道[9]，該晶體后被命名為Charcot-Leyden 晶體(CLCs)。在慢性鼻竇炎、寄生蟲感染和伴有組織嗜酸性粒細胞的癌癥中也觀察到類似的晶體[10-11]。CLCs是嗜酸性粒細胞死亡的一個標(biāo)志，可以在組織中存活數(shù)月。CLCs 由人類嗜酸性細胞中最豐富的蛋白質(zhì)之一Galectin-10(Gal10)組成[12]。Gal10 從活化的嗜酸性粒細胞的細胞質(zhì)中被釋放出來，經(jīng)歷相變成為晶體進而引發(fā)哮喘疾病。已有研究表明，使用Gal10晶體誘導(dǎo)動物免疫反應(yīng)可以產(chǎn)生抗體，抗體可以快速溶解患者黏液中大量存在的CLCs，在臨床前模型中解決CLC 晶體病變的關(guān)鍵特征，研究認為抗體結(jié)合在Gal10 晶體的關(guān)鍵表位Y69 處介導(dǎo)晶體堆積作用導(dǎo)致晶體溶解，定點突變Gal10 蛋白的Y69 確可使得Gal10蛋白不再結(jié)晶[13]。

目前臨床上治療哮喘大多基于疾病嚴重程度使用經(jīng)驗方法，而不是基于潛在的發(fā)病機制。通常使用擴張支氣管和抗炎抗過敏藥物[14-16]來緩解癥狀。單克隆抗體藥物[17-20]雖然靶向于一些致病靶點，但其治療成本非常高。因此，針對嗜酸性粒細胞性炎癥哮喘，解析Gal10 蛋白結(jié)晶或溶解中涉及的關(guān)鍵作用位點和相互作用分子細節(jié)，由此設(shè)計多肽抑制劑以抑制哮喘，具有重要研究意義。

本課題組前期已經(jīng)基于蛋白質(zhì)表界面研究[21]，設(shè)計開發(fā)靶向于膠原蛋白的血栓抑制劑[22-26]、病毒樣顆粒配基[27-28]、埃博拉病毒中和配體[29]等。本文沿用蛋白質(zhì)表界面分析流程，利用分子動力學(xué)模擬和結(jié)合自由能分析方法確定Gal10 蛋白與抗體結(jié)合作用的關(guān)鍵位點和相互作用分子細節(jié)，通過構(gòu)建親和模型、建立多肽抑制劑庫以篩選確定高效的哮喘抑制劑。

1 實驗?zāi)Ｐ秃头椒?/h2>

1.1 模型

哮喘溶晶抗體1D11 與Gal10 蛋白結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)來源于Protein Data Bank(PDB ID 6GLW，http://www.rcsb.org/pdb/)[13]，采 用GROMOS96 43a1力場。模擬環(huán)境為生理鹽水溶液并通過反離子平衡系統(tǒng)凈電荷，其中水分子采用SPC/E 模型。模擬體系的盒子尺寸為13 nm×13 nm×9 nm，包含46989 個水分子、137個鈉離子和139個氯離子。

1.2 分子動力學(xué)模擬

采用GROMACS 5.1.4[30](http://www.gromacs.org/)進行50 ns 正則(NVT)系綜分子動力學(xué)(molecular dynamics，MD)模擬。系統(tǒng)溫度通過velocity-rescale(v-rescale)[31]方法維持在310.15 K。使用LINCS[32](Linear Constraint Solver)算法限制共價鍵和鍵角的震動。使用三維周期性邊界條件。靜電相互作用通過PME[33](Particle-mesh Ewald)算法處理。相鄰原子截斷距離、庫侖截斷距離以及LJ(Lennard-Jones)勢能截斷距離都設(shè)定為1.2 nm。粒子初始速度根據(jù)310.15 K 溫度下的Maxwell 分布獲得。模擬采用Verlet 算法，積分步長設(shè)定為2 fs。各體系于模擬開始前都經(jīng)歷能量最小化。模擬過程至少重復(fù)三次。

1.3 結(jié)合自由能分析

通過分子力學(xué)-泊松-玻爾茲曼方程-表面積(MM-PBSA)[34]自由能分析方法和g_mmpbsa[35]程序解析溶晶抗體1D11與Gal10蛋白的結(jié)合自由能(ΔGbind)以及結(jié)合界面的關(guān)鍵氨基酸位點。結(jié)合自由能根據(jù)如下方程進行計算，從每次模擬的50 ns軌跡中以100 ps為間隔提取500個軌跡進行分析。

式中，ΔGbind是結(jié)合自由能；ΔGpolar是極性自由能；ΔGnonpolar是非極性自由能；ΔGelec是靜電相互自由能；ΔGPB是靜電溶劑化效應(yīng)產(chǎn)生的自由能；ΔGvdW是范德華相互自由能；ΔGSASA是非極性溶劑化效應(yīng)產(chǎn)生的自由能。

1.4 多肽抑制劑的親和模型及肽庫構(gòu)建

基于MM-PBSA 自由能解析獲得的溶晶抗體1D11中與Gal10蛋白結(jié)合關(guān)鍵位點信息構(gòu)建親和模型，結(jié)合空間方位確定抑制劑序列，利用自編腳本生成多肽抑制劑庫。

1.5 多肽抑制劑的分子對接篩選

利用分子對接、多肽抑制劑構(gòu)象分析進行抑制劑篩選。分子對接以Gal10 蛋白作為受體，多肽抑制劑作為配體，采用AUTODOCK VINA 1.1.2[36](http://vina.scripps.edu/)進行分子對接。通過打分(EVINA)評估結(jié)合作用，根據(jù)打分分布情況選擇多肽抑制劑進行后續(xù)篩選。

利用GROMACS 程序計算多肽抑制劑與溶晶抗體1D11 中關(guān)鍵殘基間的均方根偏差(root-meansquare deviation，RMSD)。篩選RMSD≤0.5 nm 的多肽抑制劑進行后續(xù)篩選。

1.6 多肽抑制劑與Gal10 蛋白作用的分子動力學(xué)模擬

在通過對接結(jié)構(gòu)分析評估多肽抑制劑與Gal10蛋白間結(jié)合結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，利用MD 模擬研究結(jié)合的動態(tài)過程及其微觀相互作用。MD模擬設(shè)置同1.2節(jié)所述。使用editconf 命令將多肽抑制劑與Gal10 蛋白的最小距離調(diào)整為1.5 nm，并選擇未調(diào)整距離的結(jié)合復(fù)合物作為對照，分別為Sep體系和Com體系。

1.7 多肽抑制劑抑制效果驗證

通過Gal10蛋白-溶晶抗體-多肽抑制劑三元體系的MD 模擬，研究多肽抑制劑與溶晶抗體1D11 同時存在情況下抑制劑與Gal10 蛋白的結(jié)合情況，以評估多肽抑制劑的抑制效果。采用NVT 系綜模擬，計算RMSD 和回轉(zhuǎn)半徑(radius of gyration,Rg)評估分子構(gòu)象變化，計算分子間最小距離dmin、質(zhì)心距離dcom、LJ 勢能(ELJ)、Coulomb 勢能(EC)評估分子間結(jié)合過程。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 蛋白復(fù)合物的分子行為

通過50 ns MD 模擬考察Gal10 蛋白與溶晶抗體1D11 在生理鹽水中的分子行為，如圖1 所示。結(jié)果顯示，模擬過程中蛋白與抗體間的最小距離dmin基本保持在0.17 nm，表明復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Coulomb勢能和LJ勢能為負值，表明靜電作用和疏水相互作用驅(qū)動蛋白與抗體間結(jié)合。相對于溶晶抗體，Gal10蛋白的RMSD 值更小，表明Gal10 蛋白分子結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定而溶晶抗體結(jié)構(gòu)相對易變。蛋白與抗體的Rg值隨模擬變化都較小，表明二者結(jié)構(gòu)緊密。

圖1 Gal10蛋白與溶晶抗體1D11間相互作用分析Fig.1 Molecular interactions between Gal10 protein and antibody 1D11

2.2 結(jié)合自由能解析

通過MM-PBSA 自由能分解計算溶晶抗體1D11與Gal10 蛋白的結(jié)合自由能。ΔGelec=-231 kcal·mol-1（1 cal=4.18 J），ΔGvdW=-75 kcal·mol-1，ΔGSASA=-7 kcal·mol-1，表明靜電相互作用、范德華相互作用及非極性溶劑化效應(yīng)均對結(jié)合起有利作用。ΔGPB=247 kcal·mol-1，表明靜電溶劑化效應(yīng)對結(jié)合起不利作用。根據(jù)1.3節(jié)所述自由能計算方程，ΔGpolar=16 kcal·mol-1，ΔGnonpolar=-82 kcal·mol-1，最終結(jié)合自由能ΔGbind=-66 kcal·mol-1，表明疏水相互作用促進結(jié)合，考慮溶劑效應(yīng)后靜電相互作用對結(jié)合不利，因而二者結(jié)合主要由疏水相互作用驅(qū)動。

計算結(jié)合界面上各氨基酸殘基的結(jié)合自由能，如圖2 所示。確定Gal10 蛋白的Y69、K117、D113、E68、I116、H114，溶晶抗體1D11 的W53-H、Y104-H、N97-L、K55-L、Y93-L、R100-H 對結(jié)合比較有利，其中W53-H為疏水氨基酸殘基。對結(jié)合不利的主要為帶電氨基酸殘基，如Gal10 蛋白中的K73、R115、E119 及溶晶抗體1D11 中的E52-L、D99-H。綜合前述結(jié)合自由能分析，確認疏水作用是Gal10蛋白和溶晶抗體1D11結(jié)合的主要驅(qū)動力，同時也證實Y69 在蛋白與抗體結(jié)合過程確有關(guān)鍵作用，與文獻報道[13]結(jié)果相符。

圖2 Gal10蛋白與溶晶抗體1D11的相互作用界面分析Fig.2 Molecular interface between Gal10 protein and antibody 1D11

2.3 親和模型的構(gòu)建與多肽抑制劑庫的建立

以溶晶抗體1D11 關(guān)鍵作用位點為基礎(chǔ)構(gòu)建親和模型并建立多肽抑制劑庫，綜合考慮位點距離和自由能貢獻大小，選取W53-H、Y104-H、N97-L、Y93-L 構(gòu)建親和模型，如圖3 所示。結(jié)合空間方位設(shè)計得到多肽抑制劑特征序列WXYXXNXY(其中X代表20 種常見氨基酸的任意一種)。利用自編腳本生成多肽抑制劑庫，保證抑制劑庫內(nèi)的序列多樣性及構(gòu)象多樣性。

圖3 基于Gal10蛋白與溶晶抗體1D11相互作用的抑制劑設(shè)計Fig.3 Design of inhibitors based on the molecular interactions between Gal10 protein and antibody 1D11

2.4 多肽抑制劑的分子模擬篩選

利用AUTODOCK VINA 將多肽抑制劑與Gal10蛋白依次進行對接。對接結(jié)果顯示多肽抑制劑結(jié)合打分(EVINA)分布在-8.3～-3.6 kcal/mol 范圍內(nèi)，表明所有多肽抑制劑都能與Gal10 蛋白自發(fā)結(jié)合，但由于多肽抑制劑序列和構(gòu)象的差異而表現(xiàn)出對Gal10蛋白不同的親和力。根據(jù)多肽抑制劑結(jié)合打分分布情況，綜合考慮后續(xù)篩選步驟，確定以結(jié)合自由能≤-7.5 kcal/mol 為標(biāo)準(zhǔn)，獲得209 個多肽抑制劑進行后續(xù)篩選。

利用GROMACS 程序計算多肽抑制劑與溶晶抗體1D11 關(guān)鍵殘基間的RMSD 值，以確定二者結(jié)構(gòu)相似性，即考察抑制劑模擬溶晶抗體1D11 關(guān)鍵位點的效果。結(jié)果顯示，RMSD 值分布在0.3～1 nm范圍內(nèi)。以RMSD≤0.5nm 為標(biāo)準(zhǔn)，獲得17 個多肽抑制劑進行后續(xù)篩選。利用VMD 軟件進行構(gòu)象比對和結(jié)合位點分析，結(jié)果最好的10 個多肽抑制劑如圖4所示。

圖4 溶晶抗體1D11關(guān)鍵殘基與多肽抑制劑的構(gòu)象比對Fig.4 Conformational comparison between the key residues of the antibody 1D11 and polypeptide inhibitors

2.5 多肽抑制劑與Gal10的分子動力學(xué)模擬

結(jié)合對接結(jié)果EVINA、結(jié)構(gòu)相似性分析RMSD 及構(gòu)象比對結(jié)果，選取6個多肽抑制劑進行后續(xù)MD模擬驗證，具體信息如表1所示。

表1 抑制劑篩選結(jié)果Table 1 Results of inhibitor screening

多肽抑制劑與Gal10 蛋白的結(jié)合情況如圖5 所示。在生理鹽水環(huán)境下，Sep 體系中人為分開的WGYGWNGY和Gal10蛋白間，最小距離經(jīng)歷3 ns左右的波動后達到穩(wěn)定波動，質(zhì)心距離逐漸變小并在4 ns左右達到穩(wěn)定波動，表明抑制劑能夠和Gal10蛋白結(jié)合迅速且穩(wěn)定。Sep 體系中的WGYGWNGY 的RMSD 值略大于Com 體系，表明結(jié)合過程中抑制劑存在結(jié)構(gòu)變化。能量分析顯示，Gal10 蛋白和WGYGWNGY 間的Coulomb 勢能和LJ 勢能從2 ns 左右開始減小，且隨著多肽抑制劑結(jié)構(gòu)逐步穩(wěn)定，Coulomb 勢能和LJ 勢能的變化也趨于穩(wěn)定，能量變化趨勢和大小與Com 體系基本一致，確證其穩(wěn)定結(jié)合。軌跡中截取構(gòu)象表明WGYGWNGY 結(jié)合在Gal10蛋白的關(guān)鍵位點附近。

圖5 Gal10蛋白與WGYGWNGY相互作用情況Fig.5 Molecular interactions between Gal10 protein and WGYGWNGY

2.6 多肽抑制劑抑制效果驗證

對Gal10蛋白-溶晶抗體-多肽抑制劑三元體系進行MD 模擬，結(jié)果如圖6 所示。WGYGWNGY 與Gal10蛋白間的最小距離在5 ns內(nèi)降低至0.1 nm，質(zhì)心距離同步降低至2 nm，后續(xù)呈現(xiàn)穩(wěn)定波動，相互作用勢能也在4 ns 左右開始降低，表明WGYGWNGY快速結(jié)合到Gal10 蛋白表面。在WGYGWNGY 與Gal10蛋白結(jié)合期間，溶晶抗體1D11逐漸遠離Gal10蛋白，且相互作用勢能始終為0，表明WGYGWNGY競爭性結(jié)合Gal10 蛋白，結(jié)合效果優(yōu)于溶晶抗體1D11。因此，WGYGWNGY被認為是與Gal10蛋白具有高親和力的溶晶抗體1D11仿生多肽抑制劑。

圖6 Gal10蛋白、WGYGWNGY與溶晶抗體1D11相互作用情況Fig.6 Molecular interactions of Gal10 protein,WGYGWNGY and antibody 1D11

3 結(jié)論

(1)通過MD 模擬和MM-PBSA 自由能解析溶晶抗體1D11 和Gal10 蛋白的相互作用細節(jié)，確定二者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基并藉此構(gòu)建多肽抑制劑親和模型，特征序列為WXYXXNXY(X 代表20 種常見氨基酸的任意一種)，通過氨基酸定位方法建立多肽抑制劑庫。

(2)在分子對接篩選、RMSD比較、構(gòu)象比對分析中，WGYGWNGY抑制劑EVINA=-7.8 kcal·mol-1，RMSD值為0.49 nm，構(gòu)象比對顯示結(jié)合位點準(zhǔn)確且構(gòu)象與溶晶抗體1D11 關(guān)鍵位點相似，表現(xiàn)出與Gal10 蛋白較好親和力。

(3)在MD模擬及抑制效果驗證中，WGYGWNGY均能在短時間內(nèi)結(jié)合在Gal10 蛋白關(guān)鍵位點處，結(jié)合情況穩(wěn)定。因此WGYGWNGY 是具有高親和性的多肽抑制劑，并為后續(xù)開發(fā)新型哮喘治療藥物奠定了基礎(chǔ)。